利用共聚焦显微镜成像小鼠神经末梢中的快速钙瞬变

从一个含有固定小鼠肌肉的硅胶弹性体包被的实验腔室开始，将其置于共聚焦显微镜下。

将肌肉浸入含有抑制剂的生理溶液中，以阻断肌肉收缩。

用荧光钙染料标记的神经残端被置于连接至电刺激器的负压电极内。

在神经肌肉接头处，外周神经与肌肉相连。

使用电极对神经施加电刺激。这会引发钙离子快速内流，与细胞内钙染料结合。

照亮神经肌肉接头以激发钙染料，使其产生荧光。

然后，采集高分辨率图像以记录外周神经末梢中快速的钙瞬变。

选择感兴趣区域并测量荧光强度。

荧光强度的快速增加表明外周神经末梢的钙离子内流，而强度降低则反映钙离子清除。

用含有10微摩尔D-筒箭毒碱的任氏液填充灌流系统，并打开灌流吸引泵以开始灌流。在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）软件中，选择电生理和采集模式以设置成像参数。在任务菜单设置中，选择触发设置，通过显微镜同步脉冲触发刺激器，并将帧场触发输出设置为OUT 1通道。

将扫描模式设置为xyt，扫描频率为1,400赫兹。放大倍数应为6.1，针孔完全打开。确保启用逐行双向x模式。然后将生成单帧的最短时间设为52毫秒，并以20帧采集原始视频帧。将氩激光的激发波长设为488纳米，输出功率为8%。

参数设置完成后，按下“实时模式”按钮，以获取染料标记的神经末梢的实时预览图像。在实时模式下，寻找感兴趣的区域（ROI），以获得最佳焦距，然后将刺激器的延迟时间相对于前一次数值减少2毫秒。随后运行数据采集软件，通过每次序列相对于前一序列延迟2毫秒的方式，共采集26组序列。