用于研究药物超敏反应中IgE介导机制的嗜碱性粒细胞活化试验

以下实验的总体目标是利用经过充分表征的人血清白蛋白-药物偶联物，通过嗜碱性粒细胞活化试验检测IgE介导的药物超敏反应。该目标的实现分为两个步骤：首先，通过药物分子自身具有的或经有机化学方法引入的羧基，将药物化学连接至人血清白蛋白的赖氨酸残基上；其次，采用高效尺寸排阻色谱法（H-P-S-E-C）结合连续的折射率和紫外检测，对所获得的偶联物进行物理化学表征，以精确测定其偶联程度。

接下来，使用特性明确的药物偶联物刺激药物超敏供体的嗜碱性粒细胞。最终，嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）可用于评估药物超敏反应中的IgE介导机制。我叫Michael Steiner，来自奥地利萨尔茨堡大学的过敏研究小组。

今天，我们向您介绍一种用于检测药物特异性IgE抗体在药物超敏反应中作用的技术。本文以两种广泛使用的非甾体抗炎药——丙酸（propone）和双氯芬酸（diclofenac）为例，展示该技术的操作流程。然而，该方法具有应用于即发型药物过敏常规诊断的潜力。

通常，向丙帕他莫（propafenone）或PP样品中加入10微升新配制的N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）储备液。将样品涡旋振荡1分钟。接着，向样品中加入16.9微升浓度为118毫克/毫升的人血清白蛋白（HSA）溶液，然后在室温下以每分钟300转的速度振荡孵育2小时。

振荡完成后，将样品在4摄氏度下用两升PBS缓冲液进行三次透析，每次数小时。然后在室温下以14,000 × g离心10分钟，收集含有与HSA偶联的NSAIDs的上清液S。通过使用12%凝胶进行SDS-PAGE检测上清液中的蛋白质。

为通过高效尺寸排阻色谱法（H-P-S-E-C）分析NSAID偶联物的偶联率，将约12微克HSA偶联物上样至一个凝胶加样孔中。首先将HSA标准品用去离子水稀释至浓度为1毫克/毫升。进行检测器校准时，注入50微升HSA标准溶液。

然后使用7.8 × 300毫米TSK gel G2000SWXL色谱柱，配备在线联用的示差折光（RI）检测器和紫外（UV）检测器系统。计算检测器的示差折光常数KRI和紫外常数KUV。利用这两个公式，将PP衍生物标准品在去离子水中稀释为5、10和30动物量，以便进样，随后分别计算标准品的药物dn/dc和药物da/dc的平均值。

利用这两个公式，现在将药物偶联物注入 H-P-S-E-C 中，并测定其 RI 和 UV 峰面积。然后使用相同的两个方程，计算未知样品中 PP 衍生物和 HSA 的浓度。首先根据内容标记七个流式细胞术小瓶：未染色对照、阴性对照、阳性对照和药物偶联物。

接下来，将50微升嗜碱性粒细胞刺激缓冲液加入预留用于未染色对照和阴性对照的样品管中。向阳性对照管中加入50微升流式细胞检测试剂盒（flow two cast kit）中的抗FcεRI抗体溶液。然后，以1:10的系列稀释方式，向药物偶联管中加入0.02至20微克/毫升的PP偶联物，随后每管加入100微升刺激缓冲液和50微升患者的EDTA抗凝全血。

小心混匀样品。然后向每支药物偶联物、阳性对照和阴性对照管中加入20微升流式染色试剂，该试剂含有PE标记的抗CCR3抗体和ZI标记的抗CD63抗体，并充分混匀。

再次将样品置于37摄氏度水浴中孵育45分钟。然后将样品置于冰上5分钟以终止反应。接下来，向每支小瓶中加入2毫升Flow Two裂解试剂，裂解红细胞。

将样品在室温下避光孵育10分钟。随后在室温下以500 × g离心5分钟使样品沉淀。小心弃去上清液，将细胞重悬于500 µL流式洗涤缓冲液中，并将样品置于冰上保存，直至进行流式细胞术分析。

使用未染色的样本调整流式细胞仪的电压设置。然后在侧向散射-前向散射图中圈选被判定为淋巴细胞的细胞。与本示例图类似，嗜碱性粒细胞首先被识别为CCR3高表达、侧向散射低的细胞群。

与该散点图类似。在将细胞圈选至合适的EPE图后，可通过其表达FITC标记的CD63阳性进一步鉴定活化的嗜碱性粒细胞。将阴性对照中CD63高表达的嗜碱性粒细胞比例上限设为2.5%后，若待测样本中CD63高表达的嗜碱性粒细胞比例超过5%，且样本的MFI与阴性对照MFI的比值大于2，则可判定该样本为嗜碱性粒细胞活化阳性。

该方法评估了BAT作为一种检测IgE依赖性药物超敏反应蛋白的有益工具。使用非甾体抗炎药（NSAIDs）偶联物通过H-P-S-E-C法激活嗜碱性粒细胞，并采用RI和UV检测其聚集情况。偶联物的偶联程度和有效产率根据本图所示方法确定。

43.5%的DF偶联物保持单体状态，而聚集体的偶联度为每个HSA分子结合5.0个DF。此处所示测定的偶联度为9.5。PPP偶联物显示含有68.5%的单体，偶联度为21.2。

聚集体的偶联度为27.9。DF偶联物的测定偶联度为7.6 df，PPP偶联物为23.2。在优化条件下使用偶联物进行BAT检测，可用于研究非甾体抗炎药（NSAID）超敏反应中IgE依赖性反应。

如图所示，只有PP偶联物能够触发嗜碱性粒细胞活化，表现为CD63表面表达上调。根据荧光强度的对数变化特征，20.6%的嗜碱性粒细胞被活化，其MFI从阴性对照的386升高至1893，增幅达4.9倍。

相比之下，使用 DF 偶联物时，仅有 3.1% 的嗜碱性粒细胞被激活，低于 5% 的 cutoff 值。同时，MFI 仅从阴性对照的 197 增加到 210，增幅仅为 1.1 倍。阴性对照中嗜碱性粒细胞激活率低于 5%，证明了该检测的有效性。

两个标准：嗜碱性粒细胞亚群的荧光强度出现对数级偏移，以及阳性对照中活化嗜碱性粒细胞比例超过50%。观看本视频后，您应充分掌握嗜碱性粒细胞活化试验的操作方法，最重要的是，能够区分IgE介导与非IgE介导的药物超敏反应。此外，您还应了解如何拓展嗜碱性粒细胞活化试验在药物过敏中的应用范围，超越其目前在花粉-食物及昆虫毒液过敏中已确立的用途。