改变电脉冲施加过程中电场的方向和取向可提高体外质粒基因转导效率 in vitro
2011年9月12日
在脉冲施加过程中改变电场方向，可使电穿孔介导的基因转染效率提高约两倍，同时不影响细胞活力。基因转染效率的提升是由于细胞膜上具备DNA进入能力的区域面积增加所致。
基因电穿孔转移是一种通过施加短暂而强烈的电脉冲将基因导入细胞的物理方法。在成功的基因电穿孔转移过程中，涉及多个步骤：DNA与细胞膜形成复合物、DNA跨过电穿孔后的膜进行转位、DNA从细胞质转移至细胞核，以及基因的表达。为了实现最高的基因转染效率，常采用不同的电脉冲方案。
其中一种方法是在脉冲递送过程中改变电场方向。在本视频中，我们展示了当所有脉冲沿同一方向递送与改变电场方向递送时，基因电穿孔转染效率的差异。本实验以中国仓鼠卵巢细胞（CHOK1）进行。
按照以下步骤操作：将细胞在培养箱中的培养瓶内培养24小时。实验当天，使用含0.25%胰蛋白酶的EDTA溶液制备细胞悬液，并计数细胞；在4°C条件下，以1000转/分钟离心5分钟，收集细胞沉淀，然后将细胞沉淀重悬于ISO OSM Miller磷酸钠缓冲液中，调整细胞密度至每毫升500万个细胞。将样品转移至合适的培养皿中，使细胞在带有集成电极的移液枪头中暴露于电场，电极连接至高压原型发生器。
这些电极可在不同方向上施加相对均匀的电场。电极尖端和发生器由电气工程生物控制论学院实验室研制。卢安那大学将质粒 E-G-F-P-N1 以每毫升 10 微克的浓度加入细胞悬液中。
将细胞与质粒DNA充分混合，在室温下孵育2至3分钟，然后施加电脉冲。用带有集成电极的移液器吸头吸取100微升细胞悬液。在本实验中，使用高压原型发生器施加一串八个矩形脉冲，针对不同的电场方案，在第一个方案中采用这些参数。
所有脉冲均沿同一方向施加，而在第二种方案中，通过改变电场方向来施加脉冲。第二种方案只能使用能够施加不同方向电脉冲的专用脉冲发生器。脉冲施加后，立即将细胞从移液管尖转移至六孔板中，并加入胎牛血清。
将样品体积的25%在37摄氏度下孵育细胞5分钟。为使细胞膜重新封闭，在6孔板中每份样品加入2毫升HAMF 12，并在37摄氏度、湿润的5%CO2气氛中孵育细胞24小时。基因电转效率通过脉冲施加后24小时表达GFP的细胞百分比来确定。
使用成像软件在荧光显微镜下观察细胞。将激发波长设置为 488 纳米，并选择适当的带通滤光片以获取绿色荧光图像，用于检测表达 GFP 的细胞。以 20 倍放大倍数采集至少五张明场对比度和绿色荧光图像。
通过物镜放大倍数在明场对比图像中计数细胞，并在绿色荧光图像中计数表达GFP的细胞，将表达GFP的细胞数量除以每幅对应图像中总细胞数量，从而计算基因电转效率的百分比。当所有电脉冲均沿同一方向施加，以及通过改变电场方向施加电脉冲时，表达GFP的细胞百分比随之变化。结果表明，改变电场方向后，表达GFP的细胞百分比显著增加。
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概述
本研究探讨了通过电穿孔进行基因转染的方法，重点阐述了电场方向对转染效率的影响。研究结果表明，在脉冲施加过程中改变电场方向可使基因转染率提高一倍，同时不损害细胞活力。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因治疗
- 细胞生物学
- 电穿孔技术
背景
- 基因电转是一种将基因导入细胞的方法。
- 该方法通过施加短暂而强烈的电脉冲，促进DNA进入细胞。
- 成功的转染需要DNA穿过细胞膜并进入细胞核。
- 不同的电脉冲程序可提高转染效率。
研究目的
- 评估电场方向对基因转染效率的影响。
- 确定改变电场方向是否会影响细胞活力。
- 以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞为例演示该过程。
使用的方法
- 对CHO细胞施加电脉冲。
- 比较不同电场方向下的转染效率。
- 评估转染后细胞的存活率。
- 分析DNA进入细胞及后续基因表达情况。
主要结果
- 通过改变电场方向，基因转染效率提高了约两倍。
- 细胞活力未受到显著影响。
- 膜面积的增加促进了DNA的进入。
- 验证了不同电脉冲方案的有效性。
结论
- 在脉冲施加过程中改变电场的方向可显著增强基因转染效果。
- 该方法可在不损害细胞健康的前提下进行优化。
- 未来的研究可探索更多方案以进一步提高基因递送效率。
常见问题
行业高管相关性
在电穿孔过程中优化电场方向可提高质粒基因转导效率，为早期靶点验证和先导化合物筛选工作流程中提升转染效率提供了一种非病毒策略。该方法通过扩大细胞膜的通透性以增加DNA进入细胞，同时不损害细胞活力，从而在机制层面降低风险，提高临床前模型的预测可信度。该技术可实现可重复、可放大的基因递送，适用于生物制药研发中的检测方法开发和表型筛选应用。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：增加具有DNA摄入能力的膜面积，提高转染效率，支持重组蛋白表达研究中的功能靶点验证。
- 操作价值：实现质粒在细胞群体中的稳定递送，降低早期假设检验和信号通路解析中的实验变异性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供基于荧光的定量读数，用于评估基因转导效率，适用于高内涵筛选平台。
- 操作价值：通过集成电极尖端和可编程脉冲发生器标准化电穿孔参数，提高不同实验室间实验的可重复性。
- 战略价值：支持转染细胞系的可扩展制备，用于后续靶点结合和生物标志物检测。
转化与临床前研究
- 科学价值：转染后维持细胞活力，能够在与疾病相关的体系中进行基因表达和表型效应的长期研究。
- 操作价值：利用CHO细胞建立稳定或瞬时转染的临床前模型，CHO细胞是生物制剂生产和通路分析中广泛使用的宿主细胞。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的发现连续过程，在此过程中需要高效的基因递送技术，以评估靶点功能并调控细胞模型中的信号通路。
- 发现生物学：通过在哺乳动物细胞中实现目的基因的可靠过表达或敲低，支持假设验证。
- 筛选：提供标准化、定量的转染结果，便于比较不同的遗传构建体或调控元件。
- 分析：生成基于百分比的效率指标（GFP+细胞/总细胞），支持不同电穿孔程序之间的统计学比较。
- 转化研究：通过产生可用于后续验证的可存活转染细胞，与临床前研究形成衔接，适用于3D模型或共培养系统。
- 企业级复用：提供一种可重复使用的电穿孔能力，适用于多个需要将质粒递送至贴壁或悬浮细胞系的项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过优化电穿孔参数的生物物理特性，提高转染效率，从而增强基因递送结果的预测可靠性。
- 操作价值：通过设定明确的脉冲序列和电场方向控制，提升基因转移操作的可重复性与标准化水平。
- 战略价值：确保在表型评估中实现足够的外源基因表达，减少假阴性结果，从而降低靶点验证过程中的生物学风险。
- 项目组合影响：基于细胞实验中可达到的基因表达水平，实现对遗传靶点的风险调整后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备哺乳动物细胞培养、质粒制备以及荧光显微镜观察转染效率的专业技能。
- 依赖于可编程电场方向变化的高压脉冲发生器及配套电极一体化吸头的设备支持。
- 为确保实验间的可比性，需对脉冲参数（电压、持续时间、次数）和细胞密度进行标准化。
- 需要优化DNA与细胞的比例及孵育时间，以平衡转染效率与细胞应激反应。
- 仅适用于适用于电穿孔的贴壁或悬浮细胞系；原代细胞或敏感细胞可能需要采用其他递送方法。
