一种用于胚胎小鼠血管标记的方法

以下实验的总体目标是确定特定基因突变对血管发育和结构的影响。通过将胚胎及胚外组织一同解剖，以获得适合注射的样本。随后，向面静脉注射荧光染料，以标记完整的血管系统。

然后对胚胎进行分析前处理。最后，通过全胚血管染色成像或切片观察，基于全胚或组织切片的免疫荧光显微镜图像，展示正常血管系统的三维结构。我最初产生这一方法的想法，是源于希望确定外周血管系统通过血管发生与胸腺相连的发育时间点。

首先，在一个1.5毫升离心管中，用PBS配制FXI葡聚糖或GS L1选择素B4溶液，向FTSE葡聚糖中加入100微升浓度为1.25毫摩尔/升的快绿PBS储备液，或向GS L1中加入180微升，使溶液呈现明显的蓝色。接下来，将离心管置于37摄氏度温育。

解剖 E 14.5 至 E 18.5 胚胎及其卵黄囊，保留艾伦脐带（Allen Toic stalk）完整。将胚胎转移至新的培养皿中，并在室温下浸入 PBS 中。随后调整胚胎位置，以获得面部的矢状面视图。

然后用显微解剖镊子轻轻夹住胚胎的头部。使用30号针头将50 µL的FXI葡聚糖或GS L一选择素B四注入面部静脉，针头朝向头部后方。当在脐静脉中观察到染料时，移出针头，并将胚胎与卵黄囊分离。

将胚胎置于室温的磷酸盐缓冲液中2到3分钟，使染料在胚胎内充分循环。待染料在胚胎中循环均匀后，从肢体、背部和腹部区域取下皮肤样本。

用冷的 PBS 清洗皮肤样本，并在含 4% 多聚甲醛的 PBS 中固定两小时。随后，在含有 2 毫升冷 PBS 的 4 毫升透明小瓶中，每次清洗 10 分钟，共清洗三次。将皮肤样本置于显微镜载玻片上，每张载玻片加入 100 微升封片液，并加盖盖玻片。

在进行BABB透明化处理及后续共聚焦成像以获得皮肤血管系统的高分辨率图像之前，需将载玻片置于避光环境中干燥。为制备冷冻切片，将整个胚胎在液氮中速冻。在切片模具上涂抹OCT包埋剂，并将胚胎固定于其上。

将冷冻组织切成10微米厚的切片，并收集到载玻片上。用丙酮固定切片5至10分钟，然后在湿度孵育盒中用含10%驴血清的冷TBS缓冲液洗涤三次。室温下，向每个切片加入100微升一抗。

在此示例中，我们使用大鼠抗-US CD31标记内皮细胞，以及山羊抗-US P-D-G-F-R beta标记血管周围细胞，以确保抗体在切片上均匀分布。用单独裁剪的Parafilm条覆盖载玻片。将载玻片置于湿盒中，在4°C条件下孵育一小时至过夜。

接着，用预冷的 TBS 洗涤切片三次。加入 100 µL 适当的二抗，孵育至少 30 分钟。最后，用预冷的 TBS 洗涤三次，每张切片加入 100 µL 封片剂，并加盖盖玻片。

将载玻片置于避光处干燥。进行振动切片时，从胚胎中解剖出胸腺叶，并用冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。在室温下用4%多聚甲醛PBS固定组织2小时。

用 PBS Triton X 洗涤样品后，取少量塑料模具，加入 4% 低熔点琼脂糖。将样品浸入琼脂糖 PBS 溶液中，确保组织与模具底部接触。置于冰上使琼脂糖凝固。

然后使用剃刀片切去多余的琼脂糖。将胶水涂在VIBRAM块上，并将样品粘附到该块上。向Vibram水浴中倒入冷的PBS，直至样品和刀片完全浸没。

设置速度和振幅。应降低振幅。如果由于过度振荡导致切片破碎，请切取50片组织切片。

然后使用镊子将组织切片转移至24孔板中的冷PBS中，在PBS-Triton X中加入500微升10%驴血清，封闭30分钟；加入如抗CD31和抗PDGFR-β等一抗后，于4°C覆盖的微孔板中孵育8小时至过夜。接着在4°C下用PBS-Triton X洗涤三次，总时长为8小时。

再次封闭切片并孵育二抗后，在4°C条件下，用PBS Triton X溶液将样品清洗三次，总时长八小时。随后将样品置于冰上，用含4%多聚甲醛的PBS溶液重新固定30分钟，再于冰上用PBS Triton X溶液清洗三次，每次10分钟。通过梯度甲醇PBS Triton X系列溶液对样品进行脱水处理，每步10分钟。

然后用新鲜的甲醇替换100%甲醇，在室温下孵育一小时。将样品置于玻璃凹面载玻片中，并用等体积的BABB与甲醇混合溶液覆盖样品。孵育样品10至15分钟。

接着，将溶液更换为100% BABB，室温孵育10至15分钟，或直至组织透明。加盖盖玻片，并用两到三层指甲油封片。在室温避光条件下静置，使指甲油完全硬化。

样本可在 4 摄氏度下保存，但应在 12 至 24 小时内进行成像。使用共聚焦显微镜，配备 Plan Apochromat 20 倍 0.8 物镜，结合 633、488 和 543 纳米激光线，对 10 微米的冷冻切片进行成像；使用 Plan Apochromat 10 倍 0.4 物镜，结合 488、543 和 633 纳米激光线，获取 50 微米厚的 Aros 包埋切片的一微米共聚焦 Z 层扫描图像。使用 Zeiss AIA Vision 4.6 或其他图像分析软件对连续 Z 层图像进行重建。胚胎血管系统的高效标记对于评估胚胎小鼠中血管缺陷至关重要。这些图示显示了 E16.5 胸腺血管的特异性标记，以及 GS1-B4 与 I-选择素的共标记。

对胚胎注射B4后，使用CD31对左右心室进行染色。本实验采用GSL I选择素B4针对冷冻切片的实验方案。按照此方案，展示了E16.5小鼠皮肤血管网络的全 mount 标记结果。

还可以采用其他方法，例如对基质细胞和血细胞与血管系统进行共标记，以回答更多问题，比如在正常和病理条件下，血细胞和基质细胞如何与小鼠胚胎中的血管系统相互作用？