$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
从置于多孔板孔中的化学固定并通透处理的小鼠肌纤维开始。
在封闭溶液中孵育,以最大限度减少非特异性抗体结合。
加入靶向神经肌肉接头或 NMJ 处表达的突触前蛋白的一抗。
用缓冲液洗涤以去除未结合的抗体。
使用荧光染料标记的二抗孵育,该二抗针对一抗,同时使用荧光染料标记的神经毒素孵育,该神经毒素结合突触后乙酰胆碱受体。
用缓冲液洗涤以去除未结合的试剂。
将纤维置于载玻片上的封片剂中,盖上盖玻片,并用圆柱形磁铁固定以压平纤维。
使用共聚焦-STED显微镜开始成像。
激光照射后,标记的蛋白质发出荧光。
共聚焦显微镜由于其分辨率有限且存在荧光扩散,难以清晰分辨神经肌肉接头的精细结构。
相比之下,STED 显微镜利用耗尽激光抑制荧光扩散,从而实现对神经肌肉接头(NMJ)的清晰可视化。
安乐死后,使用两把精细的锯齿状镊子将胫骨前肌分离成宽度约为1毫米的小束状肌纤维。然后将这些肌束转移至含有1% Triton X-100(用PBS配制)的24孔板中,在室温下轻轻振荡处理1小时,或在4摄氏度下处理5小时。
在室温下用 PBS 洗涤样品三次,每次 5 分钟后,将样品在含有 1% Triton X-100 的 PBS 溶液中配制的 4% BSA 封闭液中,于 4 摄氏度轻轻振荡孵育 4 小时。随后,将样品在含有抗神经丝蛋白 M 或突触小泡糖蛋白 2 的一抗单克隆抗体的相同封闭液中,于 4 摄氏度孵育过夜,以分别标记突触前轴突末端或活性区。
次日,在轻柔振荡条件下,用 PBS 将标记的肌束清洗三次,每次 5 分钟。然后将肌束置于摇床上,加入适当的二抗,室温孵育两小时。再次清洗肌束后,将其置于载玻片上,并加入封片介质。接着盖上一张 1.5 级玻璃盖玻片,并在载玻片两侧放置圆柱形磁铁,以施加压力并压平肌肉组织。
使用共聚焦显微镜获取图像时,启动显微镜软件并选择“Machine”作为配置模式,然后根据文本稿件中提到的设置,采集各实验组神经肌肉接头的图像堆栈。会话结束时,单击“Open in 3D Viewer”,选择一个代表该实验组的神经肌肉接头以可视化三维标记。