利用相干反斯托克斯拉曼光谱成像小鼠脑组织中的髓鞘化神经元

在多孔板中取一片化学固定的鼠脑切片。

该组织含有被富含脂质的髓鞘包围的轴突。细胞体中含有由粗面内质网和核糖体构成的尼氏体。

在含有荧光尼氏染色液的透化溶液中孵育。该溶液可透化细胞膜，使染料结合尼氏体内的核糖体RNA，从而标记细胞体。

将组织置于共聚焦显微镜下，使用相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）成像系统进行观察。

将泵浦激光束和斯托克斯激光束直接同步照射到组织上，调节至激发富含脂质的髓鞘中的分子键。

引入一束探针激光束，使其与被激发的化学键相互作用，产生特异于髓鞘的反斯托克斯信号。

光电探测器捕获信号以生成特异性的髓鞘图像。

使用共聚焦成像技术捕获标记的尼氏体信号。

叠加共聚焦和CARS图像以可视化神经元结构。

按照文稿中所述方法制备组织后，对游离切片进行尼氏（Nissl）染色和抗体介质染色以显示细胞体。然后，将切片置于标准实验室摇床上，室温下孵育30分钟。在将样本移至显微镜前，打开CARS激光器并预热至少一小时。随后，通过空间重叠泵浦激光束和斯托克斯（Stokes）激光束来校准CARS激光器，并调节两束激光之间的时间延迟。

为前向CARS成像调整聚光镜光学元件和显微镜的光圈。然后调节外部反射镜系统，使空间重叠的两束激光准确对准显微镜扫描头的反射镜。为了获得最佳的前向CARS非共轭检测效果，请确保聚光镜已进行科勒照明调节。

进行免疫荧光共聚焦成像和CARS成像时，通过配备可见光激光器用于荧光成像的共聚焦显微镜，为CARS激光器安装前向和反向非扫描CARS探测器。现在，将切片置于底部带有盖玻片的培养皿中，并加入PBS以防止组织干燥。同时，使用玻璃压片使组织紧贴盖玻片。

使用图形用户界面。设置CARS和尼氏荧光共聚焦成像的图像采集参数。将样品放置在显微镜载物台上。对样品进行聚焦并采集图像。