0 次观看 • 5:18 分钟 • June 17th, 2025
取一条固定在灌流室中的瘫痪转基因斑马鱼幼鱼。
幼虫的神经丘毛细胞中表达膜定位的钙指示剂，神经丘是侧线系统的一部分，可感知水流运动。
毛细胞包含顶端的毛束和基底部的突触前区域，后者与传入神经元形成突触以传递信号。
在共聚焦显微镜下，使用低倍镜将液流移液管置于幼虫附近。
提高放大倍数以定位神经丘，将移液管重新移至其附近，并切换至
荧光成像。
输送流体脉冲以偏转毛束，打开机械转导通道，使顶端阳离子（包括钙离子）内流。
弱荧光指示剂与钙结合，导致荧光局部增强。
阳离子内流使细胞去极化，从而在基底前突触处通过电压门控通道触发钙离子内流，钙离子与指示剂结合，导致局部荧光增强。
实时观察顶端和基底钙离子动态变化。
在此步骤中，使用凝胶上样枪头将10微升神经元缓冲液回吸至一支已适当断裂的流体喷射针中。将溶液均匀地加载到枪头中，避免产生气泡。然后将针头插入连接至电动显微操作器的移液管支架中。
将灌流室放入显微镜载物台上的圆形腔室适配器中。移动电动载物台，使幼虫位于视野中心。随后旋转圆形腔室适配器，使幼虫的前后轴（A-P轴）大致与液体射流针的轨迹对齐。
使用透射光和微分干涉差显微技术，将幼虫调至焦点并置于10倍物镜下视野中央。然后升起10倍物镜。利用电动显微操作器，将液体射流针移至视野中央，使其被透射光照射，并恰好轻触神经元缓冲液。
降低10倍物镜以对幼虫进行对焦，确认其位置。将物镜对准流体喷射针。使用显微操作器在x轴和y轴方向上移动流体喷射针，直至其与幼虫的背侧平行对齐。
随后，将注意力重新集中于幼鱼。沿 z 轴方向 lowering 针头，并将其置于鱼体背侧，距离身体 1 毫米处。小心移动圆形腔室适配器，确保液流针与幼鱼的前后中线对齐。
接下来，切换至60倍水镜。确保物镜浸没在神经元缓冲液中。使用微调焦旋钮定位一个神经丘。随后，移动电动载物台，将目标神经丘置于视野中央。
将液流针尖保持在鱼体的背侧。切勿让液流针尖接触幼鱼或培养腔表面。使用显微操作器调整液流针的位置，使其距离神经丘外缘100微米。
然后将焦距向上调整至顶端毛细胞束的尖端。在此焦平面上，流体喷射针的底部应清晰对焦。将高速压力钳从手动模式设为外部模式，以接收成像软件的输入信号。通过按下归零按钮对高速压力钳进行归零，并使用设定点旋钮将静息压力调节至略微正值。使用连接在头段输出端的PSI压力计确认高速压力钳的静息输出值。
为确定刺激毛细胞束所需的压力，施加一个持续200至500毫秒、输出电压为0.125和0.25伏的测试刺激。对每次测试刺激，测量毛细胞束（动纤毛）顶端的偏转距离。选择一种能使毛细胞束移动约5微米的压力。确保动纤毛的顶端在整个过程中始终处于焦点范围内。
为获取单平面图像，请在第30帧（即3秒时）之后的80帧图像采集期间选择一种刺激进行给予。为测量机械敏感性钙反应，请聚焦于顶端纤毛束的基部并开始图像采集。为测量突触前钙反应，请聚焦于毛细胞的基部并开始图像采集。