Name: miRNA的目标使用的任务目标ID库的全基因组屏幕 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 了解如何使用Target ID Library进行miRNA靶基因的全基因组高通量筛选。该方法通过细胞转染、稳定细胞系筛选和深度测序分析，帮助研究人员识别特定的micro RNA靶标并深入理解基因调控机制。

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我们感谢Sigma Life Science Mission Target ID文库开发团队的全体成员，特别感谢Kevin Gutshall发现该技术并协商许可条款，以及Heather Holemon在富有成效的故障排查讨论中提供的支持与参与。我们还要感谢伦敦国王学院的Joop Gäken博士无偿分享未发表的研究结果和建议，感谢RxBiosciences公司的Qazi Hamid制备了高质量的cDNA并坚持不懈地完成克隆工作。我们谨向SAFC公司的Nan Lin和Scott Bahr致谢，感谢他们完成cDNA芯片实验及数据分析。
MISSION 是 Sigma-Aldrich Biotechnology L.P. 的注册商标。

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

作者声明与对所提交作品有利益关系的商业实体存在财务往来。

microRNA 是一类长度为 20-24 个核苷酸的 RNA 分子，通过抑制 mRNA 的翻译来转录后调控基因表达，且通常还会导致靶向 mRNA 的不稳定（详见文献[6]）。单个 microRNA 可调控数百个 mRNA，从而控制细胞对发育信号和环境信号的响应。识别并验证靶 mRNA 对于明确 microRNA 在这些通路中的作用与功能至关重要。然而，靶标识别并非易事，因为在动物中，microRNA 与其靶位点之间并不完全互补。“种子”区域（即 microRNA 5′端第 2 至第 7 位碱基）通常与其靶标互补，但该规则存在诸多例外，下游碱基配对可弥补种子区配对的不完全匹配。目前已有多种计算机算法被开发用于预测 microRNA 靶标，这些算法基于种子区匹配与下游补偿、靶标结构与位置、序列保守性，以及其他在实验验证靶标中观察到的多种参数（详见文献[7]）。尽管基于计算机的预测方法使用便捷，并能识别出许多真实的 microRNA 靶标，但大多数预测基因无法通过实验验证，同时许多真实靶标却未被预测出来。此外，由于计算机算法依赖于先前已知的靶标特征，因此难以发现偏离已有认知的新靶标。

已有多种实验系统被成功用于在活细胞中鉴定或发现功能性 miRNA 靶标。这些全局筛选方法包括微阵列和 RNA 测序、RNA 共免疫沉淀（RIP）以及细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC），后者是一种蛋白质组学方法（详见文献[7]综述）。每种方法均有其优缺点。由于 miRNA 靶向作用常导致 mRNA 不稳定并引发其降解，因此分别通过引入 miRNA 模拟物或抑制剂后检测 mRNA 水平的降低或升高，可识别 miRNA 靶标。这种 mRNA 水平的变化可通过微阵列或深度测序轻松检测。尽管 mRNA 检测方法比蛋白质检测方法更简便且更灵敏，但该方法会遗漏那些未发生降解的 miRNA 靶标。Bartell 实验室近期发表的研究比较了通过 RNA 检测与 SILAC [8] 或核糖体图谱分析 [9] 获得的 miRNA 靶标结果，表明哺乳动物 miRNA 主要通过降低靶标 mRNA 水平发挥作用。然而，许多其他实验室在研究特定 miRNA 靶标时发现蛋白质水平发生变化而 mRNA 水平无变化。报道中显示存在翻译调控但无明显 mRNA 水平下降的案例包括：miR-10b 对 HOXD10 的调控 [10]，miR-221/222 对 p27kip1 的调控 [11]，miR-21 对 Pdcd4 的调控 [12]，miR-126 对 p85β 的调控 [13]，miR-34 对 SIRT1 的调控 [14]，miR-21 对 PTEN 的调控 [15]，miR-302d 对 Arid4b 的调控 [16]，miR-200c 对 JAG1 的调控 [17]，以及 miR-299、297、567 和 609 对 VEGFA 的调控 [18]。此外，Clancy 等人 [19] 近期报道指出，只有当选择性检测含有 let-7 靶位点的特定 mRNA 异构体时，才能观察到 let-7 介导的翻译调控。这表明，在某些情况下，翻译调控可能在综合分析谱中被忽略——即当所有 mRNA 异构体被检测为单一 mRNA 时，这正是许多微阵列和序列分析所采用的方式。通过 Argonaute 蛋白（通常为 ago2）或其他相关蛋白对 miRNA-mRNA 复合物进行共免疫沉淀（RNA 免疫沉淀，RIP）可分离 miRNA 靶标，且不受调控机制限制。此外，RIP 可检测内源性且可能具有生物学意义的相互作用。然而，目前尚不清楚是否所有 miRNA-mRNA 相互作用都具有功能，且 RIP 会遗漏那些仅短暂结合或迅速降解的 mRNA 靶标。此外，由于所有共沉淀的 miRNA-mRNA 配对混合在一起，其具体配对关系必须通过生物信息学手段推断。最后，SILAC 可直接识别 miRNA 调控的最终产物——蛋白质本身，但其灵敏度较低，因此会遗漏低丰度蛋白以及蛋白质水平的微小变化。

鉴于现有miRNA靶点鉴定方法的局限性，我们认为有必要开发一种通过替代机制来鉴定功能性miRNA靶点的全局性检测方法。为满足这一需求，我们获得了伦敦国王学院Joop Gaken和Azim Mohamedali发明的一项技术授权。该技术基于一种双筛选融合蛋白，具体为胸苷激酶-杀稻瘟菌素（thymidine kinase-zeocin）融合蛋白，其表达受插入于3′非翻译区（3′UTR）的潜在miRNA靶序列cDNA文库调控。如图2所示，稳定转染并表达TKzeo-cDNA构建体的细胞可通过杀稻瘟菌素（zeocin）进行筛选。在表达特定miRNA后，该miRNA的靶点可通过更昔洛韦（ganciclovir）进一步筛选，如图3所示。更昔洛韦可杀死表达胸苷激酶的细胞，即所有表达TKzeo-cDNA但不含该miRNA靶点的细胞。存活于更昔洛韦处理的细胞中所含的靶向cDNA可通过PCR扩增获得，使用位于cDNA两侧的引物进行扩增，所得PCR产物经测序即可鉴定miRNA靶点。

我们将国王学院的技术开发成一种用于全球性识别和发现功能性人类miRNA靶点的新工具——MISSION靶点鉴定文库。利用该靶点鉴定文库，用户可通过一系列哺乳动物细胞培养、转染及药物筛选步骤来分离miRNA靶点。该文库具有高度全面性，包含人类基因的66%-79%。初步结果表明，无论是先前已发现的靶点还是全新的靶点，均可从MISSION靶点鉴定文库中分离获得。

尽管该实验方案篇幅较长，但使用靶标鉴定文库（Target ID Library）仅需标准的分子生物学实验技术——哺乳动物细胞培养、转染、药物筛选、PCR 和测序，因此大多数生物学家均具备实施条件。我们建议充分重视合理的实验设计，优化培养条件，尤其重要的是，在使用靶标鉴定文库前应对每种新细胞类型进行预实验，通过杀灭曲线（kill-curves）确定筛选步骤的最佳药物浓度，以确保实验成功。

与所有miRNA靶标鉴定方法一样，强烈建议通过第二方法验证Target ID文库筛选出的靶标，例如微阵列、qRT-PCR、报告基因检测（如荧光素酶）或蛋白质印迹分析。

<table><tbody><tr><td>JumpStart REDTaq ReadyMix</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/P0982?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>P0982</td><td> </td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/G2536?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"&gt;更昔洛韦&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"&gt;Sigma-Aldrich&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/G2536?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"&gt;G2536&lt;/a&gt;</td><td> </td></tr><tr><td>G418</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"&gt;Sigma-Aldrich&lt;/a&gt;</td><td>G8168</td><td> </td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/P9620?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>P9620</td><td> </td></tr><tr><td>Topo TA</td><td>Invitrogen</td><td>KNM4500-01</td><td> </td></tr><tr><td>GenElute 哺乳动物基因组 DNA 小量提取试剂盒</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1n10?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>G1N10</td><td> </td></tr><tr><td>细胞特异性核转染试剂盒</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>核转染仪</td><td>Lonza Inc.</td><td>AAD-1001</td><td> </td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>&lt;a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;amp;productID=R25001"&gt;R250-01&lt;/a&gt;</td><td> </td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mreh01?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"&gt;靶标 ID 文库&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"&gt;Sigma-Aldrich&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mreh01?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_mmc=affiliate-_-JOVE-_-video-_-target_id" target="_blank"&gt;MREH01&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 mission target id 文库进行全基因组 mirna 靶点筛选

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

靶标ID文库旨在协助发现和鉴定微小RNA（miRNA）的靶标。该靶标ID文库是一种基于质粒的全基因组cDNA文库，将cDNA克隆至双筛选融合蛋白胸苷激酶-杀稻瘟菌素（TKzeo）的3'非翻译区（3'UTR）下游。筛选分为三步：首先筛选稳定转化子，随后引入感兴趣的miRNA，最后筛选含有该miRNA靶标的cDNA。通过测序鉴定被筛选出的cDNA（参见图1-3了解靶标ID文库的工作流程及详细信息）。
为确保对人类转录组的广泛覆盖，采用寡核苷酸-dT引物，以多种人组织和细胞系来源的总RNA混合物为模板，构建了靶标鉴定文库的cDNA。所获得的cDNA片段大小范围为0.5至4 kb，平均长度为1.2 kb，并已克隆至p3΄TKzeo双筛选质粒中（质粒图谱见图4）。该文库所包含的基因靶标信息可在Sigma-Aldrich公司网页查询。Illumina测序结果（表3）显示，该文库覆盖了UCSC RefGene数据库中21,518个独特基因中的16,922个（占79%），其中14,000个基因的测序读数达到10条或以上（占66%）。

靶标ID文库是一种基于质粒的全基因组克隆cDNA集合，用于鉴定miRNA靶标。本文将展示其使用方法与应用。

使用 MISSION Target ID 文库进行全基因组 miRNA 靶点筛选

靶标ID文库旨在协助发现和鉴定微小RNA（miRNA）的靶标。该靶标ID文库基于质粒构建，……

以下实验的总体目标是利用靶标ID文库对micro RNA靶点进行高通量全基因组筛选。该目标通过将文库质粒转染细胞来实现。在将全基因组范围的克隆cDNA文库转染后，筛选获得稳定细胞系。随后将已建立的文库细胞转染micro RNA表达载体，以实现micro RNA靶标与胸苷激酶的共表达。此时，使用更昔洛韦筛选表达特定micro RNA靶标的细胞，其原理是通过抑制胸苷激酶的表达进行负向筛选。接着，利用靶标ID扩增引物对含有micro RNA靶标位点的CD NA进行PCR扩增，以便测序并鉴定micro RNA文库中的靶标序列。最终，通过深度测序分析获得能够识别细胞中特定微小RNA靶点的结果。该任务靶点ID文库旨在协助发现和鉴定微小RNA的基因靶点。本文将展示其使用方法与应用。在开始本方案之前，选择一种不表达或低表达目标 IRA 的细胞系，培养并扩增细胞，以获得约两乘以十的七次方个细胞，细胞融合度约为 80%。胰酶消化后，将细胞转移至 15 毫升无菌螺口离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。弃去培养基后，重悬细胞沉淀进行洗涤，再次离心，并重复洗涤一次。同时，根据转染数量准备足够数量的 0.5 毫升离心管，每管加入两微克目标 ID 文库。现在，使用 600 微升 Maxim 核转染溶液重悬 15 毫升离心管中的细胞沉淀，每次处理一个反应。取100微升细胞加入到分装样品中，加入2微克质粒，并用移液枪头混匀。将每种混合物转移至核转染杯中。将一个转染杯插入核转染仪，并运行针对该细胞系优化的程序。接下来，用预热的培养基填充移液管。用同一支移液管吸起转染后的细胞，并转移至预先准备好的六孔板中的一个孔内。针对每次核转染（NU nuclear affection），重复此操作。将细胞放回培养箱中，于次日进行过夜培养。更换培养基，使细胞恢复生长3至5天。待细胞恢复后，吸去培养基，加入含有适当浓度伊红的完全培养基，以筛选稳定整合并表达TKZO融合蛋白的细胞。伊红浓度可如文中所述预先确定。通过细胞活力监测伊红筛选的细胞。每两到三天用含有新鲜伊红的培养基更换培养基。当六孔板中的细胞达到汇合时，传代并扩增细胞至更大的培养瓶中。需进行杀灭曲线分析，以确定本研究中所用筛选试剂的最小致死剂量。为避免细胞产生非预期的表型反应，在进行杀灭曲线实验时，应于次日将细胞接种至96孔板的每个孔中，每孔含120微升新鲜培养基。向选定的孔中加入药物。使用抗生素G418或嘌呤霉素用于筛选miRNA表达载体的整合，或使用阿昔洛韦用于筛选胸苷激酶表达的缺失。在孵育期间，每两天检查一次每个药物浓度下的细胞活力。每三天更换一次含有筛选试剂的培养基。在确定药物浓度后，应选择在目标时间内导致完全细胞死亡的最低浓度筛选试剂，用于该细胞类型和实验。为进行显微注射（MI）转染，需培养并扩增目标ID文库细胞，以获得两乘以十的七次方个细胞。当细胞融合度超过80%时，使用胰蛋白酶消化。将细胞转移至一个15毫升无菌螺口离心管中，在200 × g条件下离心5分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液，并如前所述将细胞沉淀洗涤两次。接着，针对每次转染，将2微克MIRA表达质粒加入一个0.5毫升离心管中。采用与转染目标ID文库相同的方法，对库细胞进行mRNA的NU核转染。细胞恢复培养三至五天后，根据杀灭曲线试验确定的抗生素浓度，更换为含相应浓度抗生素的完全培养基。在抗生素筛选期间监测细胞，每两到三天用含有抗生素的新鲜培养基更换一次培养基。当六孔板中的细胞达到汇合时，将细胞传代并扩增至更大的培养瓶中。与之前相同，更换为含有适当浓度GCV和抗生素的新鲜培养基。通过细胞活力检测监测细胞中胸苷激酶的表达及mRNA表达，并在更昔洛韦（GCV）和抗生素存在的情况下扩增存活细胞。接着，从经GCV筛选的细胞中提取基因组DNA。使用试剂盒引物对选定的文库插入片段进行PCR扩增，并按照书面实验方案所述进行亚克隆。随后可使用扩增引物进行测序反应。最后一步是通过将序列与已知转录本的人类转录组以及新转录本的人类基因组进行BLAST比对，以确定基因靶标。将仅含3 73的表达载体稳定转染至MC seven文库中，并在含有更昔洛韦的培养基中筛选，以富集表达仅3 73靶标的细胞。由于MCF7细胞不表达胸苷激酶，因此在没有文库的情况下，GCV对其无影响。另一方面，C7文库细胞虽表达胸苷激酶，但在8或16微摩尔浓度的更昔洛韦处理下并未被完全杀死，这一点可通过活细胞摄取亮蓝染料来证明。然而，文库细胞在GCV存在下确实停止了增殖，这可通过其培养基中酚红染料的颜色变化得到证实。停滞的细胞不会酸化其培养基，因此颜色保持微红色。从存活的细胞中分离出的靶序列未变为橙色或黄色，而是经过PCR扩增并测序。获得了近 1200 万条 cDNA 读长，这些读长比对到近 12,000 个独特基因。在这些独特基因中，有 234 个因命中频率较高而被视为可靠的命中结果，且特异性针对 mere 3 73。初步比较发现，在靶标 ID 文库中鉴定出的这些独特基因中有 10 个也出现在 tar base 数据库中先前鉴定的 mere 3 73 靶标列表中。因此，这10个基因很可能是miR-373的有效靶点，目前正在进行表征以通过实验验证所筛选出的部分阳性结果。观看本视频后，您应能够充分了解如何利用MISSION Target ID文库开展针对microRNA基因靶点的高通量全基因组筛选。

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本报告描述了一种快速且可靠的细胞miRNA mRNA靶标验证方法。该方法利用合成的生物素标记的锁核酸（Locked Nucleic Acid,...

基于生物素的下拉实验验证细胞miRNA的mRNA靶标

本文介绍了一种用于表征具有生物学协同作用的miRNA模块及其组装成短转录子的方法，该方法可实现基因治疗应用中的同时过表达。...

胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的表征及其在基因治疗中的人工簇构建

本文介绍了一种全新且完全自动化的miRNA分析流程——mirMachine，该流程具有以下优势：1）能够更准确地识别已知和新miRNA；2）完全自动化且免费开放。用户现在只需运行一个简短的提交脚本，即可启动完全自动化的mirMachine分析流程。...

mirMachine：植物miRNA注释的一站式平台

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35...

用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，通过基因组分析和功能基因组筛选，鉴定并比较在基因工程小鼠模型中以及相应人类肿瘤类型中发生的肿瘤的治疗靶点。...

利用基因分型与基因组规模的基因剔除筛选鉴定恶性外周神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点

本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA...

通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

了解如何使用Target ID Library进行miRNA靶基因的全基因组高通量筛选。该方法通过细胞转染、稳定细胞系筛选和深度测序分析，帮助研究人员识别特定的micro RNA靶标并深入理解基因调控机制。

使用 MISSION Target ID 文库进行全基因组 miRNA 靶点筛选

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