脊髓损伤后利用新型方法对小鼠后肢骨丢失进行纵向评估 体内方法学

本实验流程展示了一种新方法，用于检测并量化小鼠脊髓损伤后随时间推移后肢骨密度的丢失情况。首先在无菌且符合动物伦理审批条件的情况下，对麻醉后的小鼠进行脊髓横断损伤手术。经过一段恢复期后，再次对动物实施麻醉，并获取其左右两侧后肢胫骨和腓骨的X射线图像。

此操作每周进行一次，持续至损伤后第40天。接下来，对X射线扫描图像进行分析。最后一步是对切除的后肢骨骼进行骨密度的死后评估。

最终结果表明，脊髓损伤会导致小鼠后肢骨密度迅速且进行性地丧失。该新方法利用低于其他成像方式所用的X射线剂量，实现了高空间和时间分辨率。骨质疏松症是一种危及生命的疾病，影响着脊髓损伤患者的生活。

我们提出了一种用于脊髓损伤动物研究的新方法，该方法可使研究人员在较长时间内纵向追踪与骨质疏松相关的骨量丢失情况。这一点具有两方面的重要性：其一，该方法将为研究骨质疏松发生发展机制提供机会。

其次，该方法为我们提供了一种测试新干预手段的途径，这些干预手段旨在预防或逆转脊髓损伤患者骨质疏松的发展。尽管该方法可为脊髓损伤诱发的骨质疏松提供研究依据，但也可应用于其他系统，例如绝经后女性的年龄相关性骨量丢失，以及其他创伤导致的骨密度下降。由于隔离、骨折或其他损伤导致的肢体失用可能在愈合过程中引起显著的骨量丢失。应用全动物纵向低剂量X射线成像可能为开发旨在最小化或预防这些问题的疗法提供新的途径。

根据标准操作程序并依照当地机构动物护理与使用委员会的指南进行脊髓损伤手术。术后从第10天开始，每隔10天进行一次评估，直至第40天。使用ivus Lumina XR系统对存活的麻醉状态下脊髓横断损伤动物以及未受伤的年龄匹配对照动物的右侧和左侧股骨及胫骨进行扫描。在扫描前，启动Lumina XR设备，使内部摄像头达到零下90摄氏度的工作温度。

将麻醉后的动物放置于Lumina xr设备内的平台上，然后插入高倍镜以同时对准股骨和胫骨区域。检查动物是否已在视野中正确放置。

如有必要，打开门并重新调整动物位置。此处展示了动物的正确摆放方式。正确摆放后，即可执行X射线功能。

从能量下拉列表中选择适合动物的选项。然后打开控制面板，通过勾选 X 射线选项启用 X 射线功能，并采集 X 射线图像。

应能完整看到整个股骨和胫骨，如图所示。由于活体成像软件默认显示经过转换的X射线图像，因此需进入校正滤波工具菜单，取消勾选“X射线吸收”选项，以确保显示原始X射线图像。原始图像数据将自动保存至硬盘。

同时保存具有代表性的TIFF文件。成像完成后，将小鼠放回其饲养笼中，并在研究者观察下使其恢复。随后对下一只小鼠重复该过程。

首先，双击对话框中出现的活体成像图标以打开软件。选择目标文件夹，然后单击“确定”。通过点击“浏览”按钮加载X射线图像。

活体成像浏览器会显示选定的数据以及用户 ID。标签信息和相机配置信息。要打开数据，请双击数据行。图像和工具面板将被显示。

在浏览器中，开放数据以蓝色高亮显示。接下来，点击 ROI 工具。在 ROI 工具的工具面板中，打开类型下拉列表，选择测量 ROI。

要加载本实验中使用的三个感兴趣区域（ROI），请单击方形图标并加载方块。使用标尺测量股骨的长度，将两个方块的长度调整为股骨总长度的八分之一，宽度调整为股骨总长度的二十四分之一。

现在使用直尺，测量从股骨近端起始处的八分之一距离，并将一个矩形框定位在该位置的中心。将第二个矩形框移至股骨远端，并将其置于膝关节松质骨区域的中心位置。然后测量胫骨的长度。

将该方框的长度调整为胫骨总长度的八分之一，宽度调整为胫骨总长度的三十分之一。最后，将方框置于胫骨近端起点下方距离为胫骨总长度八分之一处，并确保方框居中，如图所示。

接下来，单击测量图标，ROI 强度测量结果将显示在 X 射线图像上，同时 ROI 测量表格也会出现。将此表格导出为点 CSV 文件至目标位置，以便使用 Excel 打开该表格。

对所有待分析的保存图像重复此步骤。最后，将所有数据整合到一个 Excel 表格中。可使用 Microsoft Excel 或 Sigma Plot 11.0 等软件，通过学生 t 检验（T-test）确定统计学显著性。如有需要，可依据该方法的标准操作流程，将结果与采用双能 X 射线吸收测定法（dual energy x-ray absorb geometry）进行骨密度尸检分析所获得的结果进行比较。

通过上述方法可以检测到小鼠在脊髓损伤后，与未受干预的小鼠相比，胫骨和股骨的相对骨密度下降情况。该图显示了脊髓损伤后近端胫骨在损伤后第10、20、30和40天的骨密度降低。与同龄未受干预小鼠相比，损伤后仅10天胫骨骨密度即显著下降12%，至40天时骨密度下降可达15%。

在此图中，我们观察到脊髓损伤后近端股骨在损伤后第10、20、30和40天的骨密度下降情况。与年龄匹配的未损伤对照组相比，在损伤后40天时，近端股骨的骨密度下降了7%。该图显示了脊髓损伤后远端股骨在损伤后第10、20、30和40天的骨密度下降情况。

与年龄匹配的未处理对照组相比，远端股骨骨密度的下降在损伤后10天即可观察到，并在实验剩余期间持续存在。此双能X射线吸收测定法的代表性图像显示了骨矿物质含量和骨矿物质密度的检测结果。在脊髓损伤后40天对切除的股骨进行分析。

为了比较本方案所展示的方法与其他现有方法的效能，本图显示了脊髓损伤小鼠股骨中以克为单位的骨矿物质含量的双能X射线吸收仪几何分析结果，检测时间在术后40天，与年龄匹配的未处理小鼠进行对比。与未处理小鼠相比，脊髓损伤小鼠的骨矿物质含量显著减少了12%。

在此，我们观察到损伤后40天的脊髓损伤小鼠与健康对照小鼠股骨的骨矿物质密度（单位：毫克/厘米²）的双能X线吸收测定法（DXA）额外骨骼几何学分析。骨矿物质密度的下降未达到显著水平，但其变化趋势与骨矿物质含量相似。该操作一旦熟练掌握，可在20至30分钟内完成，但需注意，正确放置后肢位置至关重要。

观看本视频后，您应了解如何使用 Caliper Instruments Lumina XR 设备对脊髓损伤后的活体动物进行骨密度的纵向评估。