通过TaqMan一步法RT-PCR检测儿童粪便中的诺如病毒并进行基因群分型

使用特异性TECHMAN探针通过一步法实时反转录聚合酶链式反应检测提取RNA中的神经病毒。但今天我们要讨论的是神经病毒。这项研究位于秘鲁利马，由当地大学和约翰斯·霍普金斯大学的研究团队共同开展。

诺如病毒可能是导致腹泻最被忽视的原因之一。我们的研究团队发现，在导致儿童因腹泻住院的病因中，诺如病毒仅次于冠状病毒；在基于人群的腹泻发病数量方面，诺如病毒也位居第二。那么，为什么诺如病毒此前未被诊断出来呢？

原因是这是一种RNA病毒，无法进行培养，因此需要采用特殊的分子生物学方法来诊断。这些方法包括使用逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），接下来将演示如何运用R-T-P-C-R方法来诊断神经病毒。我们采用实验室自建的G guine ATE方法（参考Ciag GUINE等人于1989年建立的方法），从粪便样本中提取病毒RNA。

该方法是商用氯化钙病毒RNA试剂盒的替代方案。两种方法均基于二氧化硅颗粒对核酸的结合特性，结合胍基盐酸盐的抗核酸酶特性，制备用于RNA提取的二氧化硅悬浮液。

制备二氧化硅颗粒时，取30克二氧化硅，加入250毫升去矿物质水，通过振荡使二氧化硅悬浮。静置24小时后，吸除215毫升上清液，并用250毫升去矿物质水重新悬浮，再次通过振荡使二氧化硅分散。再静置24小时后，通过抽吸去除上清液，并用盐酸将二氧化硅悬浮液的pH值调节至pH 2.0。将二氧化硅悬浮液置于玻璃瓶中，进行高压灭菌提取，并加入g guin和二氧化硅。

现在我们将使用前一步骤中制备的二氧化硅颗粒来提取病毒RNA。提取物应于-70°C保存，直至使用。为制备10%粪便悬液，取约0.1克粪便样本，并用1 mL PBS定容，再进行提取。

低载量样品涡旋混匀5秒，然后以4,000 RPM离心10分钟。每个反应中加入一例神经病毒阳性粪便样本作为阳性对照，以及DEPC处理的水置于微量离心管中。混合以下成分：1毫升L6缓冲液、20微升制备好的二氧化硅颗粒和200微升粪便提取物。

涡旋混匀片刻，将样品在室温下静置15分钟。离心15秒。随后用缓冲液L2洗涤沉淀两次，再用70%乙醇洗涤两次，最后用酸液洗涤一次。

将沉淀物置于56摄氏度的干燥加热块中干燥5分钟。加入50 µL无RNA酶的蒸馏水，使硅胶沉淀中的RNA水合。加入1 µL RNA酶抑制剂，涡旋混匀后于56摄氏度孵育15分钟。

以最高速度离心三分钟，收集含有RNA的上清液。使用非微量检测技术对样品进行定量，并将提取的RNA储存在-70°C，直至使用。在使用前进行商品化病毒RNA提取。

现在我们将演示使用 commercially available Kay Amp 病毒 RNA 试剂盒从粪便中提取 RNA。该试剂盒包含以下组分：硅胶膜微型离心柱、缓冲液 A、V、L、A-W1、A-W2、A-VE 以及 Carrier RNA。简要步骤如下。

取部分缓冲液A VL，加入载体RNA，涡旋混匀，将溶液分装至1.5毫升离心管中，每管加入114微升粪便悬液，并通过振荡混匀。室温孵育15分钟。对样品进行瞬时离心。

向样品中加入乙醇，通过涡旋振荡混合15秒。然后短暂离心，将溶液转移至置于两个最小收集管中的离心柱中。离心。

然后将离心柱放入一个新的收集管中。使用不含载体RNA的缓冲液A W1洗涤结合了RNA的离心柱，进行离心。将离心柱放入一个干净的2毫升收集管中，并用缓冲液洗涤离心柱。

将W2离心机调至全速，把吸附柱放入一个洁净的1.5毫升微量离心管中，全速离心。使用缓冲液A VE洗脱RNA，并将病毒RNA于-70°C保存直至使用。采用一步法实时PCR结合特异性Techman探针检测提取RNA中的神经病毒。为Geno第一组和Dina第二组配制反应混合液，在实验过程中保持逆转录酶混合液置于冰上。按照试剂盒说明配制反应体系，包含以下组分：PCR级水、Master Mix、两组引物及Dina组的探针。

第一组引物和探针用于Dina第二组。最后，在使用前将酶RT混合物涡旋混匀，加入PCR用水配制主混合液：两倍浓度的引物COG G1正向与反向引物以及探针Ring1A和1B，用于UniGroup。第一组主混合液及引物COG G2，用于VA正向与反向引物以及探针。

为Theo第二组的主混合液加样两环。最后，向INO组的各肌肉混合液中均加入酶Artix。涡旋混匀，并将10微升相应的肌肉混合液加入反应孔中。

在另一个柜子中，向相应的反应轮中分别加入5 µL未稀释的RNA、5 µL G1和G2阳性对照RNA以及5 µL阴性对照。在6,000 ×g条件下离心10秒以去除气泡。在步骤一中，软件显示高级设置。

在实验属性界面中，该实验被标识为诺如病毒。实验类型为目标物的有无检测。在PCR反应板中输入您希望检测的目标物名称。

吉娜，第一组和第二组报告基因的荧光团FAM和淬灭基团塔马拉用于样本及重复样本检测。输入反应板上包含的样本数量以及阳性和阴性对照数量，然后选择要设置运行方法的样本或靶向方向。首先，在50摄氏度下进行逆转录，以合成互补DNA。

然后将温度升至95°C以激活热启动聚合酶。在95°C下进行一段时间的初始变性，随后在60°C下进行退火与扩增的联合步骤。重复循环45次后，返回到板设置界面。

单击保存模板并保存实验。单击开始运行。扩增曲线界面允许您在仪器运行过程中采集冻结数据时查看样本的扩增情况以及曲线对比。

标准化的扩增荧光值与循环数。在PCR的初始循环中，荧光信号几乎没有变化，这一阶段定义为基线。

荧光信号相对于基线的升高表明检测到了累积的目标物。应在基线附近设定一个固定的荧光阈值。CT值（循环阈值）定义为荧光信号超过该固定阈值时所对应的分数循环数。

扩增曲线图界面可用于识别和检查异常扩增情况，例如阴性对照孔中出现荧光增强，或在预期循环数时未检测到荧光信号。试剂盒方法虽然可靠，但需要耗费大量时间和资源。本文展示了一种同样可靠的替代方法，具有成本效益，并使用国内 readily available 的试剂，避免依赖进口材料，这将最终促进对儿童胃肠炎最常见病毒病因的更广泛诊断和快速治疗。采用这种经济型的实验室自制核酸提取方法，其结果与前述方法相似。

使用Kerogen公司的商业试剂盒以及本实验室开发的TAC MAN R-T-P-C-R技术，可检测多种神经病毒的感染。该检测方法已证明适用于常规诊断，因其无需扩增后产物处理步骤，从而缩短了检测时间。

除了用于诊断外，该方案还可用于阐明神经病毒性感染的流行病学特征，因此对这类疾病的公共卫生防控具有重要意义。