使用共聚焦显微镜对小鼠神经末梢中的快速钙瞬变进行成像

从一个有机硅弹性体涂层的实验室开始，该实验室包含位于共聚焦显微镜下的安全小鼠肌肉。

将肌肉浸入含有阻断肌肉收缩的抑制剂的生理溶液中。

用荧光钙染料标记的神经残端位于吸引电极内，该电极连接到电刺激器。

在神经肌肉接头处，周围神经与肌肉相连。

使用电极对神经施加电刺激。这会引发与细胞内钙染料结合的钙离子快速流入。

神经肌肉接头以激发钙染料，使其发出荧光。

然后，捕获高分辨率图像以记录周围神经末梢中的钙瞬变。

选择感兴趣的区域并测量荧光强度。

荧光强度的快速增加表明周围神经末梢的钙流入，而荧光强度的降低则反映钙清除率。

用含有 10 微摩尔 D-管箭毒碱的林格氏溶液填充灌注系统，然后打开灌注抽吸泵开始灌注。在激光扫描共聚焦显微镜或LSCM软件中，选择电生理学和采集模式以设置成像参数。在"作业"菜单设置中，选择"触发"设置以使用显微镜同步脉冲触发刺激器，并将"帧场触发输出"设置为"输出 1"通道。

1,400 赫兹的扫描频率将扫描模式转到 xyt。针孔完全打开时，缩放系数应为 6.1。确保顺序跨通双向 x 模式处于打开状态。然后将形成帧的最短时间设置为 52 毫秒，并在 20 帧时收集原始视频中的帧。将氩激光器的激发波长设置为 488 纳米，输出功率为 8%。

设置参数后，按实时模式按钮可实时预览加载染料的神经末梢。在实时模式下，搜索感兴趣区域或 ROI 以获得最佳焦点，然后将刺激器上的延迟相对于前一个值减少 2 毫秒。并运行数据采集软件，通过将每个序列从前一个序列移位两毫秒来获取 26 个序列。