使用的EpiAirway模型，用于描述长期宿主 - 病原体相互作用
2011年9月2日
此方法允许EpiAirways，初级人类呼吸道上皮组织生长在气 - 液界面，生物有关延长细菌共同培养的表征在体外车型。该方法可用于任何微生物，是经得起长期的合作文化。
以下实验的总体目标是使用 epi 气道模型对不可分型的流感嗜血杆菌或 NTHI 与原代人类呼吸道上皮组织进行长期共培养。这是通过用 NTHI 接种根尖表面以允许细菌粘附并进入组织作为第二步来实现的。每 24 小时用预热的 DPBS 洗涤一次插入物，以模拟正常的粘液流动并去除粘蛋白废物和任何细胞碎片。
接下来，在所需时间点收获组织，并确定总细胞相关或内化 NTHI 的存活率。最后，通过这种方法，可以基于活菌计数评估组织内 NTHI 存活随时间变化的菌株特异性特征。尽管这种方法可以深入了解不可分型的血友流感的长期感染。
它也可以用于其他人类病原体的研究，例如 Moraxella Alis，证明该程序将是 Doin 博士在我的实验室担任博士后研究员。从包装中取出运输板，准备开始实验。用 70% 乙醇喷洒运输板，然后将板放入生物安全柜中。
将 1 毫升 4 摄氏度、epi 气道、维护培养基分装到六孔板的每个孔中。然后撕下胶带后，打开板并取下覆盖 epi 气道插入物的纱布。使用扭转动作，使用镊子从 aros 中释放插入物。
如果需要，将插件放入六孔板的一个孔中。使用无菌棉签小心地从插入物中取出 aros，避免接触膜。确认插件下方没有气泡。
然后将六孔板放入培养箱中。每天按如下方式清洗插入物，用钙和镁预热 DPBS，然后用 DPBS 填充尖端。然后使用无菌镊子，拿起插入物，轻轻地将 200 微升预热的 DPBS 移液到组织上。
然后摇动插入物以均匀分布 DPBS，而不接触组织。接下来，将插件倾斜一定角度，并将 P 1000 移液器吸头靠在将膜固定在插件底部的塑料环上。然后小心吸出缓冲溶液，并将溶液放入冷冻管中以备后用。
最后，吸出基础维持培养基并用 1 毫升新鲜培养基替换。用钙和镁预热更多的 DPBS。将 3 毫升预热的 DPBS 添加到 15 毫升试管中，然后将在巧克力琼脂上过夜的不可分型流感或 NTHI 的单个菌落重悬到试管中。
现在用力涡旋试管至少 10 秒，然后测量光密度。继续添加 NTHI 的单个菌落，直到细菌浓度达到约 0.7 的 OD 600 纳米。接下来，像以前一样用预热的 DPBS 清洗每个 EPI 气道插入物，然后将 28 微升细菌悬浮液添加到每个插入物的顶端表面。
避免接种基础维持培养基。然后将板放回培养箱中以定量 NTHI，首先预热，然后将干巧克力琼脂板表面化。接下来，使用含有 0.1% 明胶或 PBSG 的无菌 PBS 连续稀释 NTHI 接种物。
将 10 微升等分试样的接种物滴到板上，然后在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育板过夜。第二天，通过计算每滴中具有 15 至 30 个不同菌落的稀释液来确定每毫升的 CFU，并计算回您实际的 NTHI 活接种物以收获总细胞相关细菌。用 200 微升不含钙或镁的 DPBS 冲洗 epi 气道的顶端表面 3 次。
然后倾斜插入物并冲洗基底膜上剩余的维护培养基。将洗涤过的插入物放入新鲜的六孔板中，并将 250 微升无菌 1% 皂苷溶液添加到每个组织的顶端表面。在培养板孵育期间，将板放回培养箱中 10 分钟。
设置用于连续稀释的试管，用 900 微升 PBSG 填充每个稀释管。接下来，用 P 1000 移液器吸头来回擦洗膜上的组织，然后以圆周运动从插入物的边缘去除组织。然后使用无菌大口径 P 1000 移液器吸头，将悬浮液放入空的 1.5 ml 浓度管中。
现在将 250 微升 DPBS 添加到插入物的顶端表面，然后使用倒置相差显微镜检查插入物，以确定是否有任何组织需要收获。将悬浮液添加到安底管中，并在顶部大力加入 500 微升 DPBS。涡旋细胞悬液 1 分钟。
然后使用装有 26 号针头的无菌 1 毫升注射器。通过针头将悬浮液吸入注射器中。将悬浮液缓慢地穿过针头 3 次，注意不要产生气泡。
然后用力涡旋悬浮液再波动一分钟。接下来，使用大口径移液器吸头将 100 μL 悬浮液转移到第一个稀释管中。用力涡旋试管 5 秒钟，然后将稀释液制成 1 到 10 个连续滴板，将稀释液滴在巧克力琼脂板上。
然后将板在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育过夜，以使活细菌计数以收获内化细菌。仅用 200 微升 DPBS 洗涤每个插入物 3 次。用每毫升含有 100 μg 硫酸庆大霉素的培养基替换基础维持培养基，然后在根尖表面加入 300 μL 含有庆大霉素的维持培养基。
将插入片段放回培养箱中 1 小时，同时将插入片段孵育，预热一些 DPBS。然后从顶端表面去除含有庆大霉素的维持培养基。接下来，用预热的 DPBS 充分清洗插入物的顶端表面和基底膜。
最后，重复刚才演示的擦洗和收获程序，然后对本图中的内化细菌进行连续稀释和铺板。比较左侧未感染的 epi 气道组织的扫描电子显微镜图像与右侧 5 天 NTHI 感染的 epi 气道组织的扫描电子显微镜图像。可以看出，与 NTHI 长期共培养不会对根尖组织造成显着损伤，强调了 epi 气道模型的实用性。
这里显示了一张图表，描述了在表皮气道共培养期间随时间内化的 NTHI 数量。R 2 8 6 6 菌株接种量约为 10 倍，每个插入片段第 7 个 CFU 的 10 倍。然后收获内化的细菌并在每个指示的时间点进行计数。
看完这个视频，你应该对如何使用 A PRE 模型进行 NTHI 与初级激素呼吸道组织的长期共培养有一个很好的了解。
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概述
这种方法允许用EpiAirways（一种使用原代人类呼吸道上皮组织的具有生物学相关性的体外模型）对扩展的细菌共培养进行表征。这种方法可用于任何适合长期共培养的微生物。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 呼吸道生物学
- 体外模型
背景
- 非型化流感嗜血杆菌（NTHI）是呼吸道感染的重要病原体。
- 了解细菌与呼吸道上皮组织的相互作用对开发治疗方法至关重要。
- EpiAirways模型模拟人类气道环境。
- 长期共培养研究可以提供关于细菌存活和行为的见解。
研究目的
- 进行NTHI与原代人类呼吸道上皮组织的长期共培养。
- 评估NTHI在组织中随时间的存活。
- 评估NTHI存活的菌株特异性特征。
使用的方法
- 用NTHI接种上皮组织的顶端表面。
- 每24小时用预热的DPBS洗涤插入件以模拟粘液流动。
- 在所需时间点收集组织进行分析。
- 确定总细胞相关或内化的NTHI的存活。
主要结果
- 获得了关于NTHI长期感染的见解。
- 使用活菌计数来评估NTHI的存活特征。
- 该方法展示了在相关模型中评估细菌行为的能力。
- 研究结果可能为未来的呼吸道感染研究提供参考。
结论
- 这种方法为研究细菌与人类呼吸道组织的共培养提供了有价值的工具。
- 它增强了对NTHI与上皮细胞相互作用的理解。
- 该方法可适用于其他类似研究中的微生物。
常见问题
Executive Industry Relevance
The EpiAirway model enables long-term co-culture of respiratory pathogens with primary human epithelial tissues, addressing a critical gap in preclinical infection modeling. This approach supports mechanistic de-risking of host-pathogen interactions and improves predictive confidence in early-stage antimicrobial target validation. By maintaining tissue integrity and physiological relevance over extended periods, it enhances translational continuity from discovery to preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of cell-associated and internalized bacteria over time.
- Operational Value: Supports functional target validation by assessing strain-specific survival characteristics in a human-relevant system.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by modeling chronic infection phenotypes not supported by submerged cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative dependent variable measurements (CFU counts) for evaluating antimicrobial efficacy and bacterial persistence.
- Operational Value: Enables assay standardization through daily washing with pre-warmed DPBS to mimic mucociliary clearance and reduce variability.
- Scientific Value: Supports screening readiness by allowing mucin production and cytokine profiling as secondary readouts for host response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant system (normal human tracheo-bronchial cells) to improve translational biomarker alignment for respiratory infections.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by maintaining tissue structure and function during long-term co-culture.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by characterizing long-term host-pathogen interactions without significant apical tissue damage.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy testing, particularly for respiratory antimicrobial development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling longitudinal tracking of bacterial adherence, invasion, and survival.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility via standardized inoculum preparation (OD 600 nm ~0.7) and serial dilution plating for viable bacterial counts.
- Analytics: Generates quantitative readouts (CFU/mL) that allow comparison of strain-specific survival and evaluation of intervention effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of primary human tissues that retain cytokine production and mucin secretion capabilities.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform adaptable to other respiratory pathogens (e.g., Moraxella catarrhalis) beyond NTHi.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in chronic infection models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via antibiotic-free conditions and defined washing protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying compounds that reduce bacterial internalization or persistence over time.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on longitudinal infection dynamics rather than acute cytotoxicity endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary tissue handling and biosafety level 2 practices for co-culture of bacteria and human cells.
- Dependent on specialized inserts and air-liquid interface culture systems (e.g., MatTek EpiAirway).
- Necessitates cross-team standardization of inoculum preparation, washing frequency, and harvesting procedures.
- Adaptation considerations include validation of pathogen compatibility with mucociliary clearance mimicry and tissue integrity over time.
- Practical limitation: Extended co-culture increases contamination risk, requiring strict aseptic technique in shared biosafety cabinets.
