Name: 心肌在心脏组织工程中的纤维蛋白凝胶的封装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习将新生大鼠心肌细胞封装于纤维蛋白水凝胶中，用于心脏组织工程研究。该方法可构建具有收缩功能的工程化心肌组织，为心肌梗死治疗及心脏发育研究提供体外模型。

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本研究由美国国立卫生研究院-国家心、肺与血液研究所（资助号：R00HL093358，授予 L.D.B.）提供支持。

<ol><li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical%2C+biochemical%2C+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li>
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<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Three-Dimensional+Hyaluronic+Acid+Stem+Cell+Chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis.</a> Tissue engineering. 15, (2009).</li>
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<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%3ELIVE%2FDEAD+Viability%2FCytotoxicity+Kit+%2Afor+mammalian+cells%22">>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells</a>. , Invitrogen. (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

将新生大鼠心肌细胞包封于纤维蛋白凝胶中，可获得一种稳定且具有活性的三维体外心肌系统模型。纤维蛋白是一种优选的生物材料，因为当细胞被包埋后，仍保持代谢活性，并能够发生收缩、重塑并重建与天然心肌组织一致的细胞外基质12。由于在此环境中允许心肌细胞自行排列，其功能特性更接近于心肌组织，与各向同性组织相比可产生更大的收缩力6。对于潜在的治疗应用而言，必须将细胞包封于一种既能维持细胞活性又能支持其功能发挥的材料中。本文所展示的实验方案提供了一种高效且精确的方法，用于构建纤维蛋白网络，以调控三维微环境中心脏细胞的行为。
在构建和培养这些组织工程结构的过程中，可能会出现一些潜在问题。其中一个潜在问题是细胞在包埋前的存活率维持，这将显著影响结构的功能性。应尽量减少细胞在分离后到包埋入纤维蛋白凝胶前的时间，以降低细胞死亡。应严格按照每隔一天更换一次培养基的频率为结构提供营养。此外，确保所用溶液的均一性也至关重要。如果纤维蛋白原、凝血酶和细胞的混合物产生非均质环境，则细胞重塑细胞外基质、力学耦合及收缩的能力可能受到阻碍。同时，在注射构建物时应避免产生气泡，以防止对工程化组织连续性的干扰。解决此问题的一种方法是吸取比所需量更多的凝胶至注射器中，并缓慢注射。最后，一旦纤维蛋白基质成型并在培养基中培养24小时后，必须将构建物从环形模具的侧壁上分离，以促进细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩。将构建物保持在模具中央有助于气体和营养物质的交换。若构建物黏附于模具侧壁，还可能破坏细胞的理想排列方向。
需要注意的是，本方案中采用清醒状态下断头法作为安乐死方法，该方法符合美国国立卫生研究院和美国兽医协会指南的规定。然而，部分机构建议对新生大鼠先使用麻醉剂再进行断头。我们选择在清醒状态下断头，是为了确保离体心脏组织/细胞处于缺氧环境的时间最短。相对轻微的缺氧即可导致心肌细胞缺血，甚至可能引起心肌细胞死亡，这会显著影响本方案的实验结果。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>PBS</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>PBS</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>PBS</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>PBS</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td>分离</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>91308-12</td><td>分离</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>分离</td></tr><tr><td>大剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-14</td><td>分离</td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>分离</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>10008-13</td><td>分离</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-918-5A</td><td>分离</td></tr><tr><td>吸水实验台垫</td><td>VWR international</td><td>56617-014</td><td>分离</td></tr><tr><td>无菌手术单</td><td>Fisher Scientific</td><td>GM42526</td><td>分离</td></tr><tr><td>高压灭菌袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td>分离</td></tr><tr><td>纱布垫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-761-52</td><td>分离</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-150-01</td><td>分离</td></tr><tr><td>无菌手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-020</td><td>分离</td></tr><tr><td>无菌移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>9962</td><td>分离</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLS2</td><td>分离</td></tr><tr><td>特氟龙棒，直径1/4英寸</td><td>McMaster-Carr</td><td>8546K11</td><td>模具部件</td></tr><tr><td>特氟龙管，内径1/4英寸，外径1/2英寸</td><td>McMaster-Carr</td><td>8547K31</td><td>模具部件</td></tr><tr><td>硅胶O型圈，内径1/4英寸，外径1/2英寸</td><td>McMaster-Carr</td><td>9396K204</td><td>模具部件</td></tr><tr><td>特氟龙管，内径1/4英寸，外径5/16英寸</td><td>McMaster-Carr</td><td>52355K14</td><td>模具部件</td></tr><tr><td>Kendall monoject 注射器，6 cc</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-41</td><td>模具部件</td></tr><tr><td>BD 注射器，3 cc</td><td>Fisher Scientific</td><td>309585</td><td>模具部件</td></tr><tr><td>牛纤维蛋白原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630</td><td>构建</td></tr><tr><td>牛凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7513</td><td>构建</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>构建</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>构建</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10569</td><td>构建</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>构建</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383147</td><td>构建</td></tr><tr><td>0.2 微米滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVT05RE</td><td>构建</td></tr><tr><td>40 微米细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>构建</td></tr><tr><td>0.45 微米瓶顶滤器</td><td>Corning</td><td>430627</td><td>构建</td></tr><tr><td>玻璃预滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>AP2007500</td><td>构建</td></tr><tr><td>18G，1 1/2 英寸长针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td>构建</td></tr><tr><td>21G，1 英寸针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826C</td><td>构建</td></tr><tr><td>构建用玻璃罐</td><td>Fisher Scientific</td><td>2116</td><td>构建</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>培养基</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1138</td><td>培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td>培养基</td></tr><tr><td>氨基己酸</td><td>Acros Organics</td><td>103305000</td><td>培养基</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>培养基</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td>培养基</td></tr><tr><td>多聚甲醛，16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>组织学</td></tr><tr><td>最佳切割温度（OCT）包埋剂</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27050</td><td>组织学</td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>03551-4</td><td>组织学</td></tr><tr><td>小鼠MYH1/2/4/6一抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-32732</td><td>组织学</td></tr><tr><td>兔Connexin 43一抗</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3512</td><td>组织学</td></tr><tr><td>Dylight 549标记的驴抗小鼠二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-505-151</td><td>组织学</td></tr><tr><td>Dylight 488标记的驴抗兔二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-485-152</td><td>组织学</td></tr><tr><td>活/死细胞检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td>分析</td></tr></tbody></table>

用于心脏组织工程的纤维蛋白水凝胶包封心肌细胞

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

在三维水凝胶环境中培养细胞是组织工程构建体开发以及体外研究细胞在不同培养条件下反应的重要技术。由于在各个维度上施加了机械和化学刺激，三维环境能更接近地模拟细胞在体内所经历的情况1。三维水凝胶可由合成聚合物（如PEG-DA2和PLGA3）制成，也可由多种天然存在的蛋白质制成，例如胶原蛋白4、透明质酸5或纤维蛋白6,7。由纤维蛋白（一种天然存在的血液凝固蛋白）制备的水凝胶可聚合形成网格结构，参与机体自然的伤口愈合过程8。纤维蛋白可被细胞降解且具有潜在自体来源的可能性9，使其成为组织工程中理想的临时支架。
本文详细描述了从出生三天的大鼠幼崽中分离新生心肌细胞，并将这些细胞制备成用于组织工程中纤维蛋白水凝胶结构包封的步骤。新生心肌细胞是体外研究心肌组织形成与工程中常用的细胞来源4。纤维蛋白凝胶通过将纤维蛋白原与凝血酶混合而形成。凝血酶切割纤维蛋白原中的纤维蛋白肽FpA和FpB，暴露出可与其他单体相互作用的结合位点10。这些相互作用促使单体自组装成纤维，进而形成水凝胶网络。由于该酶促反应的时间可通过调节凝血酶与纤维蛋白原的比例，或钙离子与凝血酶的比例进行调控，因此可制备出具有多种不同几何形状的注射成型结构11,12。此外，我们还可通过在培养过程中对凝胶施加约束的方式，引导所形成的组织产生定向排列13。
在静态条件下培养工程化心肌组织构建物两周后，心肌细胞已开始重塑该构建物，并能在电刺激条件下产生收缩力6。作为本实验方案的一部分，我们还描述了培养结束后对组织工程心肌的分析方法，包括通过电刺激评估心肌组织构建物产生的主动收缩力的功能分析，以及检测最终细胞活力的方法（活-死细胞染色实验），并采用免疫组织化学染色来观察对收缩功能至关重要的典型蛋白（如肌球蛋白重链，Myosin Heavy Chain 或 MHC）以及心肌细胞间耦联相关蛋白（连接蛋白43，Connexin 43 或 Cx43）的表达与形态。

我们描述了新生大鼠心肌细胞的分离方法，以及将细胞包封于纤维蛋白水凝胶支架中用于组织工程的制备步骤。我们还介绍了培养结束后对组织工程心肌组织的分析方法，包括电刺激下产生的主动收缩力、细胞活力检测以及免疫组织化学染色。

在三维水凝胶环境中培养细胞是组织工程构建体开发以及相关研究的重要技术。

本实验的总体目标是将新生大鼠心肌细胞包埋于FI水凝胶中，用于心脏组织工程。首先分离出生后两到三天的新生大鼠心脏，随后用胶原酶对心脏组织进行消化。为了将心肌细胞与细胞外基质分离，随后将心肌细胞包埋于纤维蛋白水凝胶中。最后，将构建物培养两周。最终结果表明，这些构建物能够在电刺激下产生约1.3毫牛顿的收缩力。此外，可通过心肌细胞蛋白的组织学染色观察到该构建物的有序结构。工程化心肌构建物有望成为心肌梗死的一种潜在治疗手段，通过工程化组织修复或替代受损后形成的瘢痕组织，从而在损伤或疾病后改善心脏功能。这些构建物可作为有价值的体外模型系统，用于研究各种刺激对收缩力以及正常与病理生理状态下心脏发育的影响。为每位操作者准备好培养基并对手术器械进行灭菌后，将吸水性实验台垫铺在超净台工作区域内，并用无菌洞巾覆盖工作台面。将无菌手术器械和一块4×4的纱布垫放置于无菌洞巾上。在不接触器械的前提下，打开一个无菌的20号手术刀片，并将其放置于洞巾上。将幼鼠断头后，用浸有聚维酮碘的纱布擦拭胸部。通过捏住肩胛骨固定幼鼠。进行部分胸廓切开以暴露心脏，并增加对肩胛骨的压力，使心脏从肋骨下方推出。进行肩胛骨解剖时，将手术刀片沿心脏后方划过，切断大血管并移除心脏。将心脏置于含有PBS葡萄糖的培养皿中，并放在冰上。心脏分离后，用冰冷的PBS葡萄糖冲洗，以去除残留的血液和结缔组织。切除每颗心脏的上三分之一，保留底部三分之二。仅以分离大部分心室组织为目的，将组织置于含冰冷 PBS 葡萄糖的新培养皿中。使用无菌显微剪刀和镊子，小心地将心脏组织剪切成约一立方毫米大小的碎块。将组织转移至一个50毫升的锥形管中，并除去缓冲液，仅保留10毫升。加入7毫升胶原酶溶液。在37摄氏度下振荡消化胶原酶与组织的混合物7分钟。轻轻吹打10次以分散组织块。静置使组织块沉降，然后吸去液体并弃去。向组织块中加入7毫升胶原酶，再次消化7分钟。对于后续每一步，均需轻柔吹打10次，以分散组织块。待组织块沉降后，吸出上清液并收集到另一个50毫升锥形管中，向组织块中加入7毫升胶原酶，再次消化7分钟。每次从消化液中收集上清液后，均需使用不同的移液管向每管上清液中加入10毫升终止液。为制备纤维蛋白凝胶构建物，请参考方案的书面部分。将先前制备的芯模放入6毫升注射器外壳中，并使用3毫升注射器作为活塞，使O形圈与聚四氟乙烯垫片之间形成紧密密封。为制备1毫升纤维蛋白凝胶，于锥形管中配制F溶液：将112微升纤维蛋白原储备液加入558微升20毫摩尔的HEPES中。在另一个锥形管中，将缓冲液加入0.9%生理盐水中。通过向135微升DMEM中加入17微升凝血酶储备液和1.3微升正常钙溶液，制备T溶液。在第三个锥形管中，离心沉淀细胞，并将其重悬至浓度为每毫升2940万个细胞，即达到构建物中所需最终细胞浓度的六倍。通常，初次接触该方法的研究人员在构建体的制备步骤中会遇到困难。将纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液混合后，纤维蛋白的聚合反应会迅速发生。因此，操作者应迅速操作，以确保溶液均匀，并在将溶液注入模具成型时避免将气泡带入水凝胶中。准备浇铸纤维蛋白凝胶构建物时，使用一支1 mL注射器并安装18号1.5英寸针头。同时准备好21号1英寸针头。配制1 mL纤维蛋白凝胶溶液时，先将667 µL F溶液加入50 mL离心管中，随后加入167 µL细胞溶液。最后，加入167 µL的T溶液。小心移液混合物，避免引入气泡。此时反应已经开始，应立即进行构建体的注射。使用注射器和18号针头吸取纤维蛋白溶液。注意不要将注射器倒置，以防止气泡进入针头。将18号针头更换为21号针头。轻轻敲击注射器以排出所有气泡。接着，将注射器沿聚四氟乙烯O形圈的凹槽插入塞子包裹部分之间的模具中，并将溶液注入模具内。倾斜模具以确保完全充满。然后填充剩余的模具。将模具每三个一组用封口膜包裹，并置于37摄氏度的培养箱或烘箱中。孵育凝胶20分钟，以确保纤维蛋白有足够时间完全聚合。每个构建物加入 21 毫升心肌构建物培养基，注入每个培养罐中。使用无菌的 3 cc 注射器外壳作为活塞，将带有构建物的芯轴推入含有 DMEM 的大号培养皿中。然后将构建物放入样品罐中。将培养皿在 37 摄氏度下孵育两周。开始分析纤维蛋白构建体夹具时，将来自刺激器的导线上的鳄鱼夹连接至浴槽中电极的导线上。启动数据采集板、脉冲发生器和力传感器。将力传感器设置为5G档位并调零。打开一个自定义的LabVIEW程序，用于显示和保存来自力传感器的数据。在数据文件夹中为每个样品创建一个新的空文本文件，使用镊子将构建物从模具支撑上取下，轻轻将构建物环从聚四氟乙烯支撑上滑出，并套在力测量系统的固定金属柱上。中等浴槽。使用镊子推动并抬起力传感器柱周围的构建物。将构建物的另一端放置在传感器臂上，并拧紧，直至传感器显示读数。心脏刺激器上设置1.0 G的力。将脉冲电压设为20伏，持续时间设为6毫秒，频率设为1赫兹。通过按下输出开关按钮启动电刺激起搏。开始记录，直至波形变得规律。使用 MATLAB 分析波形，以确定心肌细胞的收缩力速率和舒张速率。心肌细胞纤维蛋白构建物最初覆盖模具的整个宽度。培养两周后，其收缩至初始宽度的约五分之一。对该构建物进行电刺激可产生如图所示的收缩力数据，预期收缩力约为1.3毫牛顿。由于氧气向构建物内部扩散受限，构建物中细胞的存活率取决于细胞距离与培养基接触的构建物表面的远近。通过共聚焦显微镜观察，在构建物表面可见较高的细胞存活率。通过红色标记肌球蛋白重链染色可观察到构建物的取向结构，而连接蛋白43（Connexin 43）呈绿色，该蛋白对于心肌细胞间的细胞耦合至关重要。一旦掌握，整个实验方案大约需要五小时。其中，I 型隔离部分约需三小时，而结构构建部分约需两小时。在进行该操作时，必须始终使针头朝下，以防止将气泡带入纤维蛋白网络中。此外，在注射过程中始终将模具倾斜，可使针孔保持在最高点，从而确保纤维蛋白溶液完全充满模具铸型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将心肌细胞包封到环状纤维蛋白水凝胶中，具体步骤包括首先从新生大鼠中分离心肌细胞，然后将纤维蛋白溶液注射至易于组装的圆柱形模具中进行成型。

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科研

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生物工程

心肌在心脏组织工程中的纤维蛋白凝胶的封装

我们介绍了将细胞包封于合成水凝胶中的三维（3D）技术方案。文中概述了两种常用的交联方法（迈克尔加成反应和光引发自由基反应）的包封步骤，以及多种用于评估包封后细胞行为的技术。...

用于组织工程的三维水凝胶细胞包封

从脱细胞组织制备可注射基质凝胶并将其注射入大鼠心肌的方法 体内...

用于心肌组织工程的生物来源可注射材料的制备

本实验方案重点利用干细胞固有的能力，即响应其周围细胞外基质的信号，进而被诱导分化为多种表型。本方法学论文扩展了我们对一种双层水凝胶模型的描述与表征，该模型由聚乙二醇-纤维蛋白（PEG-fibrin）和胶原蛋白组成，可同时共诱导脂肪来源的干细胞分化1。...

构建双层水凝胶以调控ASC分化

该模型系统始于含有肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶，可用于以非破坏性方式实时研究内源性胶原蛋白的（再）组织过程。该模型系统具有高度可调性，可结合不同细胞来源和培养基添加剂使用，并能轻松适应特定研究需求。...

利用肌成纤维细胞构建纤维蛋白基组织工程支架并施加约束与应变以诱导细胞和胶原的重排

在啮齿类动物模型中，通过结扎左前降支（LAD）诱导心肌梗死后，传统上需要两次开胸手术来植入生物移植物。为了降低死亡率，并为与细胞相关的固体和明胶状生物材料的固定提供最佳条件，目前已开发出微创手术方法。...

用于大鼠心力衰竭的细胞治疗：心肌梗死双侧开胸术及细胞与生物基质的心外膜植入

本方案旨在通过使用水凝胶系统和基于纤维蛋白的胶水，克服干细胞治疗心肌梗死时细胞移植率低的局限性。采用该方法，可在心肌梗死后维持细胞与组织之间的接触，从而提高有益因子在损伤部位的治疗潜力。...

一种基于水凝胶支架和纤维蛋白胶的方法在小鼠心肌梗死模型中递送治疗药物

本方案描述了在保留细胞外基质成分的同时，对人心肌组织进行完全脱细胞处理。对细胞外基质的进一步加工可制备出微颗粒及一种具有细胞保护作用的自组装水凝胶。...

人类心脏组织制备自组装细胞外基质水凝胶的处理方法 体外 和 体内 应用

本文介绍了一种快速、简便且低成本的方法，用于制备定制的聚二甲基硅氧烷模具，该模具可用于制造具有复杂几何结构的基于水凝胶的工程化组织。我们还描述了采用该技术制备的工程化心肌组织的力学性能和组织学评估结果。...

基于激光蚀刻母模定制的组织培养模具

基于干细胞的治疗已成为修复心肌梗死后受损心肌组织的有效策略。我们提供了一种利用可被酶促交联的明胶水凝胶进行干细胞移植的最佳体内应用方法。...

小鼠心肌梗死模型中注射型水凝胶负载间充质干细胞的心肌内移植

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

学习将新生大鼠心肌细胞封装于纤维蛋白水凝胶中，用于心脏组织工程研究。该方法可构建具有收缩功能的工程化心肌组织，为心肌梗死治疗及心脏发育研究提供体外模型。

用于心脏组织工程的纤维蛋白水凝胶包封心肌细胞

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