Name: 收养大鼠迟发型超敏反应的感应和监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: 了解在Lewis大鼠中诱导和监测迟发型超敏反应的方法。本研究展示如何激活抗原特异性效应记忆T细胞，并通过耳部抗原攻击测量炎症反应，为免疫学研究提供可靠的动物模型。

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我们感谢德国马丁斯里德的 Alexander Flugel 博士为我们提供了本实验方案中使用的表达 GFP 且特异性识别卵清蛋白的 T 细胞系。

1. 卵清蛋白特异性T淋巴细胞的刺激
在刺激培养基中，将静息的卵清蛋白特异性T细胞与卵清蛋白共同孵育，同时加入经照射的Lewis大鼠胸腺细胞（30 Gy）作为抗原呈递细胞（APCs）。（刺激培养基配制方法：以DMEM为基础，添加青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺、非必需氨基酸（NEAA）、RPMI维生素、2-巯基乙醇（2ME）、大鼠血清和卵清蛋白，各成分终浓度见材料列表。）
大鼠血清制备
<ol>
<li>我们从作为胸腺供体而处死的大鼠中采集血清。</li>
<li>大鼠通过吸入氟烷进行深度麻醉，随后使用10 ml注射器和23 G 1"针头经心脏灌注尽可能抽取血液（每只大鼠5–10 ml），然后立即斩首以确保动物死亡。</li>
<li>血液在37°C下静置凝固10分钟，再置于冰上10分钟。</li>
<li>去除凝块后，将剩余液体离心。</li>
<li>收集血清，经无菌过滤后于-20°C保存。</li>
</ol>
抗原呈递细胞的制备
<ol>
<li>使用无菌器械取断头大鼠的胸腺，置于含青霉素和链霉素的冰冻磷酸盐缓冲液（PBS-PS）中。</li>
<li>将胸腺组织置于组织培养罩中，清除血凝块及其他污染组织，将其剪碎后放入置于含10 ml PBS-PS的10 cm培养皿中的细胞筛（Fisher # 08-771-2）中。</li>
<li>使用无菌1 ml注射器活塞的尾部将每块组织通过细胞筛滤器压碎，收集单细胞悬液至预冷的50 ml离心管中。</li>
<li>用额外的 20–40 ml PBS-PS 冲洗细胞滤筛。将悬液在 1250g 离心，弃上清，将沉淀物重悬于 PBS-PS 中（每胸腺 5 ml），置于冰上。</li>
<li>用γ射线照射器对该悬浮液进行照射（30 Gy），随后立即用50 ml PBS-PS洗涤两次。 注意：最佳的胸腺供体为5至7周龄的年轻成年大鼠。也可使用长达10周龄的大鼠，但细胞数量随年龄增长而减少。性别并不重要，尽管有些人认为雄性大鼠是更好的胸腺供体。我们始终使用雌性大鼠，因为所有动物均饲养在同一房间内，而我们不希望将雄性和雌性饲养在同一房间。 </li>
</ol>
刺激
<ol>
<li>洗涤T淋巴细胞一次，并进行计数。</li>
<li>计数抗原呈递细胞。</li>
<li>将3 × 106个卵清蛋白特异性T细胞与150 × 106个APC在含有10 ml刺激培养基的10 cm培养皿中混合。</li>
<li>在37°C下孵育48小时。</li>
</ol>
2. 卵清蛋白特异性T淋巴细胞的过继性转移
<ol>
<li>我们用作受体的大鼠为雌性，7至10周龄。</li>
<li>计数T淋巴细胞，它们应为体积较大且呈圆形。抗原呈递细胞将已死亡。</li>
<li>离心收集T淋巴细胞，并用PBS重悬至浓度为10 × 106 个细胞/ml。</li>
<li>使用3 ml注射器和23 G 1"针头，每只腹腔注射1 ml。</li>
</ol>
3. 耳部抗原激发实验
<ol>
<li>过继转移两天后，向一只耳朵注射20 μl浓度为1 mg/ml的卵清蛋白溶液（= 相关抗原），另一只耳朵注射生理盐水（或无关抗原）。请勿过滤抗原溶液，以免丢失可增强炎症反应的聚集体。 注意：应将大鼠麻醉以避免其移动。如果你是右利手，应用左手拇指和食指夹住耳朵，食指置于耳廓内侧，使大鼠面朝向你。 </li>
<li>使用27G ½"针头将溶液注射至耳廓部位。尽量将所有大鼠的注射位置保持完全一致。</li>
</ol>
4. DTH 的测量
<ol>
<li>耳朵将开始发红并肿胀，这是炎症的迹象。使用弹簧式测微计（例如 Mitutoyo 公司的 PK-0505 型号）测量每只耳朵的厚度。</li>
<li>在每个时间点对每只耳朵进行 5–6 次测量，并计算平均值。</li>
<li>最大肿胀程度应出现在 24 至 72 小时之间。</li>
</ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

抗原攻击也可在其他部位进行，例如背部皮肤（2）。然而我们发现这种方法存在挑战。如本视频所示，使用耳廓进行抗原攻击可实现对迟发型超敏反应（DTH）最精确的测量。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500ml</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>刺激培养基中终浓度为 1 mM</td></tr><tr><td>青霉素 &amp;#8211; 链霉素 &amp;#8211; L-谷氨酰胺</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM（终浓度），溶于刺激培养基 </td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA，终浓度1%，加入刺激培养基中</td></tr><tr><td>RPMI 维生素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>1% 终浓度，加入刺激培养基中</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2ME, 50 &amp;#x03BC;刺激培养基中，M终浓度</td></tr><tr><td>同基因型大鼠血清</td><td></td><td></td><td>1% 终浓度。详见实验方案中的说明。</td></tr><tr><td>卵清蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml 终浓度，溶于刺激培养基中。</td></tr></tbody></table>

在大鼠中诱导与监测过继性迟发型超敏反应

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应，这些细胞会浸润至已被免疫系统致敏的抗原注射部位。该炎症反应的特征是抗原攻击部位出现红肿。DTH是评估免疫抑制剂体内功效的便捷模型。皮肤DTH可通过过继转移抗原特异性T淋巴细胞，或通过抗原主动免疫后，在特定皮肤区域进行皮内抗原攻击以诱导炎症反应。DTH反应可针对多种抗原诱导，例如卵清蛋白、结核菌素、破伤风类毒素或钥孔血蓝蛋白。此类反应也可针对自身抗原诱导，例如在以髓鞘碱性蛋白（MBP）诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型（多发性硬化动物模型）中针对MBP产生的反应（1）。

本文将演示如何在Lewis大鼠中诱导过继性DTH反应。首先，我们在体外刺激卵清蛋白特异性T细胞，并将活化的细胞经腹腔注射至未免疫的正常大鼠。待细胞在体内平衡2天后，用卵清蛋白对大鼠一侧耳廓进行皮内攻击，另一侧耳则注射生理盐水作为对照。炎症反应在攻击后3至72小时可见，通过测量耳部厚度评估DTH反应的严重程度。

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T（TEM）淋巴细胞介导的炎症反应。本文演示了如何激活抗原特异性TEM细胞，在Lewis大鼠中诱导过继性DTH反应，并监测其炎症反应过程。

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应，这些细胞会浸润注射部位……

我是Christine Beaton。我是加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。在接下来的几天里，我将向您展示在Louis大鼠中诱导和测量适应性迟发型超敏反应（DTH）的操作步骤。该实验流程共需五天，我将向您展示如何激活抗原特异性的T细胞，两天后将其初次注射到未致敏的大鼠体内。再过两天，我们将用这些T细胞所特异识别的抗原对大鼠耳部进行攻击刺激。随后在24小时后，测量这些大鼠耳部炎症反应的程度。为了获得组织培养所需的血清，我需要采集血液。为此，我进行心脏穿刺。将左手食指放在腹腔神经丛处，通过肋骨之间的间隙将针头插入心脏，尽可能抽吸出更多的血液。根据不同的日期和操作效率，从一次采血中，我们可从一只大鼠获得 2 到 10 mL 的血液。在培养过程中需要血清的原因是，我们希望在与 Louis 大鼠细胞同源的血清中培养这些 Louis 大鼠细胞，即同系血清，因此将使用 Louis 大鼠的血清。然后将血液转移到试管中，但我会小心地将注射器上的针头取下，以避免溶血，因为后续我需要使用血清进行组织培养。现在，由于心脏已停止跳动且大鼠已经死亡，我将取出胸腺。因此，我首先用70%乙醇喷洒，以确保没有毛发飘散并进入我的器官组织，因为该组织需要用于组织培养。我使用经过高压灭菌的器械进行解剖。首先剪除皮肤。去除皮肤后，我仔细地在胸腔两侧进行切割，以确保不会损伤位于心脏上方的胸腺。胸腺在此处呈现为一个颜色较浅、近乎白色的器官，位于心脏正上方。因此，我会将其完整取出，确保获取整个器官，但在取出过程中无需过于精细，因为后续还将在生物安全柜中进一步清理。然后将其放入含有青霉素和链霉素的 PBS 溶液中。为避免细菌生长，我将制备单细胞悬液。为此，我将使用孔径为 70 微米的细胞筛。我将使用无菌器械。将胸腺转移至培养皿中。如您所见，组织并不十分洁净。胸腺是一个呈浅色的器官，其表面有淋巴结和血凝块。因此，我将去除这些组织。然后，我会在细胞筛中加入约10 mL添加了抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS），以准备接收清理后的胸腺。为了将其清理干净，我只需从胸腺中彻底去除所有污染物。现在我的胸腺几乎完全洁净，因此我将用镊子夹起它，在细胞筛上用剪刀将其剪成小块，并将所有胸腺小块放入细胞筛中。完成此步骤后，我将使用一支一毫升注射器的活塞（当然已灭菌），通过在细胞筛中按压胸腺组织块，制备单细胞悬液。单个细胞将穿过细胞分离装置，并进入装置外的磷酸盐缓冲液（PBS）中。现在我已经将细胞通过细胞分离装置压出，可以看到PBS不再澄清，其中充满了我即将转移至预冷的50 mL离心管中的单细胞悬液。接下来，我将重复几次该操作：用 PBS 重新填充细胞滤器，用注射器活塞进一步按压，并转移至离心管中，直到离心管中的 PBS 体积达到 30 至 40 mL。完成操作后，细胞滤器将呈现如图所示的

induction-monitoring-adoptive-delayed-type-hypersensitivity

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科研

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生物学

收养大鼠迟发型超敏反应的感应和监测

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