Name: 采用TaqMan从儿童凳诺如病毒的检测和Genogrouping一步法RT-PCR技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: 学习使用TaqMan探针的一步法实时RT-PCR技术检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型。该方法经济高效，适用于临床诊断和流行病学研究。

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作者谨此感谢美国疾病控制与预防中心（CDC）国家杯状病毒实验室慷慨提供诺如病毒（NoV）的标准品和阳性对照，以及约翰斯·霍普金斯大学公共卫生学院实验室提供试剂。

1. 粪便样本
<ol>
 <li>应将粪便样本冷冻保存，以维持RNA的稳定性。制备10%粪便悬液时，取约0.1 g解冻后的粪便样本，用PBS定容至1 ml。</li>
 <li>将悬液分装为200 μl每份，以避免反复冻融。分装样本应储存于-70 °C。</li>
 <li>使用前将分装样本解冻，并在4,000 g离心10分钟。</li>
</ol>
2. 使用胍和二氧化硅进行提取的二氧化硅颗粒的制备
<ol>
 <li>在室温下，将30 g二氧化硅悬浮于dH₂O中并定容2O 至 250 mL。 </li>
 <li>沉降24小时后，用抽吸法移除215 mL上清液。加入dH2O 至 250 mL，并通过振荡使二氧化硅沉淀重新悬浮。 </li>
 <li>再过24小时后，用抽吸法除去上清液，并用盐酸（HCl）将二氧化硅悬液的pH值调节至2.0。将二氧化硅悬液分装至玻璃瓶中，进行高压灭菌。 </li>
</ol>
3. 使用胍和二氧化硅提取的L6缓冲液的制备
<ol>
 <li>在室温下，通过将 60 g 硫氰酸胍（GuSCN）和 1.3 g Triton X-100 溶解于 50 mL 0.1 M 盐酸-Tris（pH 6.4）和 11 mL 0.2 M EDTA（pH 8.0）溶液中，配制 L6 缓冲液。</li>
</ol>
4. 使用胍和二氧化硅提取的L2缓冲液的制备
<ol>
 <li>在室温下，将 180 g 硫氰酸胍（GuSCN）溶解于 150 mL 0.1 M 盐酸-Tris 缓冲液（pH 6.4）中，配制 L2 缓冲液。</li>
</ol>
5. 提取步骤
<ol>
 <li>每次提取时应包括一份诺如病毒（NoV）阳性的粪便样本作为阳性对照，以及经DEPC处理的水作为阴性对照。</li>
 <li>在微量离心管中混合以下成分：1 mL 缓冲液L6、20 μL 二氧化硅颗粒，并加入200 μL 10%粪便提取物悬液。短暂涡旋混匀后，室温放置15分钟。</li>
 <li>将悬液在6000 g离心10秒，沉淀用1 mL缓冲液L2洗涤两次，随后用70%乙醇洗涤两次，再用丙酮洗涤一次。将沉淀置于56 °C干式加热块中干燥5分钟。</li>
 <li>通过加入50 μL无RNase的dH2O使硅胶沉淀中的RNA水合。加入1 μL RNasin，通过倒置混匀试管，于56 °C孵育15分钟。</li>
 <li>在台式离心机中全速离心3分钟，收集含有RNA的上清液40 μL。</li>
 <li>使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）对提取的RNA样本进行定量，然后于-70 °C保存，最多可保存6个月。（注意： 更好地保持总RNA完整性的方法是将其转化为cDNA）。</li>
</ol>
6. 使用商业RNA QIAamp病毒RNA试剂盒的替代提取方法
完整说明详见QIAGEN试剂盒附带的手册。简要步骤如下：
<ol>
 <li>取560 μL含有载体RNA的Buffer AVL，加入1.5 mL离心管中，再加入140 μL 10%粪便悬液。短暂涡旋振荡15秒以混匀。室温孵育10分钟。</li>
 <li>向样品中加入560 μL乙醇（96–100%），短暂涡旋振荡15秒混匀，然后短暂离心。</li>
 <li>将630 μL上述溶液转移至置于2 mL收集管中的离心柱中。在6,000 g下离心1分钟；随后将离心柱转移至新的洁净2 mL离心管中。</li>
 <li>用500 μL Buffer AW1洗涤结合RNA的离心柱，在6,000 g下离心1分钟。将离心柱放入新的洁净2 mL收集管中。</li>
 <li>用500 μL Buffer AW2洗涤离心柱，在最大转速（20,000 g或14,000 rpm）下离心3分钟。</li>
 <li>将离心柱放入新的洁净1.5 mL微量离心管中，加入40 μL经DEPC处理的水，在最大转速下离心洗脱RNA。重复一次，最终获得80 μL洗脱的RNA。</li>
 <li>使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Scientific）对提取的RNA样品进行定量。随后于-70 °C保存，可保存长达6个月。（注意： 更佳的总RNA保存方法是将其反转录为cDNA）。</li>
</ol>
7. 采用特异性Taqman探针一步法实时RT-PCR检测提取RNA中的诺如病毒
仪器：StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统（Applied Biosystems）。
方法
<ol>
 <li>使用 RNase AWAY 擦拭并清洁所有工作台面、移液器和离心机，以去除任何潜在的 RNase 污染。</li>
 <li>根据表1配制诺如病毒 GI 和 GII 筛查反应主混合液。引物和 TaqMan 探针列于表2中。</li>
 <li>将 10 μL 适当的主混合液分装至每个反应管中。</li>
 <li>向相应的反应孔中加入 5 μL 未稀释的未知样本 RNA、DEPC 处理水作为阴性对照，或分别加入 GI 和 GII 阳性对照 RNA。所有样本应设重复孔。浓度分别为 300 μg/μL 和 500 μg/μL 的阳性对照和标准品由国家诺如病毒实验室疾病控制与预防中心（CDC）提供。</li>
 <li>将反应板在 6,000 g 离心 10 秒。</li>
 <li>在实验属性设置界面中，定义并选择运行的实验类型。确保试剂类型显示为 TaqMan 试剂，并选择 Pre-PCR 读数和扩增步骤。</li>
 <li>使用表3中的热循环程序运行 15 μL 反应体系。</li>
 <li>分析结果。</li>
</ol>
8. 使用常规RT-PCR和测序对诺如病毒GI和GII型进行基因分型
（本视频中未提及，因为这是一种常见且广泛使用的方法。）
仪器。采用配备 Quantitec 模板的应用生物系统公司 StepOne 和 StepOnePlus 实时 PCR 系统。
方法
<ol>
 <li>在进行基因分型之前，需通过上述筛选性RT-PCR确定样本的基因组群（GI或GII）。GI型诺如病毒（NoV）RNA必须使用GI型基因分型预混液进行扩增，GII型NoV RNA则需使用GII型基因分型预混液进行扩增。</li>
 <li>根据表4配制NoV GI和GII基因分型预混液。引物GI SKF/SKR和G2 SKF/SKR列于表5中。</li>
 <li>将适量的预混液各45 μL分装至0.2 mL反应管中。</li>
 <li>在每个阴性对照管中加入5 μL经DEPC处理的水，向相应的反应管中加入5 μL预先筛查确认为诺如病毒（GI和/或GII）RNA阳性的样本。</li>
 <li>使用表6中的热循环程序进行50 μL的PCR扩增反应。</li>
 <li>将含有至少100 ng/μL扩增衣壳区片段的PCR产物送至Macrogen公司进行纯化和测序。（地址：9700 Great Seneca Hwy. Rockville, MD 20850；每样本每轮测序费用为10美元）。</li>
</ol>
9. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="PCR扩增曲线图；循环数 vs. ΔRn；对照组与样本曲线；DNA定量；图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1展示了使用TaqMan一步法RT-PCR检测腹泻患儿粪便样本中提取的RNA时的代表性结果。阳性样本的阈值循环（Ct）设定为GI型≤Ct 37，GII型≤Ct 39。阳性对照的Ct值分别为GI型ORF1-ORF2连接区小于27，GII型小于18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="自制方法与QIAamp RNA试剂盒的对比图，显示相关性；方程 y=0.984x+0.1901。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2展示了硅基自制方法（含胍盐）与QiAmp病毒RNA试剂盒在Ct值上的直接比较。两项检测的数据点均非常接近等值线（斜率为1，截距为0）。回归分析和相关系数结果进一步证实了这一点。所有阴性对照样本经两种方法检测结果均为0。
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>主混合液</td>
 <td>终浓度</td>
 <td>体积 (μL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H2O PCR</td>
 <td> </td>
 <td>2.875</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitect RT-PCR Master Mix</td>
 <td>1x</td>
 <td>6.250</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RT Mix</td>
 <td>1x</td>
 <td>0.125</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 μM Cog R 引物</td>
 <td>1 μM</td>
 <td>0.250</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 μM Cog F 引物</td>
 <td>1 μM</td>
 <td>0.250</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 μM Ring 探针</td>
 <td>1 μM</td>
 <td>0.125/0.250*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>10.00</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 * GI 检测中每种探针使用 0.250 μL，GII 检测中每种探针使用 0.125 μL。
表1. 用于筛查GI和GII型的Qiagen Quantitect预混液 (Trujillo et al., 2006)7
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>名称</td>
 <td>基因型组</td>
 <td>用途</td>
 <td>序列 (5' 至 3')</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cog 1R</td>
 <td>GI</td>
 <td>引物</td>
 <td>CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cog 1F</td>
 <td>GI</td>
 <td>引物</td>
 <td>CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cog 2R</td>
 <td>GII</td>
 <td>引物</td>
 <td>TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cog 2F</td>
 <td>GII</td>
 <td>引物</td>
 <td>CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring 1A</td>
 <td>GI</td>
 <td>探针</td>
 <td>FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring 1B</td>
 <td>GI</td>
 <td>探针</td>
 <td>FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring2-TP</td>
 <td>GII</td>
 <td>探针</td>
 <td>FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 用于基因型I、II实时定量RT-PCR的引物和探针寡核苷酸序列（Kageyama et al., 2003）8
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>步骤</td>
 <td>温度 (°C)</td>
 <td>时间 (min)</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>50 </td>
 <td>30:00</td>
 <td>cDNA 合成</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>95</td>
 <td>15:00</td>
 <td>HotStart Taq 聚合酶激活</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>95</td>
 <td>00:15</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>60</td>
 <td>01:00</td>
 <td>45X 循环</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
表3. 一步法TaqMan实时RT-PCR的热循环程序（Trujillo et al., 2006）7
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>主混合液</td>
 <td>终浓度</td>
 <td>体积 (μL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H20 PCR</td>
 <td> </td>
 <td>29.50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5X Qiagen RT-PCR Buffer</td>
 <td>1x</td>
 <td>10.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mM dNTP Mix</td>
 <td>0.4 mM</td>
 <td>2.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>酶混合液</td>
 <td> </td>
 <td>2.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>40 U/μL RNAsin</td>
 <td>20 U/μL</td>
 <td>0.50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 μM SKF</td>
 <td>0.1 μM</td>
 <td>0.50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 μM SKR</td>
 <td>0.1 μM</td>
 <td>0.50</td>
 </tr>
 </tbody>
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>45.00</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
表4. 用于GI和GII基因分型的Qiagen One-Step RT-PCR预混液。
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>名称</td>
 <td>基因型组</td>
 <td>用途</td>
 <td>序列 (5' 至 3')</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G1SKF</td>
 <td>GI</td>
 <td>引物</td>
 <td>5'- CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G1SKR</td>
 <td>GI</td>
 <td>引物</td>
 <td>5'- CCA ACC CAR CCA TTR TAC A -'3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G2SKF</td>
 <td>GII</td>
 <td>引物</td>
 <td>5'- CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G2SKR</td>
 <td>GII</td>
 <td>引物</td>
 <td>5'- CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT- 3</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
表5. 用于扩增衣壳区C区的引物（Kojima et al., 2002）5
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>步骤</td>
 <td>温度 (°C)</td>
 <td>时间 (min)</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>60</td>
 <td>30:00</td>
 <td>cDNA 合成</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>96</td>
 <td>15:00</td>
 <td>HotStart Taq 聚合酶激活</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>94</td>
 <td>00:30</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>52</td>
 <td>01:00</td>
 <td>40X 循环</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>72</td>
 <td>00:30</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>72</td>
 <td>10:00</td>
 <td>退火</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
表6. Taqman一步法逆转录PCR的热循环程序。

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

采用我们实验室自建的经济型核酸提取方法从粪便样本中提取核酸，其结果与使用Qiagen公司的商用QIAamp病毒RNA试剂盒获得的结果相当。结合本实验室建立的TaqMan反转录PCR方法，可检测属于GI和GII基因群的多种诺如病毒（NoV）基因型。近期关于C区片段检测方案的一项报道显示其基因分型成功率为78%6。由于近年来流行的诺如病毒毒株多样性不断增加，检测成功率将取决于C区引物与待测样本病毒序列之间的匹配程度。该检测方法适用于常规诊断，因其无需扩增后产物处理步骤，从而缩短了检测周转时间7。除诊断用途外，本方案还可用于阐明诺如病毒感染的流行病学特征，对疾病公共卫生防控具有重要意义。
进行筛查性RT-PCR时，引物/探针组的阴性对照（NC）反应不应出现跨越阈值线的荧光增长曲线。若某一或多个引物/探针组的阴性对照反应出现假阳性结果，则可能发生了样本污染，此时整个实验运行应作废，并在更严格遵循操作指南的前提下重新进行。
使用美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的GI和GII阳性标准品对筛查...

<table><tbody><tr><td>异硫氰酸胍</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5631</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>VWR</td><td>14530</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp 病毒RNA小型试剂盒 (250)</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTec 探针一步法RT-PCR试剂盒 (200)</td><td>Qiagen</td><td>204443</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 一步法RT-PCR试剂盒 (200)</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td></td></tr><tr><td>Rnase抑制剂 2000单位</td><td>A. Biosystems</td><td>N808-0119</td><td>2000单位/瓶</td></tr><tr><td>无RNA酶、防粘连微量离心管</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550-100</td><td></td></tr></tbody></table>

通过taqman一步法rt-pcr检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

诺如病毒（NoVs）是全球各年龄段人群散发性急性胃肠炎暴发的首要原因，也是儿童住院的重要病因，其公共卫生影响与轮状病毒相当。诺如病毒属于RNA病毒，具有高度的遗传多样性，新毒株不断出现。目前已确认五个基因组，其中GI和GII组包含多种基因型和亚型，对人类感染最为重要。然而，这两种基因型的诊断仍存在困难，导致诊断和治疗的延误。1, 2, 3
从粪便样本中提取RNA最常用的方法是Qiagen公司的QIAamp Viral RNA商业试剂盒。该方法结合了硅胶膜的结合特性、可控制RNase并为RNA与层析柱的最佳结合提供条件的缓冲液，以及微型离心柱的快速操作优势。该方法简单、快速且可靠，操作步骤较少，具体细节由制造商提供说明。
诺如病毒是仅次于轮状病毒的腹泻常见病因。在所有关于腹泻发病机制的研究以及暴发疫情或个体腹泻病例中，都应具备诺如病毒的诊断能力。然而目前由于缺乏简便的诊断方法，诺如病毒的检测仅限于少数几个中心，这导致了诊断和治疗的延误1, 2, 3。此外，由于成本较高以及在国家之间运输腐蚀性缓冲液受到严格管制，使用商业化试剂盒会带来诸多物流问题。因此，本方案描述了一种替代性的、经济的、实验室自建的方法，该方法基于Boom et al. 原始方法4，利用二氧化硅颗粒对核酸的结合特性以及硫氰酸胍的抗核酸酶特性。
为检测和区分粪便标本中诺如病毒（NoVs）的基因群（GI 和 GII），已开发出多种针对不同靶区域的 RT-PCR 方法。目前普遍认为，采用 TaqMan 化学法的 RT-PCR 是诊断诺如病毒最理想的分子技术，因其兼具高灵敏度、高特异性、良好的重复性，以及高通量和操作简便等优势。本文所述检测方法针对诺如病毒基因组中最为保守的开放阅读框 1（ORF1）与开放阅读框 2（ORF2）交界区域，该区域是诺如病毒基因组中最保守的区域，因此最适合用于诊断。为进一步开展遗传学分析，可采用常规 RT-PCR 方法，扩增衣壳主要蛋白的高变异性 N 端壳区（C 区），所用引物最初由 Kojima 等人描述 等 5 详细描述了该方法。对常规PCR获得的PCR产物进行测序，可区分属于GI和GII基因群的基因型。

本文描述了一种一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法，用于检测儿童粪便样本中的诺如病毒分离株并进行基因组别鉴定，该方法采用针对诺如病毒基因组中最保守区域——开放读码框1（ORF1）与开放读码框2（ORF2）连接区的特异性引物和TaqMan探针。同时详细介绍了一种非商业化的、经济高效的RNA提取方法。

通过TaqMan一步法RT-PCR检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型

诺如病毒（NoVs）是全球各年龄段人群散发性急性胃肠炎暴发的首要原因，也是导致...

使用特异性TECHMAN探针通过一步法实时反转录聚合酶链式反应检测提取的RNA中的神经病毒。但今天我们将讨论神经病毒。该研究位于秘鲁利马，由当地大学和约翰斯·霍普金斯大学的研究团队共同开展。诺如病毒可能是导致腹泻被忽视最严重的病因之一。我们的研究团队发现，在导致儿童因腹泻住院的病因中，诺如病毒仅次于冠状病毒；在基于人群的腹泻发病数量方面，诺如病毒也位居第二。那么，为何诺如病毒此前未被诊断出来？原因是这是一种RNA病毒，无法进行培养，因此需要采用特殊的分子生物学方法来诊断。这些方法包括我们使用的逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），接下来将演示如何使用R-T-P-C-R方法来诊断神经病毒。我们采用实验室自建的G guine ATE方法（参考Ciag GUINE等人，1989年），从粪便样本中提取病毒RNA。该方法是商用ca amp病毒RNA试剂盒的替代方案。两种方法均基于二氧化硅颗粒对核酸的结合特性，结合胍盐类化合物（G Guad Dium Bio）的抗核酸酶特性，制备二氧化硅悬浮液用于RNA提取。为制备二氧化硅颗粒，取30克二氧化硅，加入250毫升去矿物质水，通过振荡使二氧化硅悬浮。静置沉降24小时后，吸除215毫升上清液，并加入250毫升去矿物质水进行吸滤分装，再次通过振荡使二氧化硅悬浮。再经过24小时后，通过抽吸去除上清液，并用盐酸将二氧化硅悬浮液的pH值调节至2.0。将二氧化硅悬浮液置于玻璃瓶中，并与g guin及二氧化硅一同进行高压灭菌提取。现在我们将使用前一步骤中制备的二氧化硅颗粒来提取病毒RNA。提取前将样品储存于负70摄氏度。为制备10%的粪便悬液，取约0.1克粪便，并用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）定容至1毫升，再进行提取。将低载量样品涡旋震荡五秒钟，然后以 4,000 RPM 离心 10 分钟。每个反应中加入一份神经病毒阳性粪便样本作为阳性对照，以及一个含 DEPC 处理水的微量离心管。混合以下成分：1 毫升 L6 缓冲液、20 微升已制备的二氧化硅颗粒和 200 微升粪便提取物。涡旋混匀片刻，将样品在室温下静置15分钟。离心15秒。随后用缓冲液L2洗涤沉淀物两次，再用70%乙醇洗涤两次，最后用酸溶液洗涤一次。将沉淀物置于56摄氏度的干燥加热块中干燥五分钟。加入50微升无RNA酶的蒸馏水，使硅胶沉淀中的RNA水合。加入1微升RNA酶抑制剂，涡旋混匀，于56摄氏度孵育15分钟。以最大速度离心三分钟，收集含有RNA的上清液。使用非微量检测技术对样品进行定量，并将提取的RNA在-70°C下保存，直至使用。采用市售试剂盒提取病毒RNA。现在我们将演示使用市售的 kay amp 病毒 RNA 试剂盒从粪便中提取 RNA。该试剂盒包含以下组分：硅胶 MinPin 柱、缓冲液 A、V、L、A-W1、A-W2、A-VE 以及裂解载体 RNA。简要步骤如下。取部分缓冲液A VL与载体RNA混合，涡旋振荡，将溶液转移至1.5毫升离心管中，每管加入114微升粪便悬液，并通过涡旋振荡混匀。室温孵育15分钟。对样品进行瞬时离心。向样品中加入乙醇，通过涡旋振荡混合15秒。然后短暂离心，将溶液转移至置于两个最小收集管中的离心柱中。离心。然后将离心柱放入一个新的收集管中。使用不含载体RNA的缓冲液A W1洗涤结合有RNA的离心柱，并进行离心。将离心柱置于一个洁净的2毫升收集管中，并用缓冲液洗涤离心柱。将W2离心机以全速运行，将带销柱放入干净的1.5毫升微量离心管中，并进行全速离心。使用缓冲液A VE提取RNA，并将病毒RNA在-70摄氏度保存直至使用。通过一步法实时PCR结合特异性Techman探针检测提取RNA中的神经病毒。为Geno第一组和Dina第二组配制混合液，在实验过程中将酶RT混合液置于冰上。试剂盒设置包含以下组分：PCR水、Master 2×、Dina的引物和探针。Dina第二组的Group one引物和探针。最后，在使用前将酶RT混合物H试剂涡旋混匀，加入PCR用水配制主混合液：两倍浓度的引物COG G一（正向与反向）以及探针Ring一A和一B，用于UniGroup。一组肌肉混合液及引物COG G二，用于VA正向、反向及探针。为Theo第二组的主混合液加入两环，最后向INO组的两种肌肉混合液中均加入酶Artix。涡旋混匀后，将10微升相应的肌肉混合液加入反应孔中。在另一个柜子中，向相应的反应轮中分别加入 5 µL 未稀释的 RNA、5 µL G1 和 G2 阳性对照 RNA 以及 5 µL 阴性对照。在 6,000 ×g 条件下离心去除 10 秒。在步骤一中，软件显示高级设置。在实验属性界面中，该实验被识别为诺如病毒。在目标物界面中，实验类型为“目标物的有无”。在PCR反应板中输入您希望检测的目标物名称。吉娜，第一组和第二组报告基因的荧光团FAM和淬灭基团塔马拉在样本及重复检测中的应用。输入反应板上包含的样本数量以及阳性对照和阴性对照的数量，然后选择要设置运行方法的样本或靶向方向。首先，在50摄氏度下进行逆转录，以合成互补DNA。然后将温度升至95°C以激活热启动聚合酶。在95°C下开始循环并维持一定时间，随后在60°C下进行退火与扩增的合并步骤。重复循环45次后，返回到板设置。单击“保存模板”以保存实验。单击“开始运行”。扩增曲线界面可让您在仪器运行过程中实时查看样本扩增情况，以及数据冻结后的曲线对比图。标准化的扩增荧光与循环数。在 PCR 的初始循环中，荧光信号变化很小，由此确定基线。荧光信号相对于基线的升高表明检测到了累积的目标物。应在基线附近设定一个固定的荧光阈值。CT值（循环阈值）定义为荧光信号超过该固定阈值时所对应的循环数的小数值。扩增曲线图界面可用于识别和检查异常扩增情况，例如阴性对照孔中出现荧光增强，或在预期循环数时未检测到荧光信号。试剂盒方法虽然可靠，但需要耗费大量时间和资源。本文展示了一种同样可靠的替代方法，具有成本效益，并使用国内 readily available 的试剂，避免依赖进口材料，这将最终有助于更便捷地诊断儿童胃肠炎最常见的病毒病因，并实现快速治疗。采用这种经济型的实验室自制核酸提取方法，其结果与前述方法相似。采用 Kerogen 公司的商用试剂盒，并结合本实验室开发的 TAC MAN、R-T-P-C-R 技术，可检测多种神经病毒的感染。该检测方法在常规诊断中具有实用价值，因其无需扩增后产物处理步骤，从而缩短了检测时间。除了用于诊断外，该方案还可用于阐明神经病毒性感染的流行病学特征，从而有助于此类疾病的公共卫生防控。

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采用TaqMan从儿童凳诺如病毒的检测和Genogrouping一步法RT-PCR技术

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替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

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利用常规RT-PCR和SYBR Green RT-qPCR检测罗非鱼湖病毒

本文介绍了两种实验方案，一种用于通过空斑实验和反转录定量PCR（RT-qPCR）测定轮状病毒的特异性生长速率，另一种用于测定轮状病毒的细胞结合能力。这些方案可用于确认不同轮状病毒株之间的表型差异。...

轮状病毒特异性生长速率和细胞结合能力的检测方法

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检测 幽门螺杆菌 通过粪便定量聚合酶链式反应分析检测感染与抗生素耐药性

定量实时聚合酶链式反应（qPCR）是一种快速且灵敏的方法，用于检测肿瘤样本中多种微小RNA（miRNA）分子的表达水平。利用该方法，可从同一cDNA模板扩增、定量并分析数百种不同miRNA分子的表达。...

通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测前列腺肿瘤中的微小RNA

学习使用TaqMan探针的一步法实时RT-PCR技术检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型。该方法经济高效，适用于临床诊断和流行病学研究。

通过TaqMan一步法RT-PCR检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型

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