使用三光子荧光显微镜对斑马鱼大脑进行深层组织成像

将一个含有麻醉后斑马鱼的培养皿置于三光子显微镜的低倍物镜下，斑马鱼口中插入管路以输送含氧水。

斑马鱼的大脑中含有经过基因改造的神经元，可表达荧光标记蛋白，以便在成像过程中实现深层组织的可视化。

使用LED光源照射培养皿，并调整观察参数以获得清晰的图像。

降低物镜，直到在视野中可见斑马鱼，并将其头部置于视野中央。

将低倍物镜更换为高分辨率物镜，用于三光子成像。

小心降低物镜，直到可见头部但无物理接触，然后将轴值设为零。

关闭LED光源并拉上遮光帘，以尽量减少背景噪声。

设置成像参数并进行三光子成像，其中较长的波长可实现深层组织的三光子激发。

激发后，神经元荧光探针会发射荧光，从而实现在不同深度对神经元进行实时可视化观察。

进行成像时，将低倍物镜安装到三光子显微镜上。然后将含有斑马鱼和导管的培养皿置于显微镜下，并使用LED光源照射培养皿。在图像采集软件中，打开相机模式，点击“Live”，在屏幕右侧选择通道A，并调整直方图设置以清晰显示图像。

将电机控制器的电机设置调至基座位置后，降低物镜直至观察到斑马鱼。将鱼头中心置于视野中央，然后将物镜向上移动并远离鱼头。将低倍物镜更换为高数值孔径物镜以进行三光子成像，随后将物镜移近鱼头。将所有电机的轴值设为零。

缓慢降低物镜，确保物镜不与头部发生物理接触。在CCD相机软件中，当头部顶部可见时停止移动物镜，并将x、y和z位置设为零。关闭LED光源，并合上系统周围的遮光帘。然后将成像采集软件设置为多光子GG模式以进行三光子成像，并将物镜下方的功率设置为小于1毫瓦。

单击图像采集软件中的“Live”按钮。打开PMT通道，并根据需要调整PMT增益和背景水平。缓慢上移物镜，通过监测来自大血管和窗口玻璃表面的THG通道信号，定位头部表面。