片上的无透镜荧光显微镜

该程序的总体目标是展示一种用于在超宽视场上对荧光物体进行成像的无透镜片上荧光显微镜平台。为此，将薄吸收滤光片和光纤面板轻轻放置在光电传感器阵列或 CCDC 苔藓的顶部，然后将微流体芯片放置在面板顶部。接下来，通过使用折射率匹配油将棱镜与微芯片组装在一起。

荧光引用是通过菱形棱柱的侧面实现的，全息照明是通过同一棱柱的顶部刻面完成的。最终，通过数字算法对原始图像进行解码，可以从采集的荧光图像中获得高分辨率的显微图像。如果需要，可以使用定制的开发界面对解码的荧光对象进行自动计数。

片上镜头。成像通常旨在用更简单、更紧凑的设计取代笨重的基于镜头的光学显微镜。这个新兴的技术平台有可能通过新颖的理论和数字重建算法的帮助，消除对笨重和昂贵的吸引力组件的需求。

片上成像平台上的镜头列表包括多个光学元件，包括数字传感器阵列、非相干照明源、棱镜、吸收滤光片和光纤面板或光纤锥度。在这个平台中，可以使用不同类型的传感器阵列来检测来自目标微物体的荧光信号。在本视频中，将使用电荷耦合器件，使用非相干光源（例如简单的发光二极管）进行荧光激发。

并行使用两种不同的激发滤波方法来创建所需的暗场背景，如下图所示。首先，使用玻璃棱镜或玻璃半球在承载感兴趣样品的微流体芯片的底面产生全内反射或 TIR。与此同时，使用廉价的吸收滤光片来去除每周不遵守 TIR 过程的散射激发光。

使用这两种机制成功抑制激发后，在检测器平面上仅获得样品的荧光发射。尽管检测数值孔径如此之大，但传感器阵列上的原始荧光点变得相当宽，以便设计和更好地控制该荧光信号的空间扩散。光纤面板将放置在物体和传感器平面之间，作为常规面板的替代品。

锥形光纤面板的顶部面光纤电缆密度明显大于底部面的光缆密度，可通过放大倍率进行更高分辨率的成像。该平台中使用的微流体芯片是使用放置在载玻片上的聚二甲基 Sloane 壁制造的，以创建片上成像所需的微通道，以开始组装无地片上成像平台。首先，使用真空笔取下光电传感器阵列的盖玻片，在检测器有效区域的顶部轻轻放置一个薄的吸收滤光片。

将光纤面板放在此吸收滤光片的顶部。然后将制造的微流体芯片直接放在光纤阵列的顶部。接下来，在微流体芯片上方组装一个玻璃棱镜，使用折射率匹配油，使界面的折射率与玻璃的折射率相匹配。

通过使用 FC 连接器将光源连接到光纤电缆。此过程最困难的方面之一是组件的对齐。仔细对齐组件之间的距离、照明的位置和角度。

最后，将侧照式光纤移近棱镜并调整其角度，以确保在与微流控芯片相对应的玻璃空气界面处发生全内反射。可以使用此片上平台对底部基质、各种细胞或小动物模型进行成像，但出于本演示的目的，将对白细胞进行成像。要用荧光染料标记白细胞，首先将约 100 μL 全血与约 1 mL 红细胞上升缓冲液混合，在室温下孵育约 3 分钟，然后将 Lies 血溶液离心。

使用微量移液器去除顶层后，将沉淀层重悬于磷酸盐缓冲盐水中，用荧光染料标记细胞的核酸，将 SYTO 16 添加到复苏悬浮液中，然后在室温下避光孵育样品约 30 分钟。30 分钟后，离心标记的样品。去除 supinate 以减少由于未结合染料的荧光发射引起的背景噪声。

Reese 在大约 5 毫升的 PBS 中弯曲了白细胞沉淀层。样品现在已准备好加载到微流体芯片中，用于无晶状体片上荧光成像。在对白细胞进行成像之前，必须使用荧光微珠校准成像平台。

使用去离子水和原始微珠溶液制备稀释的微珠样品。使用锋利的针头注射器。将此初始样品从 PDMS 壁的一侧注入微流体芯片中。

组装组件以实现片上荧光成像后，通过计算机使用定制开发的实验室视图界面获取荧光珠的原始图像。确保检查整个视野中至少有 20 个分离的荧光珠图像。保存校准数据，稍后将用于校准和提取无透镜荧光显微镜平台的点扩散函数。

取出含有荧光珠样品的微流体芯片，并从该芯片上拆下棱镜。将先前制备的白细胞样品从 PDMS 壁的一侧注射到另一个未使用的微流体芯片中。A 使用相同的实验条件再次组装组件，尤其是在距离和激发功率方面。

使用定制的实验室视图采集白细胞的原始图像，其软件参数与荧光微珠相同。然后，校准数据和原始白细胞图像通过数字处理在 MATLAB 中创建更高分辨率的图像。此处显示了含有 4 微米和 10 微米绿色荧光颗粒的混合物的宽视场荧光片上成像的代表性结果，用于比较目的，10 倍显微镜。

还提供了客观图像，这与所示的镜头荧光较少的图像非常吻合。接下来，对含有 10 微米绿色和 10 微米红色荧光颗粒的混合物进行宽视场透镜、较少荧光成像的结果。无透镜荧光图像与相同样品的 10 倍显微镜物镜图像提供了不错的匹配。

该图提供了 Lucy Richardson 反卷积和基于解码算法的压缩采样对各种 10 微米磁珠对成像的性能比较。顶行显示了镜头较少的原始荧光图像，其中插图显示了使用 10 倍物镜所需的相同颗粒的显微镜比较。中行展示了压缩解码结果，而底行说明了 Lucy Richardson 反卷积结果 DDCS 和 DLR 分别指的是中心到中心的距离和显微镜图像、CS 解码的镜头图像和 LR de 卷积的无镜头图像。

接下来，说明了镜头、荧光较少的原始图像的数字处理。使用基于压缩采样的算法，通过解析紧密排列的 2 微米直径的微珠对来实现小于 4 微米的空间分辨率。插图显示了 40 倍显微镜物镜比较，与解码的荧光图像非常吻合。

这里 D 是指显微镜图像中的中心到中心的距离。而 DCS 是指 CS 解码镜头中的中心到中心距离，但荧光图像较少。该图显示了荧光标记的白细胞的无晶状体成像结果。

使用基于 CS 的解码器快速解码无原始镜头图像，这与使用 10 x 物镜采集的相同样品的传统显微镜图像非常吻合。除了成像（如果需要）之外，还可以使用定制开发的界面对解码的荧光对象进行自动计数，用于片上细胞术应用。此处所示的是 MATLAB 中定制设计的自动荧光对象计数界面。我们刚刚演示了在 8 平方厘米的视野中对标记细胞和微跳动进行无地荧光显微镜检查的程序。

这样将船舶成像平台与后面的快速压缩解码器进行了对比。对于高通量细胞术、微量稀有分析和真实细胞研究应用，它将是相当可变的。