从血培养中检测细菌病原体及进行抗菌药物耐药性测试的一日工作流程方案

本实验的总体目标是比传统方法更快速地鉴定并评估血培养分离物的抗生素敏感性。首先鉴定血培养分离物，然后采用一种新型的16S核糖体DNA MultiPro PCR检测方法来实现这一目标。

然后将分离菌株与一组抗生素共同孵育6小时。下一步是通过定量16S核糖体DNA PCR检测法，测定在抗生素存在条件下分离菌株的生长情况或生长抑制情况。最终结果表明，通过培养与PCR技术相结合的方法，能够更快速地获得血培养分离菌株的鉴定结果及抗生素敏感性试验结果。

与现有方法（例如使用自动化凤凰系统或IIC系统的方法）相比，该技术的主要优势在于无需预先培养，且同一天内即可获得鉴定结果和抗生素药敏试验结果。演示该实验操作的是我们实验室的范迪·汉森（Vandy Hanson）以及GID项目的博士生。取100微升已检测出微生物生长的血培养物，加入含有900微升0.9%氯化钠的反应管中进行稀释。随后将样本在13,400 × g条件下离心5分钟，使细菌沉淀。离心结束后，

Reese，将沉淀重悬于100微升无菌去离子水中。将样品置于4摄氏度保存，以备后续使用。待所有样品准备就绪后，配制实时PCR反应混合液，用于扩增目标细菌特异性的16S核糖体DNA。

使用去离子水将每反应体积调整至 20 微升。在 96 孔 PCR 板中，每孔分装 20 微升 PCR 混合液。然后向每孔加入 5 微升样品，并密封 PCR 板。

接下来，在 ABI Prism 7900HT 实时荧光定量 PCR 系统上运行 PCR。PCR 完成后，首先通过分析设置选项卡将 CT 值分析阈值调整为 0.1，然后将基线校正范围设置为从第 6 个循环开始，至第 15 个循环结束。记录每个样本的 CT 值。

通常可将 PCR 结果判定为阳性的临界值设为 CT 值 35。本示例展示了两组反应体系中大肠杆菌（e coli）感染血培养的鉴定图谱。反应体系中包含了通用 16S 核糖体 DNA 引物，产生了两条扩增曲线，其 CT 值分别为 25.2 和 25.95。

第三条扩增曲线来自针对Coli的特异性探针。其他特异性探针均未产生可检测到的信号。一旦确定病原体，即可进行抗生素敏感性测试。

首先，从阳性血培养中转移五毫升培养液至血清分离管中。将样本在2000 × g 离心10分钟，离心后弃去上清液。然后使用无菌棉签将管中凝胶层的细菌转移至0.9%氯化钠溶液中，直至获得浊度相当于0.5麦氏标准的菌悬液。

这相当于每毫升约1.5 × 10⁸ 个菌落形成单位。接下来，将悬浮液用双倍浓度的Muller Hinton肉汤稀释，以获得每毫升约5 × 10⁵ 个菌落形成单位的浓度。

在已含有50微升/孔抗生素的微孔板中，每孔加入50微升该悬浮液。每个样本需设置阳性生长对照，即用蒸馏水代替抗生素的孔。操作完成后盖好微孔板。

然后将培养板置于37°C下孵育6小时，以促进细菌生长。务必保存一份细菌悬液在4°C下作为阴性生长对照。6小时孵育结束后，将每孔中的内容物及阴性对照样品分别转移至无菌试管中。

在16,000 × g条件下离心5分钟后，移除80 µL上清液，并将沉淀重悬于80 µL无菌去离子水中。使用前将样品用水按1:10比例稀释，用于16S核糖体DNA实时PCR。

使用 IQ cyber green super mix 和 16S 核糖体 DNA 引物配制 PCR 反应液，并分装至 96 孔 PCR 板中，每孔 20 微升。然后向每孔加入 5 微升各样品，密封反应板。

接下来，运行 PCR 以分析结果。首先，计算临界 CT 值。通常，临界 CT 值等于阳性生长对照的 CT 值加上 0.5 倍的阴性生长对照 CT 值减去生长对照的 CT 值。

然而，对于革兰阴性杆菌中的哌拉西林/他唑巴坦和头孢唑啶，以及金黄色葡萄球菌中的阿莫西林、氯唑西林和复方新诺明，或粪肠球菌属中的阿莫西林，其扩增倍数应从0.5调整为0.25。通过将样品的CT值与临界CT值进行比较，可确定各样品中菌株的敏感性或耐药性。

CT 值高于临界值表明敏感，而低于临界值则表明耐药。以下是一个抗生素敏感性扩增曲线图的示例。此前鉴定的大肠杆菌菌株被用于检测对多种抗生素的敏感性，每种抗生素由一条独立的曲线表示。

CT值较低的样本表示在抗生素存在下发生了菌体生长，表明该样本对所测试的抗生素具有耐药性。相反，CT值较高的样本表示未发生菌体生长，表明该样本对所测试的抗生素敏感。一旦掌握该技术，若操作得当，可在九小时内完成检测。