Name: NK细胞与干细胞技术的RosetteSep套件的人体血液的富集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学习使用RosetteSep试剂盒通过阴性选择法从人体血液中分离高纯度自然杀伤细胞。该方法利用密度梯度离心技术去除非目标细胞，保留未结合抗体的活性NK细胞，适用于免疫学研究和细胞功能分析。

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每种Rosette Sep分离试剂盒均附有详细的实验方案，可在StemCell Technologies网站在线获取1。

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

利用该技术分离的细胞可使用其他细胞分离试剂盒进一步分为不同的细胞群。

<table><tbody><tr><td>用于人自然杀伤细胞的玫瑰花结分离试剂盒</td><td>试剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15065</td><td></td></tr><tr><td>无菌 PBS，1×</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040-058</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS, FBS）</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">添加2% FCS的PBS及Histopaque溶液必须在实验开始前恢复至室温。</td></tr></tbody></table>

利用 stemcell technologies 公司的 rosettesep 试剂盒从人血液中富集自然杀伤细胞

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

自然杀伤细胞（NK细胞）是一类属于先天免疫系统的大型颗粒性细胞毒性淋巴细胞，在抗肿瘤和抗感染免疫中发挥重要作用，同时也参与妊娠早期过程以及移植排斥反应。这些细胞存在于外周血中，可从中分离获得。细胞分离可采用阳性或阴性选择方法。阳性选择使用特异性针对目标细胞表面标志物的抗体，而阴性选择则使用针对除目标细胞外所有其他细胞表面标志物的多种抗体混合物。后一种技术的优势在于目标细胞不会结合抗体，从而降低了非预期细胞活化或分化风险。在本视频方案中，我们演示如何利用StemCell Technologies公司的RosetteSep试剂盒，通过阴性选择法从人外周血中分离NK细胞。该操作包括在机构审查委员会批准的保护人类受试者方案下采集人外周血，并将其与一种抗体混合物共同孵育，该混合物中的抗体可结合除NK细胞外其他所有外周血单个核细胞（如T淋巴细胞、单核细胞等）表面的标志物。该抗体混合物中的抗体还与结合红细胞表面血型糖蛋白A的抗体偶联，因此所有非目标细胞和红细胞将被交联形成复合物。将血液与抗体混合物稀释后，覆盖于Histopaque密度梯度液上并进行离心。NK细胞（&gt;80% 纯度）可于Histopaque与稀释血浆之间的界面处收集。类似原理的抗体混合物也可用于富集其他细胞群体，例如人T淋巴细胞。

自然杀伤细胞是一类数量较少的淋巴细胞。本文展示了如何使用 StemCell Technologies 公司的试剂盒，通过阴性筛选法从人血中分离这些细胞。所获得的细胞具有活性，且未与抗体接触，因此可直接用于多种实验操作。

利用 StemCell Technologies 公司的 RosetteSep 试剂盒从人血液中富集自然杀伤细胞

自然杀伤（NK）细胞是一类属于先天免疫系统的大型颗粒性细胞毒性淋巴细胞，在抗肿瘤和抗感染免疫应答中发挥重要作用……

大家好，我是Christine Beaton。我是加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。今天我将向大家演示如何使用干细胞技术公司的鸡尾酒试剂盒从人血中进行自然杀伤细胞的阴性筛选。我们使用干细胞技术公司生产的这一试剂盒的原因在于，它能够提供极高纯度的细胞，而阴性筛选方法使我们能够获得未与抗体结合的细胞，因此这些细胞不会发生任何意外的反应。Tsep 试剂盒的工作原理是：使用能够与血液中非目标细胞结合的抗体。因此，在我的例子中，T细胞、B细胞、单核细胞，以及会与红细胞上的血型糖蛋白A结合的抗体，他们的做法是将一种针对白细胞的抗体与另一种针对红细胞的抗体连接起来。这样就会形成一个复合物，其中一个不需要的白细胞与多个红细胞结合。由于红细胞的密度高于白细胞，当你把含有血液和抗体的混合液加到密度梯度介质上并进行离心时，红细胞会沉降到离心管底部，并将所有不需要的白细胞一并带下去。因此，在最上层你所收集到的，就是完全未与抗体结合的、纯净或近乎纯净的自然杀伤细胞。现在我们开始从一管人血中分离自然杀伤细胞（NK细胞）。这是一管新鲜采集的、含有肝素钠的血液样本。我将使用Roset ep人NK细胞富集混合液作为梯度液。在实验的后续步骤中，我将使用密度为1.077的10 77组织分离液，并且我还准备了一瓶添加了2%胎牛血清的PBS。在使用前，我会确保这些试剂已升至室温，因为它们平时保存在冰箱中。接下来，我将把整管血液转移至一个50 mL离心管中。因此，由于这是一个真空容器，内部处于真空状态，为了在打开时避免液体飞溅，我会先找到盖子上的小凹槽，然后小心地将其提起，使空气进入试管。当试管内的真空状态被打破后，我就能更轻松地取下盖子。接着，使用一支10 mL的移液器，将试管中的全部血液转移。我预计其中应含有约10 mL的血液。这里我有 9.5 mL 的血液，我将把这全部 9.5 mL 加入到一个 50 mL 的 Falcon 管中。然后装有血液的移液枪头直接放入生物危害袋中，对于离心管，我总是会往里面加入一些漂白剂，盖紧后也放入生物危害袋中。这是在加入抗体混合液之前血液的外观。现在我将抗体混合液加入血液中，因为我大约有9.5毫升血液，而每毫升血液需要加入50微升混合液，所以我将向血液中加入450微升的抗体混合液。然后轻轻混匀，几乎立即就能看到凝集现象的发生。正如你现在所见，已经出现了凝集。因此，不需要的白细胞与红细胞之间的交叉泄漏正在发生。接下来，我将设置一个20分钟的计时器，让试管在生物安全柜中静置20分钟。血液现在已与玫瑰花结形成辅助鸡尾酒溶液共同孵育了20分钟。因此，我将用含胎牛血清的 PBS 对其进行 1:1 稀释。然后，我将此混合液覆盖于两份各 15 mL 的 Histopaque-1077 上。之后，我将把样品放入离心机中离心 20 分钟。我这里有大约10毫升血液加上抗体混合物。接下来，我将加入含有2%胎牛血清的10毫升PBS溶液。这样就实现了1:1的稀释。我需要轻轻混匀，因为正如您所见，当我将 PBS 加入血液时，它们不会立即混合。因此，我只需轻轻混匀即可。现在我得到了等体积的 PBS 与血液混合液，接下来我将把此混合液加入到 15 mL 的组织包（histo pack）中。我将小心地将其覆盖，以避免血液与Histopaque液混合。为此，我不使用会吸走全部血液的25 M移液器，而是使用10毫升的移液器，分多次操作。为了便于覆盖，我将Histopaque液管几乎保持水平状态。我将取少量血液滴入离心管中，然后将其移至组织分离管（histo pack）上方。接着，我会非常缓慢地将血液分层加到组织分离管上。当血液形成一层较好的界面后，实际上就可以开始稍快地加样，同时可缓慢将离心管恢复至垂直位置。现在，我已将全部20毫升血液与抗体混合液及PBS的混合物叠加到两个15毫升的组织分离介质上。如果你观察试管的交界处，会逐渐看到少量红细胞聚集体缓慢沉入密度梯度中，我们将对样本进行离心，以加快这一过程。因此，在20分钟内，所有红细胞将沉降至试管底部。在进行离心操作时，有一个非常重要的要点：需要关闭刹车，因为刹车过快可能会破坏样品成分。因此，我们总是先关闭刹车，然后以 RI 速度离心 20 分钟，让离心机完成其工作。该样品现已离心 20 分钟。因此，我们看到了不同层次的细胞。从试管底部开始，这里聚集着所有红细胞以及我们不感兴趣的其他细胞。其上方有一层清晰的梯度液层，再上方是淡黄色的血浆层。我们今天关注的细胞有两种，其中NK细胞位于梯度层与血浆层之间，呈一层薄薄的白色絮状细胞层。因此，这一层非常非常薄，因为自然杀伤细胞（NK细胞）仅占血细胞的一小部分。现在我将使用无菌的移液管移除此NK细胞层，并将该层转移至一个新的空的50毫升Falcon离心管中。因此，我前往分层界面并将它用移液管吸出。当然，此时细胞非常少。当细胞数量较多时，可以非常干净地获取分层界面，而细胞稀少时则难以做到。根据生产商的建议，应吸取部分带有细胞的梯度层，以避免细胞丢失。因此，只要看到有细胞存在，我就会继续吸取。当所有细胞都被取出后，应能明显看到澄清的试剂与微黄色血浆之间的清晰分界。因此，我认为现在我已经收集到了所有的细胞。从梯度界面来看，在Histopaque与血浆之间的界面上没有看到任何白色絮状物。接下来，我将梯度中可见的所有NK细胞全部取出，转移至一个新的50 mL Falcon离心管中，并立即向管中加入了一些添加了2%胎牛血清的PBS。因此，我将液体补至50毫升，然后离心使细胞沉淀。这将是第一次洗涤。我将重复该步骤第二次，共洗涤细胞两次。此后，细胞即可用于后续任何实验操作，无论是进行细胞培养还是用于流式细胞术染色。你应获得至少80%纯度的NK细胞，甚至更高。采用此方法，我曾达到过98%的纯度。今天，我向您展示了一种利用干细胞技术公司的TS试剂盒从人血中快速且可靠地分离自然杀伤细胞的技术。当然，如果您希望从人、大鼠或小鼠中分离其他类型的细胞，可以使用相应的T细胞分离试剂盒。这些试剂盒适用于T细胞、B细胞，甚至T细胞的亚型等。

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