视频速率扫描共聚焦显微成像与微型内窥显微技术

本视频演示了如何使用标准的市售组件构建视频速率扫描共聚焦显微镜。扫描共聚焦显微镜依赖于两个扫描镜的协调运动，以将光束在光栅平面上进行移动。来自第一面扫描镜的光束在第一组中继透镜上水平扫描，并被聚焦回第二面扫描镜上的一个固定点。随后，相同的扫描运动通过扫描透镜和管透镜传递，将此时已扩束的光束投射到物镜后孔径上。

第二个镜片的运动速度相对于第一个镜片较慢，同时扫描Y轴，从而实现对所示平面上方和下方区域的扫描，并在样品表面形成矩形光栅。与购买 commercially available 显微镜相比，该方案的主要优势在于成本低廉，并且能够根据成像项目的特定需求对仪器进行定制。在使用任何激光器时，采取适当的安全措施以防止眼睛受伤至关重要。

应尽可能佩戴合适的激光防护眼镜。所有非直接参与光路调整或不直接接触光束的旁观者或研究人员均须佩戴防护眼镜。请摘下所有闪亮或反光的手表及珠宝首饰。

最重要的是，务必始终控制光束路径，通过使用光束挡板或固定好的名片来终止光束，确保安全。在调整反射镜时尤其需要注意，因为此时光束路径可能难以预测。此外，切勿使眼睛与光束路径处于同一水平高度。

在组装显微镜之前，如果需要穿过激光束平面，请先关闭激光器。确保所有构建所需的设备均已备齐，包括光学平台和90度支架、所有反射镜、透镜和二向色镜，以及相应的夹具和安装硬件、两个扫描反射镜和光电探测器。准备一个函数发生器也很有帮助，可用于测试扫描动作并在准直过程中调节反射镜。

为了确保稳定性，强烈建议将光学面包板用螺栓固定。开始显微镜的搭建时，先将带尾纤的光纤准直器安装在光学支架中，并将此组件置于光学面包板的中央位置。这对应于图中所示蓝光束的起始点。

打开光源。使用调节螺丝粗略调整光束，使其在水平和垂直方向上均沿直线传播。在光纤准直器前方放置一个光阑。

接下来，调节虹膜的高度，使光束通过中心。然后沿光束路径将虹膜从阿托尔处移开。检查光束的准直情况。

如有需要，使用两个调节螺丝重新调整光束在光圈上的位置。将安装好的二向色镜放入光路中，并使激光束位于镜面中心。旋转镜架，使光束以约90度角反射，同时确保光束高度保持不变。

通过拧紧支架上的螺丝将反射镜固定在桌面上。然后将安装好的谐振式检流计反射镜置于激光光路中，注意确保激光束位于反射镜表面的精确水平中心位置。

旋转镜架，使激光束以90度角反射。然后大致调整镜面反射，以保持激光束的垂直高度不变。接下来，取两个光阑，将其直接放置在谐振振镜前方。

然后以共振振镜反射的激光束作为参考，像之前一样调整其垂直高度。现在以光学面包板上的螺孔作为视觉引导，将两个光阑沿直线夹紧固定。调节光路中的第一面反射镜（即二向色镜），使光束在第一个光阑上居中。

然后调节光路中的第二面反射镜，利用谐振检流计将光束在第二个光阑中心对准。反复迭代调节这两面反射镜，直至光束穿过两个光阑时均实现准直。

确保从谐振振镜反射的激光束仍大致从振镜中心反射。如果光束发生偏移，需调整光纤准直器的安装位置，并重复调整过程，使光束在两个打开的光阑中心通过。下一步是放置两个中继透镜，将第一个固定的远心平面成像到第二个固定的远心平面上。

对于这种显微镜，第一中继系统中选用的透镜具有相同的焦距 F，因此这两个反射镜之间的距离即为四倍焦距（4F）。在此装置中，F 等于 90 毫米，因此 4F 位置距离扫描反射镜为 360 毫米。为确保透镜在光路中精确居中，需将第一个透镜置于光路中，并观察光路中下一个光阑上的激光光斑位置。在放置透镜后，调节透镜的高度，使光束的垂直中心与光阑中心对齐。

接下来，调节水平光束位置，使光束在虹膜上居中。对第二个透镜重复此过程。然后，设置扫描镜，并旋转显微镜，以便于直接放置和对齐原本需要垂直调节的部件。

为了确定第二个远心平面的精确位置，将谐振振镜插入其扫描单元并开启。使用一张名片沿扫描光束经过两个透镜的光路进行追踪。第二个远心平面位于固定振镜约四倍焦距（4F）处，可通过扫描光束呈现静止状态的位置来确定。

用铅笔在面包板的该位置下方做标记。确定远心平面后，将扫描镜输入设置为零伏，并启动镜片控制硬件，使镜片稳定在其中性位置。然后将标准扫描振镜精确放置在远心平面的位置。

调整反射镜位置，使tele平面上的光束精确照射到扫描镜的中心，并拧紧镜片支架。然后松开固定gal镜的锁紧螺丝并旋转该镜，确保光束垂直传播。随后关闭激光器和扫描电子设备。

断开光纤并断开扫描镜。然后使用 90 度光学平台安装支架，将第二块光学平台固定到第一块上。

最后，小心旋转整个显微镜，使新的面包板处于水平位置，并使用夹具将显微镜固定到位。在此处重新连接扫描振镜（gal o）和激光器，并记得将扫描振镜（gal O）调回零电压。 formerly 垂直设置的其余部分可轻松在水平面包板上完成。

接下来，我们将设置第二组中继透镜，正式称为扫描透镜和管透镜。有关选择合适透镜组合的重要信息，请参见随附的书面实验方案。首先开始安装透镜。

首先，布置好用于引导光束至物镜的反射镜。将第一块较大的两英寸反射镜放置在光学平台边缘附近，旋转镜架，使激光束大致偏转约90度。调节镜面反射，以保持光束的垂直高度不变。

然后将另一面两英寸的反射镜放置在面包板的对边，使光束偏转90度，并使用调节螺丝将其固定。接下来，安装两个光阑，并像之前一样调节两个反射镜，使光束居中。随后，将扫描透镜放置在光路中，使其与检流计之间的距离等于透镜的焦距，并调节其水平和垂直位置。

将激光光斑居中对准位于两个反射镜之间的第一个光阑。小心地将直径为两英寸的大型管镜放置在距扫描镜适当距离的位置，并调整其水平和垂直位置，使光束在第一个光阑处居中。在此装置中，管镜放置在距离为75毫米加上300毫米的位置，所有组件均已安装到位。

将gal O连接至标准电学函数发生器或控制电路的输出端，并将峰峰值电压设置为1至3伏。然后使用名片开始扫描两个反射镜。在管镜后方300毫米处的固定平面上定位激光束。

将物镜置于光路中，并确保物镜的后光阑尽可能靠近固定平面。安装样品台时，需确保可移动的 Z 轴载物台在全行程移动过程中不会与物镜支架发生碰撞。进行共聚焦系统的设置时，首先断开所有电源和光纤连接，然后安装针孔和探测器。

将显微镜组件旋转，使其再次放置在面包板上，并固定住共振扫描镜。在重新连接光纤与准直器、标准扫描镜以及电源、供电和控制电缆后，像之前一样在控制电压端施加0伏电压以驱动标准检流计扫描镜，在载物台上放置一个由两片盖玻片夹住的高亮度染料样品。然后打开激光光源，并将染料调至焦点。

使用一张名片调整激光功率，使荧光尽可能明亮。追踪样品发出的荧光，从物镜经扫描系统到达二向色镜，该二向色镜反射激光束并透射荧光信号。在二向色镜的另一侧找到该荧光信号。

现在调暗房间的灯光。将一面镜子放置在二向色镜后方，以将发射光以90度角反射。然后使用带有镜子的可调光阑，将荧光光束尽可能笔直且与光学平台平行地引导。

接下来，将使用 Thor Labs 的空间滤光片笼式安装组件来搭建共聚焦针孔单元。该示意图概述了装置结构。扫描镜位于与固定物镜共轭的静止平面上。

在固定平面之间，用于中继扫描光束的透镜组构成后焦阑平面镜对。第一组透镜具有相等的焦距，形成一个1:1的望远系统。第二组透镜正式称为扫描透镜和管镜，其焦距不必相等，通常用作扩束望远系统，以确保物镜的后焦阑被充分充满。

从样品发出的光经扫描系统返回，并透过二向色镜。短焦透镜或物镜将发射光聚焦通过共聚焦针孔，随后由透镜进行准直。最后一片透镜将经过共聚焦滤波的发射光聚焦到光电倍增管上。

将空间滤波单元置于发射光路中，并注意使第一个聚焦透镜支架与发射光束中心对齐。本实验中选用了一个针孔尺寸为 100 微米的空间滤波单元。接下来，在单元中安装一个短焦距透镜，并滑动 Z 轴平移支架，直至在针孔表面观察到清晰的聚焦光斑。

确保整个装置沿荧光光束设定的直线方向对齐。将装置固定在光学平台上。现在使用平移台的调节旋钮，调节两个轴，对针孔安装面进行二维搜索，以找到荧光信号通过针孔时达到最大的位置。

接下来，将镀膜透镜安装到笼式支架上，在针孔之后使用一张名片，找到穿过共聚焦单元的荧光离子，并沿支架滑动镀膜透镜，直至发射的荧光尽可能准直。安装光电倍增管组件。在荧光发射光路中放置一个焦距为50毫米的透镜，并找到其焦点位置。

在面包板上标记此位置。现在完全关闭激光器，并将光电倍增管放置到位，使其窗口尽可能靠近已标记的焦点位置。然后使用可调透镜管，将组件连接至聚焦透镜。

在针孔之后所有暴露的光路周围包裹深色胶带，开启激光器，并将其功率保持在极低水平。小心开启光电倍增管，并在示波器上读取其电压。逐渐增加激光强度，同时提高电压，直至在示波器屏幕上观察到尖峰状信号和/或直流偏移。

通过关闭激光功率或阻断光束路径以观察信号消失，确认该信号确实来源于荧光。最后，反复调整针孔位置，使示波器上的信号达到最强。首先调节聚焦透镜的 Z 轴位置，然后调整 YZ 平移台，至此完成视频速率显微镜硬件的调试。

首先，关闭光电倍增管。然后按照随附书面方案中的示意图连接镜面定制控制板和计算机。该系统可适用于进行共聚焦扫描显微内窥镜检查。

通过将载物台更换为光纤夹持载物台，请参见 accompanying text 或详细说明。组装完成的直立共聚焦扫描显微镜和微型内窥镜应如图所示。激光束和发射光束已用示意图形式标出，以方便观察。

在微内窥镜操作过程中，光纤支架用于在实验中固定成像光纤。该光纤支架可根据需要轻松替换为XY位移台。此处所示的直立显微镜平台图像，是使用视频速率图像采集卡从输入信号生成的代表性测试图像，样本为一张白底商务名片上打印的小写字母“m”。已漂白。

白纸含有荧光物质，这些物质容易被紫外光和蓝光激发，从而在暗背景后产生明亮的背景。选择字母 M 和中心波长为 515 纳米的发射滤光片来收集这种荧光发射。可以观察到图像存在轻微畸变，尤其是在图像帧的侧边缘附近。

这种失真是由八千赫兹 GVO 扫描镜的正弦扫描模式引起的，在随附文档中有详细讨论。本视频展示了通过扫描一张名片所获得的视频帧率数据。观看此视频后，您现在应该对如何搭建和调试视频帧率共聚焦扫描显微镜有了深入的理解。

请务必注意，使用激光光源可能具有极高的危险性，在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如摘除所有反光的首饰，并避免在眼睛与光束水平的位置进行操作。