Name: 从人类毛囊神经嵴干细胞的分离和培养的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学习从人类头皮组织中分离和培养神经嵴干细胞的方法。本方案通过酶解消化、流式细胞术分选CD271/HNK1双阳性细胞，成功获得神经球形成能力的多能干细胞，为再生医学研究提供可靠的细胞来源。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 R01AR054593 和 R01AR054593-S1，授予 Xu。

1. 组织培养板的准备
<ol>
 <li>用足量的多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine, PDL）包被每个孔，确保覆盖孔底。将培养板置于超净台中晾干。</li>
 <li>待孔内完全干燥后，用无菌水冲洗并吸除液体，再次将培养板置于超净台中晾干。</li>
 <li>干燥后，加入纤连蛋白（fibronectin）进行包被（该溶液为纤连蛋白在Biowhittaker水中于37 °C过夜溶解，浓度为6 ml溶液中含1 mg纤连蛋白）。</li>
 <li>在纤连蛋白干燥前，向孔中加入NCSC培养基[95 ml DMEM/F12、1 ml 青霉素/链霉素（P/S）、1 ml N2、2 ml B27、100 μl 巯基乙醇（2ME；50 mM 储液）、bFGF（20 ng/ml 培养基）、IGF-1（20 ng/ml 培养基）和 EGF（20 ng/ml 培养基）]。</li>
</ol>
2. 从人头皮中提取毛囊细胞
<ol>
 <li>在开始分离神经嵴干细胞（NCSCs）的操作之前，需要准备好相应的培养基和试剂（参见 表1).</li>
 <li>从面部拉皮手术获取的新鲜成年活体人头皮皮肤或胎儿头皮组织，用含青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液冲洗。</li>
 <li>皮肤随后被转移至50 ml离心管中，加入含Dispase（10 mg/ml）的DMEM，4℃过夜孵育 4 °C孵育2-4小时于 37 °C 同样有效。皮肤组织的宽度应不超过1 cm，以利于酶的渗透。</li>
 <li>将皮肤转移至无菌培养皿中；通过夹住靠近皮肤表面的毛干，用力且平稳地拔除皮肤上的每一根毛发。毛囊呈现生长期（anagen）形态，图1A) 或休止期（telogen）图1B).</li>
 <li>将分离的卵泡片段在含0.05%胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen）的溶液中于室温下振荡孵育15–20分钟，期间定期摇动；加入4 ml含10%胎牛血清的DMEM终止反应。卵泡上皮经胰蛋白酶消化后，过滤 40 μm 过滤以获得含有不同大小和形状细胞的单细胞悬液。</li>
 <li>200 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，用含 2% 血清（FBS）的 1 ml PBS 重悬。</li>
 <li>或者，拔下的毛囊可不经胰蛋白酶消化直接进行培养，以生成毛囊球 原位.</li>
</ol>
3. 使用流式细胞术分选分离毛囊神经嵴干细胞
<ol>
 <li>通过胰蛋白酶消化获得毛囊单细胞悬液，并在冰上避光条件下与抗CD271（APC标记）/HNK1（FITC标记）或CD271/α4整合素（PE标记）抗体孵育40分钟。</li>
 <li>在室温下以200 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
 <li>用含2%血清（FBS）的PBS重悬细胞，分选前加入碘化丙啶（PI）以排除死细胞。</li>
 <li>通过流式细胞术（FACS）进行细胞分选。收集CD271+、HNK1+双阳性细胞或CD271+、α4整合素+双阳性细胞（图2）。</li>
 <li>分选后，将CD271+、HNK1+双阳性细胞或CD271+、α4整合素+双阳性细胞接种于超低吸附培养板中，在NCSC培养基中进行培养。</li>
</ol>
4. 原代神经嵴干细胞的培养
<ol>
 <li>在超低吸附培养板中用NCSC培养基培养解离的卵泡细胞或FACS分选的细胞，每天更换培养基。</li>
 <li>每天在显微镜下观察细胞培养情况。根据供体年龄的不同，神经嵴干细胞（NCSCs）在培养数天后开始形成悬浮的小细胞团，并在2至5周内发育成结构良好的细胞球。图3A几天后，隆起区域将出现外延生长，形成结构良好的球体 原位 数周内图3B当整个毛囊在NCSC培养基中培养时。</li>
</ol>
5. 神经嵴干细胞的扩增
<ol>
 <li>用 PBS 洗涤细胞一次。</li>
 <li>加入预热至 37 °C（关键）的 accutase，于 37 °C 孵育 5–10 分钟，并定期振荡，以确保神经干细胞球体解离为单细胞（对于贴壁培养的 NCSC，将细胞与 accutase 在 37 °C 孵育 5 分钟，以确保毛囊干细胞脱落）。</li>
 <li>用 DMEM/F12 培养基在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，洗涤并离心细胞两次，以去除残留的 accutase 溶液。</li>
 <li>用 NCSC 培养基重悬细胞。</li>
 <li>对于悬浮培养，将细胞接种至超低吸附培养板中；对于贴壁培养，将细胞接种至预处理的组织培养板中。</li>
</ol>
6. 代表性结果
NCSC培养基足以在无需饲养层细胞的情况下维持hNCSCs处于未分化状态。角质形成细胞在此培养基中无法增殖并逐渐死亡。某些小的圆形细胞将在3至5天后开始增殖，并在悬浮状态下形成小的细胞聚集体。这些漂浮的聚集体逐渐增大，形成三维球状结构，我们称之为毛囊球（图3A）。若将NCSCs培养在包被的培养皿中，则细胞会贴壁生长，不会形成任何球状结构。贴壁生长的NCSCs增殖速度比悬浮培养的细胞更快。形成球状结构或贴壁生长的干细胞均表达NCSCs标志物。当完整毛囊进行培养时，球状结构会在对应于隆突区的区域形成（图3B）。
<img alt="纤维结构分析的显微镜图像，显示结晶和表面形态比较。" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 拔取的生长期（A）和休止期（B）毛囊。
 
<img alt="流式细胞术结果；CD271 与 α4 整合素以及 HNK1 散点图，细胞分析。" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. NCSCs 的 FACS 分析代表性图像。 左图：使用抗 CD271 和抗 α4 整合素抗体对细胞进行分选。右图：使用抗 CD271 和抗 HNK1 抗体对细胞进行分选。
<img alt="细胞形态学阶段；显微镜图像A和B；干细胞聚集与分化" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 毛囊球的形态学特征。 （A） 漂浮毛发球体的形态，左图：低倍镜，右图：高倍镜。 （B） 毛球的形态学 原位 在隆突区域，左图：处于休止期隆突的毛囊球；右图：处于生长期毛囊隆突区域的毛囊球。

<ol><li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate%3A+implications+on+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li>
<li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retaining+cells+reside+in+the+bulge+area+of+pilosebaceous+unit%3A+implications+for+follicular+stem+cells%2C+hair+cycle%2C+and+skin+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.</a> Cell. 61, 1329-1337 (1990).</li>
<li>Tanimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+stem+cells+provide+a+functional+niche+for+melanocyte+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+novel+population+of+multipotent+adult+stem+cells+from+human+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles.</a> Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).</li>
<li>Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+with+neural+crest+characteristics+derived+from+the+bulge+region+of+cultured+human+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles.</a> J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).</li>
<li>Wong, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest-derived+cells+with+stem+cell+features+can+be+traced+back+to+multiple+lineages+in+the+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin.</a> J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li>
<li>Amoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+hair+follicle+stem+cells+form+Schwann+cells+that+support+repair+of+severed+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).</li>
<li>Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell+grafts+as+therapies+for+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease.</a> Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).</li>
<li>McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+precursors+generate+myelinating+Schwann+cells+for+the+injured+and+dysmyelinated+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system.</a> J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).</li>
<li>LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeDouarin%2C+NM+%22The+Neural+Crest%22">The Neural Crest</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).</li>
<li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li>
<li>Roh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-potentiality+of+a+new+immortalized+epithelial+stem+cell+line+derived+from+human+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

所述的细胞分离与培养方法具有良好的可重复性和稳健性。我们已从数十名不同年龄段的个体中成功分离出神经嵴干细胞（NCSCs）。尽管最好在组织获取后立即进行处理，但我们发现头皮组织可在冰上用培养基保存过夜运输，对细胞活力的影响极小。
在毛囊分离过程中，必须使用抗生素处理头皮组织，并采用无菌技术，以避免潜在的微生物污染。废弃的面部拉皮手术皮肤或胎儿头皮组织可获得数百个有活力的毛囊，通常仅需数天即可获得足够的组织用于流式细胞分选（FACS）或其他后续实验。头皮组织穿刺活检通常获得的细胞数量有限，需要额外培养组织以获得足够数量的细胞用于后续实验。
胚胎期神经嵴干细胞（NCSCs）可分化为体内多种不同类型的细胞11，而毛囊来源的神经嵴干细胞似乎也具有广泛的分化潜能。毛囊隆突是多种类型干细胞的微环境3,12。Lyle 及其同事已证实可从毛囊隆突中分离出人类上皮干细胞，这些细胞在上皮细胞谱系中具有多向分化潜能13。黑色素细胞前体细胞也存在于毛囊隆突中3。因此...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-32</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0026</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>IGF-I</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>291-G1-050</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表1.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

从人毛囊中分离和培养神经嵴干细胞

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

毛囊经历终生生长，毛发周期是一个由干细胞增殖与静息精确调控的过程。毛囊隆突是成体干细胞特征明确的微环境。1外根鞘的这一区段含有多种不同类型的干细胞，包括表皮干细胞2，黑色素细胞干细胞3 以及类似神经嵴的干细胞4-7毛囊是获取多种人类干细胞的便捷且丰富的来源。我们及其他研究者已从人类胎儿和成体毛囊中分离出神经嵴干细胞（NCSCs）。4,5这些人类干细胞是标记保留细胞，能够通过不对称细胞分裂进行自我更新 体外表达未成熟神经嵴细胞标志物，但不表达分化标志物。我们的表达谱分析研究表明，它们与小鼠皮肤未成熟神经嵴细胞具有相似的基因表达模式。它们具有克隆多能性，可分化为肌源性、黑色素细胞和神经元细胞系 体外 单克隆单细胞培养。分化后的细胞不仅获得谱系特异性标志物，还表现出相应的功能 离体 条件下。此外，这些神经嵴干细胞（NCSCs）具有向间充质谱系分化的潜能。分化得到的神经元细胞可在小鼠脑内长期存活，并维持神经元分化标志物的表达。已有研究表明，毛囊来源的NCSCs可促进神经再生，在脊髓横断损伤后移植这些干细胞可改善小鼠的运动功能。8此外，外周神经已通过干细胞移植进行修复9，并在坐骨神经受压部位附近植入皮肤来源的前体细胞已实现再髓鞘化10因此，毛囊/皮肤来源的神经嵴干细胞在临床前模型中已展现出用于再生治疗的良好前景。
体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）在再生医学领域展现出巨大潜力。然而，iPS细胞仍存在诸多问题，尤其是原癌基因/病毒整合的长期影响以及多能干细胞潜在的致瘤性尚未得到充分解决。在iPS细胞能够应用于再生医学之前，仍需克服许多障碍。相比之下，成体干细胞已被证实具有良好的安全性，并已在临床上应用多年，例如骨髓移植，已有众多患者从中获益。自体成体干细胞仍是移植治疗的首选细胞类型。因此，人体皮肤/毛囊中易于获取且可扩增的成体干细胞是再生医学的重要细胞来源。

本文介绍了一种从人类毛囊中分离和培养神经嵴干细胞的可靠方案。

毛囊经历终生生长，毛发周期是一个由干细胞增殖与静息精确调控的过程。毛囊隆突区是……

本实验的总体目标是从人头皮组织中分离并培养原代神经嵴干细胞（N CSCs）。首先将人头皮皮肤切割成宽度为1厘米的条状，置于含有dispase的培养基中孵育。随后将皮肤转移至新鲜培养基中，并拔除毛囊。该实验步骤的第二步是用胰蛋白酶处理毛囊，并获得单细胞悬液。最后一步是通过流式细胞术分选CD271与HNK-1双阳性神经嵴干细胞，并将其接种至培养板中。最终利用相差显微镜观察神经球的形成与生长情况。该方法的演示至关重要，因为提取和分离健康毛囊的各个步骤较难掌握，其原因在于在显微镜下解剖皮肤及毛囊组织极为困难。为准备培养干细胞，需用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）包被六孔板每个孔的底部，并在超净台中让其自然干燥。待孔内液体完全干燥后，用无菌水冲洗各孔并吸除水分，随后再次让其干燥。接着，用浓度为 0.17 毫克/毫升的纤连蛋白（fibronectin）溶液对孔板进行包被。然后，在纤连蛋白于NCSC培养基的培养板中干燥之前，准备好以下培养基和试剂。97% D-M-E-M-F 12、2% B 27添加剂、1%以及两种添加剂B-F-G-F、E-G-F、IGF-1，并将其溶解。从面部提拉手术中收集新鲜的成年成人头皮皮肤，或收集胎儿头皮组织，用含有青霉素和链霉素的PBS洗涤。将皮肤转移至50毫升离心管中，加入含有10毫克/毫升DIS的DMEM，在37摄氏度孵育2至4小时，或在4摄氏度过夜。接着，将皮肤转移至无菌培养皿中，通过夹住靠近皮肤表面的毛干并用力平稳地拔除，去除皮肤上的毛发。毛囊将呈现抗原或组织形态，将分离的毛囊片段在室温下用含EDTA的0.05%胰蛋白酶孵育15至20分钟，期间偶尔振荡。然后加入4 mL含10% FBS的DMEM以终止反应。接着将卵泡上皮细胞通过40 µm滤膜，获得含有不同大小和形状细胞的单细胞悬液。然后以200 × g离心5分钟。小心弃去上清液 S，将沉淀重悬于 1 毫升含 2% FBS 的 PBS 中。为利用流式细胞术分离 N CSCs，首先在冰上避光孵育 40 分钟，使用 PC 偶联的 CD271、FE C 偶联的 HNK-1 或 PE 偶联的 α4 整合素抗体对细胞进行标记；随后在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，吸走上清液。将细胞重悬于含有 2% FBS 和 2 微克/毫升碘化丙啶的 PBS 中，以排除死细胞。通过流式细胞术进行细胞分选，收集CD271高表达与H/Kone双阳性或CD271与α4整合素双阳性细胞进行培养。将细胞接种于超低吸附培养板中，使用NCSC培养基，每天更换一次培养基。每天在显微镜下观察细胞培养情况。几天后，NCSC 将开始形成漂浮的小聚集体，在培养 2 至 5 周后形成结构良好的球体，具体时间取决于供体的年龄。当完整毛囊在 NCSC 培养基中培养时，数天内隆突区域会出现外生生长，数周内在原位形成结构良好的球体。为扩增 NCSC 培养物，用预热至 37 摄氏度的 PBS 洗涤细胞一次，并将胰蛋白酶-EDTA 预热两次至 37 摄氏度。然后将细胞置于七到十五分钟，使毛囊干细胞脱落。为终止胰蛋白酶作用，加入含10%胎牛血清的DMEM，轻轻吹打混匀以分散细胞。随后在200 × g下离心五分钟。将细胞重悬于NCSC培养基中，并在纤维连接蛋白包被的培养板上于37摄氏度培养。NCSC培养基足以维持人源NCSC处于未分化状态。角质形成细胞在无饲养层细胞的情况下，无法增殖并会逐渐在培养基中死亡。一些小的圆形细胞会增殖并在悬浮状态下形成小的细胞团。经过三至五天后，这些悬浮的细胞团逐渐增大，形成三维球状结构，称为毛发球（hair spheres）。当培养编码的培养板时，神经嵴干细胞（N CSCs）会贴附于表面，并且比悬浮培养中形成球体的细胞生长更快，包括形成球体的细胞和贴壁生长的干细胞。当整个毛囊进行培养时，神经嵴干细胞表达标志物，并在对应于隆突区域的位置形成球体。观看视频后，您应能充分理解如何分离和培养这些细胞。来自人头皮组织的原代神经干细胞。

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