Name: 视频率扫描共聚焦显微镜和内窥镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 学习使用标准现成组件构建视频率扫描共聚焦显微镜和内窥镜系统的方法。该方案成本低廉且可灵活定制，适用于神经科学和生物物理学领域的实时成像研究。

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作者感谢ThorLabs对本项目的支持。AJN希望感谢美国国家科学基金会研究生奖学金提供的支持。
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）通过NIH主任新创新者奖计划资助，资助编号为1 DP2 OD007096-01。有关新创新者奖计划的信息，请访问<a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a>。作者谨此感谢Tom Hayes提供使用哈佛大学电子实验室的机会。

<ol><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Springer Verlag. 985-985 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li>
<li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li>
<li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li>
<li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li>
<li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+%28Cell-viZio%29+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li>
<li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Endoscopica%22%5BJournal%5D)">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li>
<li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li>
<li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+optics%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li>
</ol>

本视频的制作由Thorlabs, Inc.赞助。

该视频速率成像系统采用一个工作频率约为8 kHz的谐振检流计镜。谐振镜在满功率运行时可能产生较大噪音，其高音调在足够长时间暴露下可能令人不适甚至有害。尽管此处未作演示，但仍建议将谐振检流计镜置于透明外壳内，以显著降低系统噪声，和/或佩戴适当的听力保护装置（如耳塞）。
共振振镜以正弦波模式进行扫描。然而，图像采集卡在读取信号时，假设水平和垂直方向的扫描速度完全呈线性。由于正弦扫描在扫描范围边缘处速度变慢，因此在快速（水平）图像轴上可能出现图像压缩伪影。减小该问题的一种方法是，有意将共振振镜的扫描范围驱动得显著大于中继透镜的直径。通过这种方式，仅有正弦扫描模式中接近线性的中央扫描区域通过样品，从而最小化图像畸变。另一种方法是对采集的图像进行后处理，以实现快速轴的线性化。这可以通过对一个已知的荧光图案（例如网格）成像，并利用该已知图案的尺寸信息编写图像处理脚本，对采集的图像进行去扭曲来实现。
该特定扫描系统专为体内成像而设计，此类成像通常需要直立取向的视频速率显微镜。对于细胞成像实验，更常使用倒置显微镜。此处介绍的设计可轻松改造为构建此类倒置显微镜，仅需旋转最终直径为2英寸的反射镜即可。无需将反射镜定向以使扫描光束向下传播，而是可将其调整为向上反射光束。将物镜与样品台置于距反射镜相同距离的位置，即可实现倒置光路结构下的成像。若成像系统仅用于微型内窥镜成像，则完全无需在垂直方向上折叠显微镜设计。相反，整个扫描系统可构建于同一水平光学平台之上，物镜方向与光学台面平行。
请注意，本构建中使用的显微镜采用固定的针孔配置；虽然这种设计可最大程度地简化构建过程并便于对准，但对于希望获得更高灵活性的用户，可考虑采用可变针孔，如同大多数商用共聚焦显微镜中所配备的那样。通过允许用户调节针孔大小以适应不同发射光强度的样品，可更有效地优化特定样品在信号强度与分辨率之间的权衡。
为显微镜选择的光纤成像束至关重要。我们推荐使用住友（Sumitomo）相干光纤，因其光纤芯间距紧密且相对自体荧光较低。已发现藤仓（Fujikura）制造的光纤具有较强的自体荧光10，可能掩盖样品微弱的荧光信号，从而限制微型内窥镜的最终灵敏度。住友公司生产的光纤（例如本实验装置中使用的8-30N型号）其自体荧光水平明显低于藤仓同类产品。尽管拉丝式光纤束在微型内窥镜应用中可能具有吸引力，但其设计通常使单根光纤芯之间的间距过大，导致对物体的采样稀疏，遗漏大量潜在感兴趣的区域。
最后需要指出的是，尽管本文所述显微镜在多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用中均具有实用价值，且其成本仅为功能齐全的商业系统的很小一部分，但它不具备透射光检测、目镜观察或非共聚焦宽场落射荧光的光路等功能。虽然理论上可以从零开始构建包含这些功能的系统，但希望获得此类系统的读者可能更倾向于改造现有的商业系统以满足其需求，而非从头开始全新搭建。

<table><tbody><tr><td>515 nm 带通滤光片</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>HQ515/50M</td><td>46 FWHM</td></tr><tr><td>消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 50 mm 焦距，MgF₂ 涂层</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT49-766</td><td></td></tr><tr><td>消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 76.2 mm 焦距，MgF₂ 涂层</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT49-768</td><td></td></tr><tr><td>消色差双合透镜，25.4 mm 直径 × 88.9 mm 焦距，MgF₂ 涂层</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT49-769</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 直径 x 300 mm 焦距氟化镁（MgF2）镀膜消色差双合透镜</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT45-179</td><td></td></tr><tr><td>8 kHz R 高频光学扫描仪</td><td>Electro-Optical Products Corporation (EOPC)</td><td>SC-30</td><td>8 kHz</td></tr><tr><td>AGC 驱动器</td><td>Electro-Optical Products Corporation (EOPC)</td><td>ACG：8K</td><td></td></tr><tr><td>H7422-PA 光电传感器模块</td><td>滨松公司</td><td>H7422-PA</td><td>建议限流</td></tr><tr><td>M9012 电源</td><td>滨松公司</td><td>M9012</td><td>适用于 H7422-PA 的使用</td></tr><tr><td>HC PL APO CS物镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506284</td><td>10x/0.40</td></tr><tr><td>Solios eA/XA 图像采集卡</td><td>Matrox</td><td>Solios eA/XA</td><td>需要 MIL 软件； &amp;#8211;M互连建议</td></tr><tr><td>12V 电源供应器</td><td>明纬</td><td>LPV-100-12</td><td>+12V，8.5A</td></tr><tr><td>5x 显微镜物镜</td><td>Newport Corp.</td><td>M-5X</td><td>0.10 NA，25.4 mm 焦距</td></tr><tr><td>相干成像光纤</td><td>住友电木有限公司</td><td>8-30N</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot;-20 内六角螺钉及五金套件</td><td>Thorlabs 公司</td><td>HW-KIT2</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 装载针孔</td><td>Thorlabs 公司</td><td>P100S</td><td>适用于构建空间滤波器</td></tr><tr><td>30 mm 笼式立方体夹具</td><td>Thorlabs 公司</td><td>B6C</td><td></td></tr><tr><td>30 mm 笼系统立方连接器，四通</td><td>Thorlabs 公司</td><td>C4W</td><td></td></tr><tr><td>406 nm，5 mW，B类PIN码，单模光纤尾纤激光二极管，FC/PC接口</td><td>Thorlabs 公司</td><td>LPS-406-FC</td><td>产品已停产，由 LP405-SF10 取代</td></tr><tr><td>5分钟环氧树脂，1盎司</td><td>Thorlabs 公司</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>6轴运动学光学支架</td><td>Thorlabs 公司</td><td>K6X</td><td></td></tr><tr><td>8-32内六角螺钉及紧固件套装</td><td>Thorlabs 公司</td><td>HW-KIT1</td><td></td></tr><tr><td>8-32 内六角螺钉及配件套装</td><td>Thorlabs 公司</td><td>HW-KIT3</td><td></td></tr><tr><td>带外置RMS螺纹和内置SM1螺纹的转接器</td><td>Thorlabs 公司</td><td>SM1A4</td><td></td></tr><tr><td>调整式FC/PC和FC/APC准直器，焦距 = 2.0 mm，增透膜：400–600 nm</td><td>Thorlabs 公司</td><td>CFC-2X-A</td><td>f = 2.0 mm</td></tr><tr><td>可调光纤准直器适配器，SM1 螺纹</td><td>Thorlabs 公司</td><td>AD9.5F</td><td></td></tr><tr><td>铝制光学平台，12&quot; × 18&quot; x 1/2&quot;</td><td>Thorlabs 公司</td><td>MB1218</td><td>1/4&quot;-20 螺纹</td></tr><tr><td>台式激光二极管/热电冷却器控制器</td><td>Thorlabs 公司</td><td>ITC4001</td><td>1 A/96 W</td></tr><tr><td>DMLP 425 nm 长波通二向色镜</td><td>Thorlabs 公司</td><td>DMLP425</td><td></td></tr><tr><td>用于1的运动学支架&quot; 光学</td><td>Thorlabs 公司</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>ThorLabs 光纤耦合激光二极管的 LD/TEC 安装座</td><td>Thorlabs 公司</td><td>LM9LP</td><td></td></tr><tr><td>18 mm光学元件镜头安装座</td><td>Thorlabs 公司</td><td>LMR18</td><td>包含一个卡环</td></tr><tr><td>用于2的镜头支架&quot; 光学</td><td>Thorlabs 公司</td><td>LMR2S</td><td>带有内螺纹和外螺纹；包含固定环</td></tr><tr><td>迷你系列笼具组装杆，6 根&quot; 长，4 mm，数量 1</td><td>Thorlabs公司</td><td>SR6</td><td></td></tr><tr><td>1.0&quot; 带8-32螺纹孔的立柱支柱&quot; 长</td><td>Thorlabs 公司</td><td>RS1P8E</td><td></td></tr><tr><td>1&quot; 支柱延长段，长度=0.5</td><td>Thorlabs 公司</td><td>RS05</td><td></td></tr><tr><td>1&quot; 支柱延长段，长度=0.75&quot;</td><td>Thorlabs 公司</td><td>RS075</td><td></td></tr><tr><td>1&quot; 受保护银镜，3.2 mm 厚</td><td>Thorlabs 公司</td><td>ME1-P01</td><td></td></tr><tr><td>1&quot; SM1 旋转可调聚焦元件，L = 1&quot;</td><td>Thorlabs 公司</td><td>SM1V10</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; 保护型银镜，3.2 mm 厚</td><td>Thorlabs 公司</td><td>ME2-P01</td><td></td></tr><tr><td>P100S - 100 &amp;mu;m 聚焦针孔</td><td>Thorlabs 公司</td><td>P100S</td><td></td></tr><tr><td>Polaris 低漂移 1&quot; 运动学镜架</td><td>Thorlabs 公司</td><td>POLARIS-K1</td><td>低漂移</td></tr><tr><td>SM1透镜管，L = 1&quot;</td><td>Thorlabs 公司</td><td>SM1L-10</td><td>包含一个卡环</td></tr><tr><td>SM1螺纹30毫米笼板，0.35&quot; 厚</td><td>Thorlabs 公司</td><td>CP02</td><td></td></tr><tr><td>SM1至M25光学元件螺纹转接器</td><td>Thorlabs 公司</td><td>SM1A24</td><td>外螺纹 SM1 和内螺纹 M25.5×0.5</td></tr><tr><td>小光束直径振镜系统</td><td>Thorlabs 公司</td><td>GVSM001</td><td></td></tr><tr><td>小型夹持叉</td><td>Thorlabs 公司</td><td>CF125</td><td>1/25&quot; 沉头槽，通用型</td></tr><tr><td>空间滤波系统</td><td>Thorlabs 公司</td><td>KT310</td><td>针孔单独出售</td></tr><tr><td>5.6 的热电冷却安装座 &amp;和 9 mm 激光器</td><td>Thorlabs 公司</td><td>TCLDM9</td><td></td></tr><tr><td>面包板垂直支架</td><td>Thorlabs 公司</td><td>VB01</td><td>每个</td></tr><tr><td>平场复消色差物镜</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>1101-957</td><td>20x/0.75 数值孔径</td></tr></tbody></table>

视频速率扫描共聚焦显微成像与微型内窥显微技术

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

共聚焦显微镜已成为生物学和生物医学科学中不可或缺的工具，能够对复杂系统进行快速、高灵敏度和高分辨率的光学切片。例如，共聚焦显微镜常规用于研究特定的细胞靶标1，监测活细胞内的动态过程2-4，以及可视化整个生物体的三维发育过程5,6。共聚焦成像系统的扩展技术，如共聚焦微内窥镜，可在体内实现高分辨率成像in vivo7，目前正被应用于临床环境中的疾病成像与诊断8,9。
共聚焦显微镜利用简单的几何光学原理，通过生成所谓的“光学切片”来实现三维分辨率。在标准的宽场显微镜中，样品发出的荧光由物镜收集并直接传递至探测器。这种方法适用于薄样品的成像，但对于厚样品，来自物镜焦平面上方和下方的荧光会导致图像模糊。相比之下，共聚焦显微镜能够实现虚拟的光学切片，通过抑制非焦平面的杂散光，构建出样品高分辨率的三维图像。
共聚焦显微镜通过在检测光路中使用共聚焦孔径来实现这一功能。物镜从样品收集的荧光信号经扫描镜反射后，穿过主二向色镜；该二向色镜经过精心选择，可反射较短波长（如激光激发光），同时透射较长波长的斯托克斯位移后的荧光发射光。随后，这一长波长荧光信号被传递至位于针孔两侧的一对透镜，该针孔的位置恰好处于与物镜焦平面共轭的平面上。来自样品焦体积的光子被物镜准直后，再由共聚焦透镜聚焦并通过针孔。而来自焦平面上方或下方产生的荧光则无法被正确准直，因而不能通过共聚焦针孔1，从而形成光学切片，使得只有来自显微镜焦点处的光可见。（图1）因此，针孔实际上在焦平面上起到一个虚拟孔径的作用，将检测到的发射光限制在唯一一个有限的空间位置。
现代商用共聚焦显微镜为用户提供全自动操作，使以往复杂的成像流程变得相对简单且易于实施。尽管这些系统具有高度灵活性和强大功能，但商用共聚焦显微镜并不适用于所有共聚焦成像任务，例如许多 在体 成像应用。如果无法构建满足其需求的定制化成像系统，许多重要的实验将难以实现。
本文提供了一种从基础部件完整构建定制化视频速率共聚焦成像系统的逐步方法。将采用振镜式共振扫描镜作为快速扫描轴，构建正置显微镜，而慢速扫描轴则使用标准速度的振镜式共振扫描镜。为了在物镜焦点处形成精确的扫描光束，这些扫描镜将通过四片中继透镜被放置在所谓的远心平面位置。共聚焦检测将使用现成的标准光电倍增管（PMT）实现，图像则通过Matrox图像采集卡及其配套软件进行采集与显示。

本文描述了一种定制的实时共聚焦扫描成像系统的完整构建方法。该系统可轻松用于视频速率显微镜和显微内窥镜检查，能够实现多种标准商用共聚焦系统无法达到的成像几何结构和应用，且成本仅为后者的一小部分。

共聚焦显微镜已成为生物学和生物医学科学中不可或缺的工具，能够实现快速、高灵敏度和高分辨率的光学成像……

本视频演示了如何使用标准的现成组件构建视频速率扫描共聚焦显微镜。扫描共聚焦显微镜依赖于两个扫描镜的协调运动，以将光束在光栅平面上进行扫描。来自第一面扫描镜的光首先在第一组中继透镜上水平扫描，该透镜将其重新聚焦到第二面扫描镜上的一个固定点。随后，相同的扫描运动通过扫描透镜和镜筒透镜传递，将此时已扩束的光束投射到物镜的后孔径上。第二个镜片的运动速度相对于第一个镜片较慢，同时扫描Y轴，从而实现对图示平面上方和下方区域的扫描，并在样品表面形成矩形光栅。与购买 commercially available 显微镜相比，该方案的主要优势在于成本低廉，并且能够根据成像项目的特定需求对仪器进行定制。在使用任何激光器时，采取适当的安全措施以防止眼睛受伤至关重要。应尽可能佩戴合适的激光防护眼镜。所有未直接参与光路调整或未在光束附近工作的旁观者或研究人员，均须佩戴防护眼镜。请摘下所有闪亮或反光的手表及珠宝首饰。最重要的是，务必始终通过使用光束挡板或安装的名片来终止光束路径，从而确保对光束的跟踪和控制。在调整反射镜时尤其如此，因为此时光束的传播路径可能难以预测。此外，切勿使眼睛与光束路径处于同一水平高度。在组装显微镜之前，若需穿过激光光路平面，请先关闭激光器。确保所有构建所需的设备均已备齐，包括光学平台和90度支架、所有反射镜、透镜和二向色镜，以及相应的夹具和安装硬件、两个扫描反射镜和光电探测器。准备一个信号发生器也很有帮助，可用于测试扫描动作并在准直过程中调节反射镜。为了确保稳定性，强烈建议将光学面包板用螺栓固定。开始显微镜的搭建时，先将带尾纤的光纤准直器安装在光学支架上，并将此组件置于光学面包板的中央位置。这对应于图中所示蓝色光束的起始点。打开光源。使用调节螺丝粗略调整光束，使其在水平和垂直方向上均沿直线传播。在光纤准直器前方放置一个光阑。接着，调节虹膜的高度，使光束通过中心。然后将虹膜沿光路从阿托尔处移开。检查光束的准直情况。如有需要，使用两个调节螺丝重新调整光束在虹膜上的位置。将安装好的二向色镜置于光路中，并使激光束位于镜面中心。旋转镜架，使光束以约90度角反射，同时确保光束高度保持不变。通过拧紧支架上的螺丝将反射镜固定在桌面上。然后将安装好的谐振式检流计反射镜置于激光光路中，注意确保激光束位于反射镜表面的精确水平中心位置。旋转镜架，使激光束以90度角反射。然后大致调整镜面反射，以保持激光束的垂直高度不变。接下来，取两个光阑，将其直接放置在谐振扫描振镜前方。然后以共振振镜反射的激光束作为参考，像之前一样调整它们的垂直高度。现在以光学面包板上的螺孔作为引导，目视将两个光阑沿直线夹紧固定。调节光路中的第一面反射镜（即二向色镜），使光束在第一个光阑上居中。然后调节光路中的第二面反射镜，利用共振振镜将光束中心对准第二个光阑。反复调节这两面反射镜，直至光束穿过两个光阑的中心。确保从谐振振镜反射的激光束仍从近似镜面中心反射。如果光束发生偏移，调整光纤准直器安装座，并重复调节，使光束在两个打开的光阑中心通过。下一步是放置两个中继透镜，将第一个固定的物方远心平面成像到第二个固定的物方远心平面上。对于这台特定的显微镜，第一中继系统中选用的透镜具有相同的焦距 F，因此此处两面反射镜之间的距离即为四倍焦距（4F）。在此光路配置中，F 等于 90 毫米，因此 4F 位置距离扫描反射镜为 360 毫米。为确保透镜在光路中精确居中，将第一个透镜置于光路中，并观察光路中下一个小孔光阑上的激光光斑位置。随后调节透镜的高度，使光束的垂直中心与小孔光阑的中心对齐。接下来，调节水平光束位置，使光束在虹膜上居中。使用第二个透镜重复此过程。然后，设置扫描镜，并旋转显微镜，以便于直接放置和对齐原本需要垂直调节的部件。为了确定第二个物方远心平面的精确位置，将谐振振镜 G 放入其扫描单元并开启。使用一张名片沿扫描光束经过两个透镜的路径进行追踪。第二个物方远心平面位于振镜 G 所在位置约四个焦距处，可通过扫描光束看起来静止不动的位置来确定。用铅笔在面包板上标记此位置。确定tele centric平面后，将扫描镜输入设为零伏，启动镜片控制硬件，使镜片稳定在其中性位置。然后将标准扫描galil镜片置于tele平面的精确位置。调整反射镜位置，使tele平面上的光束照射到扫描镜的正中心，并拧紧镜架。然后松开固定gal镜的锁紧螺丝并旋转gal镜，确保光束垂直传播。最后关闭激光器和扫描电子设备。断开光纤并断开扫描镜。然后使用90度面包板安装支架，将第二块面包板固定到第一块上。最后，小心地旋转整个显微镜，使新的面包板平放，并使用夹具将显微镜固定在位。在此处重新连接检流计镜（gal o）和激光器，并记得将检流计镜（gal O）调回零电压。 formerly 垂直设置的其余部分可轻松在平放的面包板上完成。接下来，我们将设置第二组中继透镜，正式称为扫描透镜和管镜。有关选择合适透镜组合的重要信息，请参见随附的书面实验方案。首先开始安装透镜。首先，布置好用于引导光束至物镜的反射镜。将第一块较大的两英寸反射镜放置在光学平台边缘附近，旋转镜架，使激光束大致偏转约90度。调节镜面反射，以保持光束的垂直高度不变。然后将另一面两英寸的反射镜放置在面包板的对边，使光束偏转90度，并使用调节螺丝将其固定。接下来，安装两个光阑，并像之前一样调节两个反射镜，使光束居中。随后，将扫描透镜放置在距检流计（gal）焦距距离的光路位置，并调节其水平和垂直位置。将激光光斑对准位于两个反射镜之间的第一个孔径光阑中心。小心地将直径为两英寸的大管镜放置在距离扫描透镜适当的位置，并调节其水平和垂直位置，使光束在第一个孔径光阑上居中。在此装置中，管镜放置的距离为75毫米加上300毫米。所有组件均已就位。将gal O连接至标准电学函数发生器或控制电路的输出端，并将峰峰值电压设置为1至3伏。然后使用一张名片开始扫描两个反射镜。在管镜后300毫米的固定平面上定位激光束。将物镜置于光路中，并确保将物镜的后光阑尽可能靠近固定平面。安装样品台时，需确保可移动的 Z 轴支架在全行程范围内移动时不会与物镜支架发生碰撞。配置共聚焦系统时，首先断开所有电源和光纤连接，然后设置针孔和探测器。将显微镜组件旋转回面包板上，使其再次固定在谐振扫描镜上。重新连接光纤与准直器、标准扫描镜以及电源、供电和控制电缆后，在控制标准扫描检流计的驱动电压上施加 0 伏特，如同之前在载物台上操作一样，将一片由两片盖玻片夹持的高亮度染料样品放置到位。然后打开激光光源，并将染料样品调至焦点。使用一张名片调整激光功率，使荧光尽可能明亮。从样品处开始，沿着物镜、扫描系统追踪荧光发射，直至二向色镜，该镜面可反射激光束并透射荧光发射。在二向色镜的另一侧找到该荧光信号。现在调暗房间灯光。在二向色镜后方放置一面反射镜，将发射光以90度角反射。然后使用带有反射镜的可调光阑，将荧光光束尽可能平行且笔直地引向光学平台。接下来，将使用 Thor Labs 的空间滤光片笼式安装组件来搭建共聚焦针孔单元。该示意图概述了装置结构。扫描镜位于与固定物镜呈远心关系的静止平面上。在固定平面之间，用于传递扫描光束的后焦孔径透镜组成对出现。第一对透镜具有相等的焦距，构成一个1:1的望远镜系统。第二对透镜正式称为扫描透镜和管镜，其焦距不必相等，通常作为一个扩束望远镜，以确保物镜的后焦孔径被充分填充。从样品发出的光经扫描系统返回，并透过二向色镜。短焦透镜或物镜将发射光聚焦通过共聚焦针孔，随后由透镜准直，最终由另一透镜将经过共聚焦滤波的发射光聚焦至光电倍增管上。将空间滤波单元置于发射光束路径上，并注意将第一个聚焦透镜支架对准发射光束中心。本实验中选用了一个针孔尺寸为 100 微米的空间滤波单元。接下来，在单元内安装一个短焦距透镜，并滑动 Z 向平移支架，直至在针孔表面观察到清晰的聚焦光斑。确保整个装置沿荧光光束设定的直线方向对齐。将装置固定在光学平台上。现在使用平移台上的调节旋钮，调节两个轴，对针孔安装面进行二维扫描，以找到针孔透过的荧光信号最强的位置。接下来，将镀膜透镜安装到笼式支架上。使用一张名片作为针孔，在共聚焦单元中寻找通过的荧光离子，并沿立柱滑动镀膜透镜，直至发射的荧光尽可能准直。组装光电倍增管装置。在荧光发射光路中放置一个焦距为50毫米的透镜，并找到其焦点位置。在面包板上标记此位置。现在完全关闭激光器，并将光电倍增管放置到位，使其窗口尽可能靠近已标记的焦点位置。然后使用可调透镜管，将组件连接至聚焦透镜。在针孔之后的所有暴露光路周围包裹深色胶带，开启激光器，并将其功率保持在极低水平。小心开启光电倍增管，并在示波器上读取其电压。逐渐增加激光强度，同时提高电压，直至在示波器屏幕上观察到尖峰状信号和/或直流偏移。通过关闭激光功率或阻断光束路径以观察信号消失，确认该信号确实来源于荧光。最后，反复调整针孔位置，使示波器上的信号达到最大。首先调节聚焦透镜的 Z 轴位置，然后调整 YZ 平移台，至此完成视频速率显微镜硬件的调试。首先，关闭光电倍增管。然后按照随附书面方案中的示意图连接镜面定制控制板和计算机。该系统可适用于进行共聚焦扫描显微内窥镜检查。通过将载物台更换为光纤固定载物台，请参见 accompanying text 或详细说明。组装完成的直立共聚焦扫描显微镜与微型内窥镜应如图所示。激光与发射光束已用作视觉引导示意。在微内窥镜操作过程中，光纤支架用于在实验期间固定成像光纤。该光纤支架可根据需要轻松替换为XY平台。此处所示的正置显微镜平台展示了一个代表性测试图像，该图像是使用视频速率帧采集卡从输入信号生成的，成像对象为一张白色名片上打印的小写字母“m”。已漂白。白纸含有荧光剂，这些荧光剂容易被紫外光和蓝光激发，从而在暗背景后产生明亮的背景。字母 M 和中心波长为 515 纳米的发射滤光片被选用以收集该荧光发射信号。图像中可观察到轻微的畸变，尤其在图像帧的侧边区域更为明显。这种失真是由八千赫兹 gvo 反光镜的正弦扫描模式引起的，在随附的文档中有详细讨论。本视频展示了通过扫描一张名片所获得的视频帧率数据。观看此视频后，您现在应该对如何构建和调试视频帧率共聚焦扫描显微镜有了深入的理解。请务必注意，使用激光光源可能具有极高的危险性，在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如摘除所有反光的首饰，并避免在眼睛与光束水平的位置进行操作。

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生物工程

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