利用比率型指示剂对原代神经元中的线粒体氧化还原状态进行成像

在装有成像缓冲液的成像腔中，取一块载有基因修饰原代神经元的盖玻片。

这些细胞在线粒体基质中表达一种基于荧光蛋白的氧化还原指示剂。

将培养室置于荧光显微镜下，在可见光下识别细胞，然后切换至荧光成像。

应用两种激发波长来刺激指示剂并测量荧光发射。

这些波长下的荧光强度比值反映了线粒体的氧化状态。

加入NMDA以激活细胞的NMDA受体，引起细胞内钙离子内流。

这种增加会触发线粒体摄取钙离子，从而诱导活性氧（ROS）的产生以及线粒体

氧化。

ROS 氧化指示剂，改变其荧光特性，从而增强信号比率。

加入氧化剂以充分氧化指示剂，使信号比最大化。

移除缓冲液，然后加入还原剂以完全还原染料，从而最小化信号比。

利用最大和最小信号比值来校准并定量NMDA诱导的线粒体氧化。

进行活体成像时，将时间间隔设为30秒，持续时间设为25分钟。随后安装细胞，将培养腔置于显微镜载物台上，并按照之前演示的方法对细胞进行聚焦。切换至扫描模式，使用488纳米通道在实时预览中对焦并定位待成像的细胞。可选地，为增加每次记录的细胞数量，可使用多点成像功能，对每张盖玻片上的两到三个视野进行成像。

开始时间序列采集，记录五张图像，作为两分钟的基线记录。向灌流腔室中加入 500 微升三倍浓度的 NMDA 溶液，使终浓度达到 30 微摩尔，并继续记录 20 张图像，作为 10 分钟的 NMDA 反应记录。接着，向腔室中加入 500 微升四倍浓度的 DA 溶液，并再记录六张图像。吸除成像腔室中的缓冲液，替换为 1 毫升 DTT 溶液。再记录 10 张图像后，结束采集并保存图像序列。