为期一天的血培养的细菌病原体检测和耐药性检测的工作流程计划
July 9th, 2012
病原菌诊断一个简单的为期一天的工作流程方案的设计，使血液感染的快速识别。列入的8个临床相关细菌的目标和其抗生素耐药谱提供的医生就在同一天最初的洞察力，从而导致更充分的治疗。
该程序的总体目标是在比传统方法更短的时间内识别和评估血培养分离株的抗生素敏感性。这是通过首先识别血培养分离株来实现的。使用新型 16 s 核糖体 DNA MultiPro PCR 检测。
然后将分离物与一组抗生素一起孵育 6 小时。下一步是使用定量 16 s 核糖体 D-N-A-P-C-R 测定法确定在抗生素存在下分离物的生长或抑制生长。最终，结果表明，通过这种培养和 PCR 的组合，可以更快地获得血培养分离株的鉴定和抗生素敏感性检测。
与现有方法（例如使用自动化 phoenix 或 IIC 系统的方法）相比，该技术的主要优点是不需要事先培养状态，并且可以在同一天内获得鉴定和抗生素药敏试验的结果。演示该程序的将是来自我们实验室的 Vandy Hanson 和 GID ing 博士生 稀释 100 微升微生物生长阳性的血培养物在含有 900 微升 0.9% 氯化钠的反应管中。然后将样品以 13， 400 倍 G 离心 5 分钟，以在离心后沉淀细菌。
Reese，将沉淀悬浮在 100 微升无菌软化水中。将样品安装在 4 摄氏度下，直到进一步使用。准备好所有样品后，准备实时 PCR 反应混合物，以从目标细菌中扩增特异性 16 s 核糖体 DNA。
使用软化水将体积调节至每次反应 20 μL。在 96 孔 PCR 板中每孔分装 20 μL PCR 混合物。然后向每个孔中加入 5 μL 样品并密封 PCR 板。
接下来，在 A BI Prism 7， 900 HT 实时 PCR 系统上运行 PCR 以分析结果，一旦 PCR 完成，首先使用分析设置选项卡将 CT 分析调整为 0.1。然后缩小基线配置范围以开始第 6 周期并结束第 15 周期。记录每个样品的 CT 值。
将 PCR 结果视为阳性的临界值通常可以设置为 CT 值 35。在本例中，大肠杆菌感染的血培养物的鉴定谱显示在两个反应混合物中。包括通用的 16 s 核糖体 DNA 引物，并生成 CT 25.2 和 25.95 两条扩增曲线。
第三条扩增曲线来自大肠特异性探针。其他特异性探针未产生可检测信号。一旦确定了病原体，就可以进行抗生素检测。
首先将 5 毫升肉汤从阳性血培养物中转移到血清分离管中。离心后，将样品以 2000 倍 G 离心 10 分钟，弃去管中的 supan 试剂。然后使用无菌棉签，将细菌从试管的凝胶层转移到 0.9% 氯化钠中，直到获得浊度为 0.5 McFarland 标准的溶液。
这相当于每毫升 8 个菌落形成单位的 1.5 倍 10 左右。接下来，用双倍浓度 Muller Hinton 稀释悬浮液。两种肉汤的浓度约为 5 乘以 10 至每毫升 5 个菌落形成单位。
将每孔 50 微升悬浮液分装在微量滴定板中，每孔已含有 50 微升精选抗生素。确保使用加水而不是抗生素的井为每个样品包括阳性生长对照。完成后盖上板。
然后将板在 37 摄氏度下孵育 6 小时，以允许细菌生长。确保将等分试样的细菌悬浮液储存在 4 摄氏度作为负生长对照。孵育 6 小时后，将每个孔的内容物和阴性对照样品转移到单独的无菌管中。
离心16， 000 次 5 分钟后。G，去除 80 微升上清液，并将沉淀重新悬浮在 80 微升无菌软化水中。在用水中将样品稀释 1 至 10 分，然后用于 16 秒核糖体 DNA 实时 PCR。
使用 IQ cyber green 超级混合物和 16 s 核糖体 DNA 引物制备 PCR 混合物，然后分装。20 μL/孔，在 96 孔 PCR 板中。然后将每个样品加入 5 微升到孔中并密封板。
接下来，运行 PCR 以分析结果。首先，计算截止 CT 值。一般来说，临界 CT 等于阳性生长对照的 CT 加上阴性生长对照的 CT 减去生长对照的 CT 的 0.5 倍。
然而，对于哌拉西林与他唑巴坦和 CEF 达扎地胺在革兰氏阴性杆中，以及阿莫西林、苯唑西林和甲氧苄啶与磺胺甲噁唑在金黄色葡萄球菌或阿莫西林中。在肠球菌 SPP 中，倍增因子 0.5 应减少到 0.25。可以通过将样品的 CT 与临界 ct 进行比较来确定每个样品中菌株的敏感性或耐药性。
CT 值高于临界值表示易感性，而 CT 低于临界值表示耐药性。下面是一个抗生素敏感性扩增图的示例。测试了之前发现的大肠杆菌菌株对几种抗生素的敏感性，每种抗生素都由一条单独的曲线表示。
CT 值低的样品是在抗生素存在下发生生长的样品，表明对测试的抗生素具有耐药性。相反，高 CT 值表示样本中没有生长，表明一旦掌握了测试的抗生素，就对测试的抗生素敏感。如果执行得当，这项技术可以在 9 小时内完成。
概述
本文介绍了一种用于诊断血流感染中的细菌病原体的一日工作流程。该方法允许快速识别八种临床相关的细菌目标及其抗生素耐药性谱，从而促进及时的治疗决策。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 临床诊断
- 抗生素耐药性
背景
- 血流感染对健康构成重大风险，需要及时诊断。
- 传统的病原体识别方法可能耗时较长。
- 快速识别和药敏性测试对有效治疗至关重要。
- 本研究引入了一种基于PCR的新方法以简化诊断过程。
研究目的
- 开发一种用于血培养中识别细菌病原体的快速工作流程。
- 在同一天内评估分离株的抗生素敏感性。
- 比较这种方法与传统诊断技术的效率。
使用的方法
- 利用16S核糖体DNA MultiPro PCR检测法进行病原体识别。
- 用一系列抗生素对分离株进行孵育以进行药敏性测试。
- 利用定量PCR在抗生素存在下确定生长抑制。
- 使用特定的CT值阈值分析结果以进行药敏性评估。
主要结果
- 该工作流程能够在数小时内完成病原体识别和药敏性测试。
- 结果表明该方法比传统自动化系统更快。
- 成功识别了大肠杆菌及其抗生素耐药性谱。
- 该技术可以在最少的培养要求下高效进行。
结论
- 这种快速诊断工作流程可以显著改善血流感染的患者管理。
- 结合培养和PCR技术可以提高诊断和治疗速度。
- 建议在临床环境中进行进一步验证以确认其有效性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen identification and antimicrobial susceptibility testing within a single workday addresses a critical bottleneck in bloodstream infection management, enabling timely antibiotic therapy decisions. This workflow reduces reliance on prolonged culture-based methods, supporting faster de-escalation or escalation of empiric regimens. By delivering actionable microbiological data in hours rather than days, it enhances predictive confidence in early-stage antimicrobial selection and reduces the risk of inappropriate therapy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of antimicrobial targets by linking pathogen identification with phenotypic susceptibility profiles under controlled conditions.
- Operational Value: Supports mechanistic de-risking of antibiotic candidates through rapid correlation of genetic identification with growth inhibition outcomes.
- Predictive Value: Generates quantitative, threshold-based susceptibility data that inform lead compound prioritization in antibacterial discovery programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, quantitative readout (CT values) for assessing bacterial growth inhibition, enabling reproducible compound screening against clinical isolates.
- Operational Value: Facilitates assay readiness by using directly processed blood culture material, minimizing pre-analytical variability and enhancing throughput.
- Scalability: Compatible with 96-well PCR platforms, allowing parallel testing of multiple antibiotics and isolates for efficient lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical evaluation by using clinically relevant pathogens isolated from blood cultures, improving disease model relevance.
- Mechanistic De-risking: Enables early assessment of antibiotic efficacy against resistant strains, reducing late-stage failure risk in development pipelines.
- Biomarker Alignment: Supports identification of susceptibility-associated genetic signatures through paired genotypic and phenotypic profiling.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the antibacterial discovery continuum from early target validation through lead optimization, providing rapid pathogen characterization and susceptibility profiling to inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid identification of pathogen species and assessment of antibiotic-induced growth inhibition.
- Screening: Delivers standardized, quantitative susceptibility outputs that allow comparison of compound efficacy across multiple clinical isolates.
- Analytics: Generates CT-based growth inhibition data that serve as measurable endpoints for evaluating antibacterial activity and resistance mechanisms.
- Translational Research: Uses pathogens directly from positive blood cultures, enhancing relevance to human infection models and preclinical validity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable diagnostic capability for antibacterial programs, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antibacterial lead selection by providing rapid, phenotype-genotype correlation data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined incubation times, CT thresholds, and controlled growth controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by reducing time-to-susceptibility data from days to hours.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibiotic candidates based on early susceptibility profiles against clinically relevant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular microbiology and real-time PCR assay design and interpretation.
- Dependent on access to quantitative PCR instrumentation with multiplexing and melt curve capabilities.
- Necessitates standardized protocols for blood culture processing, antibiotic panel preparation, and contamination controls.
- Requires adaptation of antibiotic concentrations and incubation times for different pathogen-drug combinations.
- Limited to aerobic and facultative anaerobic pathogens; strict anaerobes may require alternative workflows.
