Name: 表达GFP -肌动蛋白的内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习利用GFP-肌动蛋白成像技术实时观察活体内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的动态变化，通过延时成像分析细胞突起距离、持续时间和速度，深入理解内皮细胞通透性的调控机制。

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GFP-β-肌动蛋白质粒由路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特分校病理学系的Wayne Orr博士慷慨提供，并在路易斯安那州立大学健康科学中心-新奥尔良分校药理学系Becky Worthylake博士的实验室中进行了扩增。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（P20 RR-018766）和美国心脏协会（05835386N）资助项目的资助。

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</ol>

无利益冲突声明。

在活的内皮细胞中对GFP-肌动蛋白进行成像，可详细分析肌动蛋白细胞骨架在炎症刺激下的动态变化。该方法还可用于进一步研究既往发现的细胞骨架在剪切应力等物理力作用下的重构现象11。此外，该方法能够详细评估肌动蛋白细胞骨架动态变化对多种内皮细胞活动的贡献，包括细胞迁移、有丝分裂、细胞间连接的形成与连接成熟，以及屏障功能的维持。
在所示数据中，可以观察到内皮细胞肌动蛋白细胞骨架在凝血酶处理前后的变化。在非融合和融合的内皮细胞单层中，均可观察到细胞边缘各处的局部片状伪足随时间推移而形成并回缩。凝血酶处理短暂中断了片状伪足的形成与动态更新。凝血酶还导致细胞发生轻微收缩，这与先前报道一致，即凝血酶可诱导内皮细胞中肌动蛋白应力纤维的形成，并增加向心性张力12-14。然而，通过此类活细胞成像研究，现在可以确定应力纤维的来源。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，大多数应力纤维起源于细胞周边区域，形态类似于迁移细胞中的横向弓状纤维8, 9。与使用固定细胞的方法相比，该方法的另一优势在于可在同一细胞中定量分析凝血酶处理前后应力纤维的数量，从而消除实验组之间的选择偏倚。
通过本方案，我们评估细胞边缘和肌动蛋白应力纤维的动态运动。为了理解内皮细胞中肌动蛋白单体的动力学，可采用更先进的技术，如光漂白后荧光恢复（FRAP）或荧光斑点显微技术（FSM）15, 16。此外，由于微血管内皮细胞可能更能代表微血管屏障功能的理想模型，因此优化转染方案以在微血管内皮细胞中高效表达GFP-肌动蛋白，是未来合理的研究方向。
总之，对表达GFP-肌动蛋白的活内皮细胞进行成像，是研究内皮细胞肌动蛋白细胞骨架如何响应各种刺激的有力工具。利用紧密融合的内皮单层细胞开展的研究，将有助于阐明富含肌动蛋白的片状伪足和横向弧状应力纤维等动态结构在内皮屏障功能中的作用。此外，对表达GFP-肌动蛋白或其他可标记其他亚细胞结构的融合蛋白的内皮细胞进行活细胞成像，将提供详细的时间-空间信息，有助于理解决定屏障完整性的信号转导和结构机制。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. Ringer 5x 储备液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0420-3</td><td>35 g</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>JT Baker</td><td>3040</td><td>1.75 g</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td>1.47 g</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>1.44 g</td></tr><tr><td>无菌过滤水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>加至 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4&amp;#x00B0;C 保存</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. MOPS 缓冲液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td>125.6 g</td></tr><tr><td>无菌过滤水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>加至 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4&amp;#x00B0;C 保存</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. 白蛋白生理盐溶液（APSS）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ringer 储备液（5x）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>200 mL </td></tr><tr><td>MOPS 缓冲液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>5 mL </td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9638</td><td>0.168 g</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>0.22 g</td></tr><tr><td>EDTA 钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td>0.0074 g</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>0.901 g</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>10856</td><td>10 g</td></tr><tr><td>无菌过滤水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>加至 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">在 37&amp;#x00B0;C 下调节 pH 至 7.4，然后经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4&amp;#x00B0;C 保存。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. 0.9% 生理盐水&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0420-3</td><td>9 g</td></tr><tr><td>无菌过滤水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>加至 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4&amp;#x00B0;C 保存</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. 1.5% 明胶溶液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>猪皮来源明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>15 g</td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>加至 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">将溶液加热至 37&amp;#x00B0;C 以充分溶解明胶。保持温热状态下经无菌过滤后分装至已灭菌的瓶中，于 4&amp;#x00B0;C 保存</td></tr></tbody></table>

表达gfp-肌动蛋白的活内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的研究

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

微血管内皮在调控液体和溶质通透性方面发挥着重要的选择性屏障作用。内皮细胞之间的黏附连接调节内皮通透性，许多研究表明，肌动蛋白细胞骨架在维持连接完整性方面具有重要作用1-5。皮层肌动蛋白环被认为对维持稳定的细胞连接至关重要1, 2, 4, 5。相反，肌动蛋白应力纤维被认为在内皮细胞内产生向心张力，从而削弱细胞连接2-5。这些理论大多基于以下研究：用已知可增加内皮通透性的炎性介质处理内皮细胞，随后固定细胞并标记F-肌动蛋白以进行显微观察。然而，这些研究对肌动蛋白细胞骨架作用的理解非常有限，因为固定细胞的图像仅提供某一时间点的静态画面，无法反映肌动蛋白结构的动态变化过程5。
活细胞成像技术可将肌动蛋白细胞骨架的动态特性纳入内皮屏障完整性的机制研究中。该方法的主要优势在于，可在同一组活细胞中分别于处理前后评估各种炎症刺激对内皮细胞中肌动蛋白结构的影响，从而避免在观察固定样本时可能产生的偏差。将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）转染表达GFP-β-actin的质粒，并在玻璃盖玻片上培养至完全汇合。在加入可诱导内皮屏障完整性发生时序性变化的炎症介质前后，分别采集汇合HUEVC中GFP-肌动蛋白的时间序列图像。这些研究可实现对肌动蛋白细胞骨架在内皮屏障破坏与恢复过程中所发生的一系列动态变化的直观观察。
我们的结果一致显示内皮细胞中局部富含肌动蛋白的片状伪足的形成与周转。同时可观察到肌动蛋白应力纤维的形成与运动。通过明场图像分析，可记录炎症刺激处理前后局部片状伪足形成与周转频率的变化。这些研究为内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的动态特性提供了重要信息，有助于发现此前未知的、对维持内皮屏障完整性至关重要的分子机制。

表达GFP-肌动蛋白的活内皮细胞的显微成像可用来表征细胞骨架结构的动态变化。与使用固定样本的技术不同，该方法可在同一细胞中详细评估在不同物理、药物或炎症刺激之前、期间和之后肌动蛋白细胞骨架随时间发生的变化。

表达GFP-肌动蛋白的活内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的研究

微血管内皮在作为液体和溶质的选择性通透屏障方面发挥着重要作用。内皮细胞之间的黏附连接……

本实验的目的是观察活体血管内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的动态变化。首先，将人脐静脉内皮细胞转染表达GFP-β-actin的质粒，接种于盖玻片上，并培养至融合。随后，将盖玻片置于带有加热载物台和白蛋白生理灌注液的活细胞成像培养皿中进行观察。最后一步是通过药理学试剂处理前后的时间序列图像采集，对选定的细胞区域进行数据获取。利用Image J等成像软件进行和声图分析，可深入了解局部片状伪足的突出情况，例如突出的距离、时间、速度，以及随时间变化的肌动蛋白纤维运动情况。与免疫荧光成像等现有方法相比，该技术的主要优势在于活细胞成像能够将肌动蛋白细胞骨架的动态特性纳入内皮通透性调控机制的研究之中。固定染色细胞仅代表某一时间点的静态图像，无法提供炎症介质处理前后细胞活动及细胞骨架动态的详细信息。在生物安全柜中，用70%乙醇对盖玻片进行两分钟的消毒，随后将其置于空气中晾干。将每片盖玻片放入10厘米的培养皿中，并在其中心加入300微升温热的明胶溶液，注意不要接触盖玻片边缘。五分钟后，吸去液体。现在用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 收获融合的人脐静脉内皮细胞或 VE 细胞。计数细胞，并通过离心进行收集。尽可能吸除上清培养基，用于与 VE 核效应子试剂盒进行转染反应。将细胞沉淀重悬于基础核效应溶液中，并加入0.2至2微克的GFP-β-肌动蛋白载体质粒。取100微升细胞悬液转移至核效应qve中。轻敲盖好的vete数次，确保Q vet底部与转染样品之间无气泡。将Q VET放入核效应子二号装置中，使用核效应子试剂盒中的移液管，将500 µL预温的EGM-2 MV培养基转移至qve中，运行程序A 0 3 4。然后将混合物转移回微量离心管中，孵育15分钟。轻柔混悬转染后的VE细胞悬液一次，并将300 µL悬液接种到明胶包被的盖玻片上，避免接触边缘。然后孵育1至4小时。观察转染的细胞，以确认其已贴附于盖玻片上。随后向培养板中加入10毫升EGM-2 MV培养基，并继续孵育以进行GFP表达。首先，将白蛋白生理盐水溶液或PSS加入重力流动系统，并连接至管式加热器。然后调节流量调节器，使流速达到约40毫升/小时。接着用棉签关闭停止旋塞，以停止流动。在金刚石浴底面外缘涂抹真空脂。现在从培养箱中取出转染后的培养物。用镊子轻轻提起盖玻片。然后使用无尘纸吸去底部载玻片上多余的EGM-2 MV培养基，将细胞面朝上放置。将钻石浴盖在盖玻片上以形成一个腔室。迅速将该腔室放入载物台加热器中。拧紧腔室上的夹子，并从培养板中吸取约一毫升 EGM-2 MV 培养基加入腔室内。然后将真空管路连接到腔室左侧的固定架上，将串联加热器的 A PSS 管路接入腔室右侧的通道。接着打开真空泵，开启 A PSS 管路，使灌流液流经转染后的细胞。同时将管路加热器开启并设置为 37 摄氏度。接着，将加热载物台的热敏电阻探头置于浴槽边缘处，并将载物台加热器开启并设置为 37 摄氏度。为去除残留的 EGM-2 MV 培养基及沉积物，使用浸有 70% 乙醇的无尘纸小心擦拭盖玻片的底面，随后再用干燥的无尘纸擦拭。将转染后的 HU 细胞平衡 30 分钟。锁定视野。聚焦于待研究的培养细胞选定区域。根据细胞中GFP Act信号强度，将相机曝光时间设置在0.5至2秒之间。同时设置实验的时间间隔和持续时间。现在关闭室内灯光，拍摄单张图像以评估设置效果。在需要时，捕获延时成像序列并监控所拍摄的图像。在典型实验方案中，加入测试试剂前需采集20至30分钟的基线图像，随后继续采集0.5至4小时的额外图像。最后，如随文所述，通过CH图分析评估片状伪足的突出距离、持续性和速度。在典型实验中，GFP标记的肌动蛋白在转染的血管内皮细胞（VE）中以随机方式表达，转染效率超过50%。这些每分钟采集一次的图像捕捉到了整个细胞质中的GFP标记肌动蛋白，以及丝状结构和沿细胞边缘局部伸出的片状伪足。通过延时成像序列对细胞突起的距离持续性和移动速度进行量化分析。采用chm图分析方法时，首先大致垂直于细胞边缘绘制一条单像素线。从延时成像序列的每幅图像中提取该区域，以生成该区域随时间变化的拼接图，或在此处生成钟形图。在钟形图中，从左至右的视角下，细胞边缘的凸起表现为向上的移动。当一条线叠加在某个凸起的边缘上时，可采集与该线相关的像素数据，以量化凸起的动力学特征。钟形图中凸起的总数可用于估算凸起频率。该分析描述了在细胞周边形成并朝向细胞中心移动的应力纤维，最终这些纤维在细胞中心处解聚。在差时干涉（chio）图像中，应力纤维表现为细胞质区域内的连续线条，通常向右下方朝细胞中心移动。当纤维在原始差时干涉图像中难以辨识时，可使用非锐化掩模滤波器增强图像清晰度，所绘制的沿应力纤维的线条有助于利用测量功能收集像素数据。或者，也可沿所识别应力纤维的起始至终止位置绘制线条，以获取该纤维被观察期间的像素数据的质心平均值。本演示介绍了如何使用 Image J 等软件，通过图谱分析对延时成像数据集进行分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用转染内皮细胞的活细胞成像技术，研究炎症介质刺激下肌动蛋白细胞骨架的动态变化。

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