在大鼠中诱导与监测过继性迟发型超敏反应

我是Christine Beaton。我是加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。在接下来的几天里，我将向您展示在Louis大鼠中诱导和测量适应性迟发型超敏反应（DTH）的操作步骤。

该实验流程共需五天，我将向您展示如何激活抗原特异性的T细胞，两天后将其初次注射到未致敏的大鼠体内。再过两天，我们将用这些T细胞所特异识别的抗原对大鼠耳部进行攻击刺激。随后在24小时后，测量这些大鼠耳部炎症反应的程度。

为了获得组织培养所需的血清，我需要采集血液。为此，我进行心脏穿刺。将左手食指放在腹腔神经丛处，通过肋骨之间的间隙将针头插入心脏，尽可能抽吸出更多的血液。

根据不同的日期和操作效率，从一次采血中，我们可从一只大鼠获得 2 到 10 mL 的血液。在培养过程中需要血清的原因是，我们希望在与 Louis 大鼠细胞同源的血清中培养这些 Louis 大鼠细胞，即同系血清，因此将使用 Louis 大鼠的血清。

然后将血液转移到试管中，但我会小心地将注射器上的针头取下，以避免溶血，因为后续我需要使用血清进行组织培养。现在，由于心脏已停止跳动且大鼠已经死亡，我将取出胸腺。

因此，我首先用70%乙醇喷洒，以确保没有毛发飘散并进入我的器官组织，因为该组织需要用于组织培养。我使用经过高压灭菌的器械进行解剖。首先剪除皮肤。

去除皮肤后，我仔细地在胸腔两侧进行切割，以确保不会损伤位于心脏上方的胸腺。胸腺在此处呈现为一个颜色较浅、近乎白色的器官，位于心脏正上方。因此，我会将其完整取出，确保获取整个器官，但在取出过程中无需过于精细，因为后续还将在生物安全柜中进一步清理。

然后将其放入含有青霉素和链霉素的 PBS 溶液中。为避免细菌生长，我将制备单细胞悬液。为此，我将使用孔径为 70 微米的细胞筛。

我将使用无菌器械。将胸腺转移至培养皿中。如您所见，组织并不十分洁净。

胸腺是一个呈浅色的器官，其表面有淋巴结和血凝块。因此，我将去除这些组织。然后，我会在细胞筛中加入约10 mL添加了抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS），以准备接收清理后的胸腺。

为了将其清理干净，我只需从胸腺中彻底去除所有污染物。现在我的胸腺几乎完全洁净，因此我将用镊子夹起它，在细胞筛上用剪刀将其剪成小块，并将所有胸腺小块放入细胞筛中。完成此步骤后，我将使用一支一毫升注射器的活塞（当然已灭菌），通过在细胞筛中按压胸腺组织块，制备单细胞悬液。

单个细胞将穿过细胞分离装置，并进入装置外的磷酸盐缓冲液（PBS）中。现在我已经将细胞通过细胞分离装置压出，可以看到PBS不再澄清，其中充满了我即将转移至预冷的50 mL离心管中的单细胞悬液。

接下来，我将重复几次该操作：用 PBS 重新填充细胞滤器，用注射器活塞进一步按压，并转移至离心管中，直到离心管中的 PBS 体积达到 30 至 40 mL。完成操作后，细胞滤器将呈现如图所示的状态。现在，我已经收集了全部细胞，将在 1200 RPM 条件下离心约 10 分钟。

这是我从离心机中取出的细胞，沉淀量相当大，这是我预期的结果，因为这是我第一次去除上清液。因此，沉淀物当然仍然留在管底。为了更易于重悬，我将在沉淀仍几乎干燥时将其打散。

为此，我只需用手指用力轻敲，直到观察到组织块完全分散，重新形成单细胞悬液为止。现在，我将把细胞重悬于无菌 PBS 中，每管加入 5 mL PBS。由于我只有一管，因此仅加入 5 mL。

然后，我将把这种悬液转移至灌注装置中。我使用的灌注温度为30摄氏度，以确保细胞仍然存活，但在数小时内会死亡。这样它们仍能处理抗原，但不会污染我的培养物。

如果我们观察一下我们想要激活的T细胞，会发现它们看起来完全不健康。一些细胞已经开始死亡，形态异常，且数量明显减少。

因此，这些细胞已处于可激活状态。在经过一段时间后，它们实际上非常渴望接触抗原。快速洗涤这些细胞极为重要，因为其中部分细胞可能已经死亡，并会向溶液中释放有毒化合物。

因此，我用PBS溶液将试管补至50 mL。同时，我将把等待刺激的T细胞转移至另一个50 mL试管中，以便可以同时离心这两个试管。

这是我不久前采集的血液，我在37摄氏度下放置了10分钟，然后将其置于冰上。如您所见，血液已完全凝固。因此，我需要从该血液中获取血清。

因此，在第一步中，我将使用无菌的巴氏吸管收集液体，先将凝块从管壁上剥离，然后收集所有含有我所需血清的液体，以及一些未被凝块捕获的细胞。接着，我将把这些液体转移至另一支离心管中。在转移过程中，有时会带入少量凝块碎片，但这问题不大，因为我无论如何都需要去除仍存在于该液体中的细胞。

现在我要将装有液体的小管进行离心。这样可以去除细胞以及随同存在的任何凝块碎片。接下来，我将离心血液的液体部分，以分离细胞和血清。离心两分钟就已足够。

现在血清已经离心完毕，接下来我将从细胞中分离血清。这个样本并不是一个理想范例，因为血清本应呈淡黄色，而这个样本呈红色，表明发生了溶血。因此这个样本并不完全理想，但我仍会向您演示如何进行过滤。

我使用 0.2 微米的一次性注射器滤器过滤血清，以确保其无菌。但由于出现了溶血，我不会将这份血清用于后续的刺激实验。我将使用之前实验中冻存的 Louis 大鼠血清。

左侧为T细胞，右侧为抗原呈递细胞。接下来，我将去除两个离心管中的上清液。与之前步骤相同，我将用手指轻弹管底，使沉淀充分重悬，确保细胞恢复为单细胞悬液状态。

我将对这两组细胞——T细胞和抗原呈递细胞——进行同样的操作。之后，我将重悬细胞并进行计数。然后，我将300万个T细胞与1.5亿个抗原呈递细胞混合，并将其放入直径为10厘米的培养皿中。

总共10毫升体积中，这里有两管血清。右侧这管是我今天制备的，由于溶血而呈红色；而左侧这管是我几天前制备后一直冷冻保存的，呈黄色，无溶血现象，质量更好。

这是我今天将用于组织培养的细胞。我有足够的细胞用于刺激六块培养皿，因此我将在抗原呈递细胞中加入30毫升培养基，在T细胞中也加入30毫升相同的培养基。接下来，我将在抗原呈递细胞的试管中加入抗原，即白蛋白。

我的母液浓度为每毫升1毫克，而我希望在培养皿中的终浓度为每毫升10微克。在T细胞培养中，我将加入路易斯大鼠血清，加入的量需确保最终在培养皿中达到1%的大鼠血清浓度。

我将对我的抗原呈递细胞悬液进行匀浆处理，然后将5 mL该细胞悬液分别转移至每个培养皿中。当你取出抗原呈递细胞悬液时，总会发现其中有一小团脂肪和纤维组织，这是完全正常的。

在我们所有站点准备过程中都会出现这种情况。无需担心。因此，如果能够去除，我就将其清除；否则，就直接留在培养皿中。

它对我的细胞培养完全没有影响。在将所有APC转移到培养皿后，我将用T细胞重复该步骤。因此，我将在每个培养皿中加入5 mL的T细胞悬液。

现在我所有的细胞都已放入培养皿中，充分混匀非常重要，以确保所有T细胞都有机会与抗原呈递细胞接触。为此，我将培养皿叠放在一起，通过在空中画无形的“8”字来混匀培养皿中的液体。我会重复多次，以确保所有细胞充分混匀。

完成所有混匀操作后，我将把这些培养皿放入含有湿润气氛、37°C、5%CO2的培养箱中培养48小时。培养后，培养基颜色略有变化，现在偏橙色，细胞也已得到良好活化。

因此，我在显微镜下逐一检查所有培养皿。其中体积非常大的细胞是活化的T细胞，而体积非常小的细胞是已死亡的抗原呈递细胞。刺激效果非常好，因为可以看到T细胞体积显著增大。

如果我稍微移动一下培养皿，哎呀，您可以看到左侧的细胞现在到了中央，这里有一大团细胞，它们正在活跃地分裂。接下来，我将把所有细胞放入离心管中，以便离心沉淀、计数，然后向大鼠注射一千万个细胞。由于刺激效果非常好，我并不需要将所有这些T细胞都注射给一只大鼠。

我将仅使用两个培养皿中的细胞。我会将它们分别离心，取其中一管用于注射一千万个细胞给大鼠，另一管则放入培养中，几天后进行冻存。

培养基是常规的T细胞培养基，需添加T细胞生长因子和马血清。由于T细胞为非贴壁细胞，因此我不需要进行太多操作，只需确保大部分细胞随培养基转移即可。

最后，我会用新的培养基冲洗所有培养皿，以确保将所有细胞都收集出来。加入10毫升与刺激时相同的培养基，然后我认为每个培养皿都要这样做，但T细胞在我第一次取培养基时其实已经收集到了。通常培养基会从这里流出，这一步并非绝对必要，但由于这些细胞非常珍贵，我不想损失任何细胞。

因此，我将对它们进行离心处理，以去除部分死细胞，主要保留活细胞。然后，我想为它们更换新鲜的培养基。

接下来，我将再次以1,500 RPM的转速离心约八分钟。我仍然保持刹车开启，因为我只是在沉淀细胞。我们只需将两个管子都轻轻取出，其中一个管中已有少量沉淀物。

这来自两个培养皿。这是四个培养皿的沉淀物。沉淀物量很大，因为其中不仅含有活化的T细胞，还含有数据抗原呈递细胞。

现在，我将弃去上清液。对于我将要注射的细胞，我会加入一毫升培养基，这将是用来注射的培养基。而另一部分细胞，我将用含有T细胞生长因子和马血清的100毫升培养基重悬。这些就是我将要注射的细胞。

对于这些细胞，我将它们分别放入两个各含50毫升的塑料培养瓶中。在每个培养瓶中，我将加入10%的T细胞生长因子（即骨髓来源的因子），同时加入10%经加热灭活的马血清。

然后我会加入大部分所需的培养基。我不会反复吹打，因为T细胞不喜欢过度吹打。因此，我只会加入绝对必要的最少用量，避免对细胞造成影响，最后直接完成操作，细胞即可准备就绪。

它们已经可以放入培养箱了，我会每天观察一次。可能24小时后就需要进行传代，如果没赶上，最迟40到48小时也一定要传代。但我会每天检查它们的生长情况。

它们在T细胞生长因子中 tends to grow very fast。因此，需要至少每48小时传代一次，可能还需要更频繁。我还将检查培养基的颜色。

现在它们已被激活，处于完全激活状态。这是将它们注射到大鼠体内的最佳时机。两天后，我们将对大鼠的耳朵进行攻击实验。

如果我们等待细胞，再等待几天让细胞恢复到静息状态，它们仍会如此迅速地归巢至炎症部位。现在，我将把细胞放入37摄氏度、5% CO2的培养箱中，并使用25号针头将细胞注射入大鼠体内。细胞注射完成后，我将把大鼠留在此处，并在48小时后对其耳部进行激发刺激。

几天前，我将表达GFP的白蛋白特异性T细胞注射到了一只大鼠体内。今天，我将在同一只大鼠的耳部进行激发实验。在右耳，我将注射白蛋白。

在左耳，我将注射一些 PBS。我所注射的伏立农剂量为 20 微克，体积为 20 微升。我使用的白蛋白是德克萨斯红标记的白蛋白与未标记白蛋白按 1:1 比例混合的混合物。

这就是我将用来向您演示注射方法的实验台。我用右手操作，因此我脱掉了左手的手套，以便将一根手指放在耳后下方，另一根手指放在上方，牵拉皮肤，从而清楚地观察针头的位置，并将针头准确地刺入皮肤表层之间的空隙，这个部位的皮肤非常薄。

因此，我使用27号针头，以便用极细的针头插入。如果我将耳朵翻转过来，可以清楚地看到Texas red和PBS分别进入的位置。现在是接种后的42小时，我将使用弹簧加载的测微计来测量耳部厚度。

因此，我将测量两只耳朵，即接受白蛋白刺激的右耳和未接受刺激的左耳。耳朵厚度的差异将帮助我们评估炎症反应的强度。以上向您展示的是在大鼠中进行适应性迟发型超敏反应（DTH）实验的完整操作流程。

我向您展示了如何在体外激活抗原特异性T细胞，如何将这些细胞过继性地移植到大鼠体内，然后如何对这些大鼠进行攻击并测量炎症程度。我们Chand实验室常规使用该方法来检测钾离子通道阻断剂对大鼠炎症的影响。