Name: 成像遥感信息素在小鼠犁鼻急性组织切片的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学习制备小鼠犁鼻器急性组织切片的方法，用于钙成像技术观察神经元对信息素的反应。该技术有助于研究嗅觉信号传导机制并鉴定未知的信息素受体。

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我们特别感谢Monique Nenniger Tosato提供的出色技术支持，感谢Jean-Yves Chatton给予的科学指导，以及洛桑大学（UNIL）成像CIF平台提供的显微镜设备。本研究由瑞士国家科学基金会提供经费支持。

1. 小鼠犁鼻器的解剖
<ol>
	<li>使用成年小鼠。由于信息素感知涉及多种感觉模式，因此在品系、基因型、性别和年龄之间进行仔细区分非常重要，并会影响实验结果。此处，我们选用成年VG小鼠30，该小鼠此前已被用于鉴定一种信息素-受体配对（2-庚酮-V1rb2）31（图1A）。</li>
	<li>开始解剖前，配制新鲜的冷人工脑脊液（ACSF；NaCl 118 mM，NaHCO3 25 mM，D-葡萄糖 10 mM，KCl 2 mM，MgCl2 2 mM，NaH2PO4 1.2 mM，CaCl2 2 mM；pH 7.4），并用含氧碳酸气体（95% O2 : 5% CO2）饱和。配制时，先混合除CaCl2外的所有ACSF组分，然后直接通入含氧碳酸气体进行饱和。最后加入CaCl2，并用ddH2O定容至所需体积。将ACSF溶液置于冰上保存，直至使用。</li>
	<li>小鼠安乐死应优先采用颈椎脱臼法，或在实验前进行CO2吸入法。</li>
	<li>切下小鼠头部，将其置于持续通入含氧碳酸气体的冷ACSF中，并放在解剖显微镜下。</li>
	<li>剪除下颌，调整头部位置以观察腭部（图1B）。</li>
	<li>使用显微剪刀在腭部上端水平剪开切口（图1B），并用显微解剖镊去除腭膜。用ACSF润湿并清洁暴露的腔体（图1C）。</li>
	<li>剪开鼻中隔的上部和下部（图1C）。小心取出包含犁鼻器（VNO）的鼻中隔组织，并立即置于冰上的ACSF中（图1D）。</li>
	<li>使用显微解剖镊垂直分离犁鼻器的两部分，并小心去除犁鼻器的软骨囊（图1E）。确保完全清除所有软骨碎片。</li>
</ol>
2. VNO 组织切片制备
本节第2部分所述的犁鼻器组织切片制备主要用于钙成像研究。犁鼻器切片也可用于漂浮切片上的免疫组织化学染色，以验证组织的结构完整性（详见本方案第3部分）。
<ol>
	<li>准备低熔点琼脂（3% 溶于标准 PBS）并布置好工作区域。您将需要人工脑脊液（ACSF）、切片机及配套支撑架、显微解剖镊子、包埋模具（22 × 22 × 20 mm）、精密擦拭纸、毛刷、组织培养板、氰基丙烯酸酯胶水、冰和温度计。</li>
	<li>将3%低熔点琼脂注入包埋模具中。在垂直插入短暂吸干的犁鼻器（VNO）之前，确保琼脂温度不超过41°C，以便获得冠状切片（图 2A）。</li>
	<li>将包埋模具置于冰上约1分钟，待其凝固后，从琼脂块上取下模具。将琼脂块修切成金字塔形状，并用胶水固定于切片机的支撑座上（图 2B）。</li>
	<li>在冷的ACSF中使用切片机进行冠状面VNO切片，切片速度为0.5 mm/s，振幅0.7 mm，厚度100 μm，并用毛刷收集组织切片，随后将其转移至盛有冷ACSF的组织培养板中。</li>
	<li>若您的切片中含有内源性荧光信号（如基因靶向神经元中的GFP），可在荧光体视显微镜下进行筛选（图 2C）。</li>
</ol>
3. 副嗅球漂浮切片的免疫组织化学染色
本实验步骤的目的是验证第2节中获得的犁鼻器组织切片的完整性。乙酰化微管蛋白是犁鼻器感觉神经元树突和微绒毛中表达的一种微管/细胞骨架标志物。如需进行钙成像实验，请直接进入本方案的第4节。漂浮式犁鼻器切片的免疫组织化学染色方法可适用于任何目标蛋白表达情况的评估。为此，我们建议在完成方案第1.7步后，将犁鼻器组织置于固定液（含4%多聚甲醛的PBS缓冲液，pH 7.6）中，于4°C固定1小时，并从该步骤起使用pH 7.6的PBS缓冲液，而非ACSF溶液。
<ol>
	<li>在培养板中，将感兴趣的组织切片置于固定液（4% 多聚甲醛 PBS 溶液，pH 7.6）中，4°C 下固定 1 小时。</li>
	<li>将组织切片在含有 10% NGS（正常山羊血清）和 0.5% Triton X-100 的 PBS 溶液中，4°C 下封闭过夜。</li>
	<li>在含有 5% NGS 和 0.25% Triton X-100 的 PBS 溶液中，室温（RT）下与一抗（抗乙酰化微管蛋白，小鼠来源，1:2000）孵育 16 小时。</li>
	<li>用含有 2% NGS 的 PBS 溶液洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在含有 2% NGS 的 PBS 溶液中，室温避光孵育二抗（Cy5 标记的山羊抗小鼠 IgG，1:200）1 小时。</li>
	<li>依次用含 2% NGS 的 PBS、含 1% NGS 的 PBS 和纯 PBS 各洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将切片置于疏水笔划定的疏水区域中央，使用含或不含 DAPI 的荧光封片剂封片，并加盖盖玻片。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜及支持三维重建的软件进行观察和图像采集（图 2D-F）。</li>
</ol>
4. VNO切片上的钙成像
<ol>
	<li>以下操作均需在避光条件下进行。将VNO切片在含有Fura-2AM（7 μM；DMSO中1 mM储备液）和Pluronic 0.1%（w/v；ddH2O中20%储备液）的冷ACSF加载液中，于37°C孵育1小时。</li>
	<li>将加载完成的切片置于冰上，并持续通入含氧碳酸盐混合气体，直至使用。加载后的切片可在该条件下保存3–4小时。</li>
	<li>用毛刷将加载好的切片转移至含有ACSF的灌流腔室中，并使用组织切片固定锚固定切片（图3A）。</li>
	<li>将灌流腔室置于钙成像显微镜的载物台上（图3B），并在室温下持续灌注含氧碳酸盐混合气体饱和的ACSF。温度可通过双极温度控制器进行调节。</li>
	<li>使用倒置荧光显微镜观察加载后的VNO切片（图3C–E），配备25倍或63倍物镜及CooL SNAP-HQ相机。采用多色仪以340/380 nm波长交替激发，图像采集频率为5 Hz，发射光通过510 nm滤光片采集。使用专用软件监测细胞内钙离子比率变化（ΔF = 340 nm/380 nm）。</li>
	<li>化学刺激剂的选择应根据具体实验目的确定。本实验中采用含有信息素混合物（异丁胺、2-庚酮、4-庚酮、2-庚醇、戊酸戊酯、二甲基吡嗪、α/β-法尼烯，浓度为10-6 M）、2-庚酮（10-6 M）或新鲜收集的雄性和雌性小鼠尿液（1:1混合，稀释100倍）的ACSF进行灌流32。实验结束时使用ATP（125 μM）灌流作为细胞活性检测（图3F），应显示约80%的神经元具有活性。在此条件下，切片可在2小时内持续使用。</li>
	<li>通过特异性激发可观察标记GFP的感觉神经元亚群（本实验中为表达V1rb2的神经元），并对其进行精确分析（图3G–I）。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
为了建立一种功能性检测方法，以研究小鼠犁鼻器（VNO）中发生的多种信号转导通路，或用于鉴定新的信息素-受体配对，我们利用了VG小鼠品系（图1A）。在该品系中，240种V1R受体之一的V1Rb2受体被标记了GFP，从而可方便地可视化一类特定的犁鼻感觉神经元亚群。在分离并解剖VNO组织后（图1E），我们制备急性VNO切片（图2C）。其中一部分切片被固定，用于通过乙酰化微管蛋白（acetylated-tubulin）的免疫组织染色来检测和验证组织制备的完整性（图2D-F）。其余切片则用于钙成像实验。实验中，将切片负载Fura-2AM染料（图3C-E），并通过ΔF比值监测每个神经元的胞内钙水平变化（图3F）。通过灌注ATP（125 μM）评估神经元的活性，预期会观察到ΔF比值迅速且短暂的升高（图3F）。由于尿液是信息素的重要来源，因此使用新鲜收集的小鼠尿液（1:100稀释）进行灌注作为内源性对照，可在约50%被记录的神经元中引发钙瞬变（细胞1和2，图3F）。在GFP荧光照射下，可观察到表达V1Rb2的神经元，灌注其已知的信息素配体2-庚酮（2-heptanone）可引发细胞激活（细胞1，图3I）。有趣的是，在一部分不表达V1Rb2受体的神经元（GFP阴性神经元）中也能观察到神经元激活现象（细胞2，图3I），这表明犁鼻器中信息素编码具有复杂性。
<img alt="小鼠犁鼻器（VNO）解剖结构；图B-E展示了用于结构研究的解剖组织。" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 小鼠犁鼻器的解剖过程。（A）VG品系的小鼠。（B）小鼠安乐死后，将其头部置于双目显微镜下，移除下颌以暴露腭部，并进行一个小的水平切口（黑色虚线）。（C）移除腭部后，沿犁鼻器排列的鼻中隔在上部和下部被切断（白色虚线），以便于提取犁鼻器。（D）将犁鼻器置于ACSF溶液中并分离成两部分（插图：两部分的高倍视野）。（E）小心去除犁鼻器的软骨囊，之后的实验均使用去除软骨囊的犁鼻器组织。标尺：B-E，1 mm。
<img alt="显微镜用琼脂制备；包括琼脂制备、VNO样本及荧光成像结果。" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠犁鼻器急性切片制备及组织完整性。（A）将小鼠犁鼻器（VNO）垂直包埋于3%琼脂溶液中，琼脂温度必须低于41°C。（B）将琼脂块切成锥形，并在ACSF中切出100 μm厚的VNO切片（黑色虚线所示）。（C）可在荧光体视显微镜下筛选VNO切片，以观察特定标记的感觉神经元群体。（D–F）可通过乙酰化微管蛋白蛋白的免疫组织染色评估组织完整性；V1rb2基因靶向神经元的高倍视野显示制备过程得到了完美保存。可观察到神经元的长树突延伸至管腔表面（E），以及树突末端和微绒毛中结构蛋白的表达（F）。标尺分别为：B，5 mm；C，60 μm；D，40 μm；E–F，20 μm。
<img alt="ATP反应的热成像与细胞荧光装置；FURA 380 nm分析与数据图。" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 犁鼻器急性组织切片中的钙成像与信息素检测。（A）在Fura-2AM染色孵育后，将VNO切片置于灌流 chamber 中，并使用特制锚具固定（高倍视野）。（B）实验在暗环境中进行，VNO切片通过真空系统在室温（RT）下持续灌流ACSF。温度可通过由双极Pelletier元件和热探头组成的温控系统进行调节。本实验在室温下进行。（C–E）VNO切片可在Hoffman相差显微镜下（C，Hv）或在Fura 380 nm激发光下观察，分别对应神经元激活前（D）和激活期间（E，此处使用ATP）。（F）通过灌流ATP（125 μM）评估神经元活性。此处化学刺激采用尿液（Urine，1:100）或小鼠信息素混合物（mix ph.，10-6 M），以165 ml/h的恒定流速进行。每个细胞（细胞1至3）的胞内钙水平（ΔF）可单独记录。（G）在GFP激发光下观察到一个V1Rb2神经元（1）。（H）显示该神经元（1）以及一个不表达V1Rb2的神经元（2）的染色情况。（I）V1Rb2神经元可响应2-庚酮，表现为胞内钙水平升高。该不表达V1Rb2的神经元（细胞2）也对2-庚酮产生响应。标尺：C–E，20 μm；G–H，15 μm；ΔF = 340 nm / 380 nm。（F和I）刺激施加的持续时间由每条曲线下方的条形表示。伪彩色标尺代表荧光强度。

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<li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li>
<li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的钙成像方法能够在急性脑片制备中记录小鼠副嗅觉神经元对信息素的反应。通过该方法，从动物体内分离至副嗅觉神经元的过程经过一定练习后易于实现，并可获得存活性较长的组织样本。该方法适用于耗时较长的实验，如药理学研究或信息素编码机制的探讨。利用这一生理学技术，可特异性地分析大量神经元群体以及特定的神经元亚群。此外，该方法可轻松地与免疫组织化学技术或其他基于不同钙敏感染料的实验相结合。这些联合方法的应用必将有助于鉴定出小鼠副嗅觉器官中大量孤儿化学感受器所对应的新信息素配体。

<table><tbody><tr><td>腺苷-5&amp;rsquo;-三磷酸二钠盐溶液（ATP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002-100G</td><td>优先用于免疫组织化学</td></tr><tr><td>低熔点琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701-25G</td><td>优先用于钙成像</td></tr><tr><td>CL-100 双极温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>W64-0352</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-175-071</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>317275-100ML</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具，Peel-A-Way</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A-1</td><td> 22 x 22 x 20 mm</td></tr><tr><td>荧光封片剂（含 DAPI 的 Vectashield，10 ml）</td><td>Rectolab</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>FURA-2AM</td><td>Teflabs</td><td>0103</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>Glisseal N（真空润滑脂，60 g）</td><td>Borer Chemie</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>大型浴槽式记录室（RC-26G）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0235</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluor（钙成像软件；v.7.6.5.0）</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗乙酰化微管蛋白小鼠抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793-.2ML</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS，10 ml）</td><td>Interchim</td><td>UP379030</td><td></td></tr><tr><td>记录室平台（P-1）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0277</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127，2 g</td><td>Invitrogen</td><td>P-6867</td><td></td></tr><tr><td>Roti Coll（定量瓶，10 g）</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0258.1</td><td></td></tr><tr><td>SC-20 双通道溶液加热/冷却装置</td><td>Warner Instruments</td><td>W64-0353</td><td></td></tr><tr><td>切片固定锚（SHD-26GKIT）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0266</td><td></td></tr><tr><td>体视荧光显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP 笔（疏水笔）</td><td>Pelco International</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420-250ML</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机 VT 1200S</td><td>Leica Microsystems</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>VisiChrome 高速多色光发生系统</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三维数据可视化软件（Imaris；v.6.3.1）</td><td>Bitplane Scientific Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠副嗅觉系统急性组织切片中信息素感知的成像研究

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson 与 Martin Lüscher 于 1959 年首次使用“信息素”（pheromone）一词1，用以描述用于种内交流的化学物质。信息素是挥发性或非挥发性的短寿命分子2，由生物体液分泌和/或包含其中3,4，例如尿液——已知是信息素主要来源的一种液体3。信息素介导的通讯参与多种关键的动物行为模式，如亲缘关系互动5,6、等级结构组织3以及性行为互动7,8，因而直接关联于特定物种的生存9,10,11。在小鼠中，检测信息素的能力主要由犁鼻器（vomeronasal organ, VNO）介导10,12，该器官成对存在，位于鼻腔底部，包裹于软骨囊内。每个 VNO 呈管状结构，具有管腔13,14，可与外界化学环境接触。其感觉神经上皮主要由犁鼻双极感觉神经元（vomeronasal bipolar sensory neurons, VSNs）构成15。每个 VSN 延伸出一条树突至管腔，末端形成一个较大的树突结节，其上带有多达 100 条微绒毛，参与化学物质的检测16。VSNs 中存在多种亚群，它们因所表达的化学感受器不同而有所区分，因而可能识别不同的配体17,18。两类主要的犁鼻感受器家族 V1Rs 和 V2Rs19,20,21,22 分别包含 24023 和 12024 个成员，并在神经上皮的不同层中表达。此外，嗅觉受体（ORs）25 和甲酰肽受体（FPRs）26,27 也在 VSNs 中表达。
目前尚不清楚这些神经元亚群是否使用相同的下游信号通路来感知信息素。尽管存在于成熟神经元微绒毛中的一种钙离子通透性通道（TRPC2）发挥了重要作用28，但已有研究提出存在不依赖TRPC2的转导通道6,29。由于神经元亚群数量众多，且该器官具有特殊的形态结构，对犁鼻器中信号分子进行药理学和生理学研究十分复杂。
本文介绍了一种用于进行钙成像研究的小鼠犁鼻器（VNO）急性组织切片制备方法。该生理学方法可在活体组织的自然环境中，观察先前加载了钙敏感染料Fura-2AM的一般或特定亚群的犁鼻感觉神经元（VSNs）。该方法也适用于研究任何带有GFP标签的信息素受体，并可调整用于其他荧光钙探针。作为示例，本文使用了一种VG小鼠品系30，该品系采用多顺反子策略，使信息素受体V1rb2的翻译与GFP的表达相偶联。

在小鼠中，检测信息素的能力主要由犁鼻器（VNO）介导。本文介绍了一种用于进行钙成像的VNO急性组织切片制备方法。这种生理学方法可实现对活体组织中神经元亚群和/或单个神经元的观测，且便于进行受体-配体的鉴定。

彼得·卡尔森（Peter Karlson）和马丁·吕舍尔（Martin Lüscher）于1959年首次使用“pheromone”（信息素）一词，用来描述用于种内通讯的化学物质。

本实验的总体目标是建立小鼠RO鼻器官或VNO的急性组织切片制备方法，以便对活体组织中的神经元亚群或单个神经元进行钙成像实验。该目标首先通过从小鼠鼻部取出VNO，然后在解剖显微镜下于冷A CSF中将其从软骨囊中显微解剖分离来实现。随后，将分离的VNO垂直固定于琼脂块中，并使用切片机切割急性冠状组织切片，以验证组织完整性。在共聚焦显微镜下观察免疫组织化学染色后的少数切片。其他切片则加载钙离子敏感性染料，随后灌注假定的信息素配体，并通过钙成像观察神经元的激活情况。该方法有助于解决嗅觉领域中的关键问题。例如，有数百种信息素受体在犁鼻器中表达，但其中仅有极少数受体的配体已被鉴定。信息素受体在异源表达系统中极难表达。因此，我们需要建立一种高效的体内检测方法，以将特定信息素与其对应的特定受体相匹配。我们可以使用触觉小鼠，其中特定神经元亚群表达未知的受体，并可通过GFP的表达来识别。我们还可以利用该检测方法对参与弗雷蒙信号转导级联的离子通道和酶进行药理学研究，以演示该实验流程。今天将由我实验室的两位研究人员Julian和Fabian进行操作。在开始解剖之前。配制新鲜、冰冷的、用氧碳混合气饱和的人工脑脊液：除氯化钙外，将所有组分混合。通过直接向溶液中通入氧碳混合气使其达到饱和。然后加入氯化钙，并用双蒸水定容至所需体积。使用前将A型人工脑脊液（A CSF）置于冰上。在成年小鼠安乐死后进行断头操作，准备一个含有冰冷且持续通氧、碳酸化的A型人工脑脊液的培养皿。移除下颌骨后，将小鼠头部放入培养皿中。将小鼠头部置于解剖显微镜下，以观察腭部。接着，使用显微剪刀在腭部上端水平方向做一切口，然后用显微解剖镊去除腭膜。用人工脑脊液（A CSF）润湿并清洁暴露的腔体。剪切鼻中隔的上部和下部。然后小心取出含有犁鼻器的鼻中隔，并立即将其垂直放入清洁的人工脑脊液（A CSF）中。使用显微解剖镊将犁鼻器的两部分分离。识别犁鼻器（VNO）的软骨囊，然后小心地将其去除，确保所有软骨碎片均被清除。此处所示为分离的VNO、软骨碎片以及未解剖的VNO。首先准备3%低熔点琼脂糖，然后准备好所需工具的工作区域。用琼脂糖填充包埋模具，在将解剖好的VNO浸入前，确保温度低于41摄氏度。将组织垂直放置，以获得冠状切片。将包埋模具置于冰上一分钟，直至钻头凝固。一分钟后，取出钻头块，将琼脂切割成楔形，然后使用微量切片机将其粘附在切片机支撑物上，在冷脑脊液中以每秒0.5毫米的速度、0.7毫米的振幅和100微米的厚度切出冠状VNO切片。用毛刷收集组织切片，并将其置于盛有冷A型人工脑脊液（A CSF）的组织培养皿中，以验证所获取组织切片的结构完整性。随后可对切片进行固定，并针对细胞骨架成分或其他目标蛋白进行免疫染色。此处，紫色显示的乙酰化微管蛋白免疫染色结果表明组织切片具有良好的结构完整性。此外，在特定神经元群体中观察到某种信息素受体被绿色荧光蛋白（GFP）标记，可见神经元形态保存良好，细胞体呈小椭圆形，具有延伸至管腔表面并以微绒毛终止的长树突，上述观察均在暗室中进行。将VNO切片置于含有7 µM URA 2:00 AM和0.1% Ionic的冷A CSF加样液中，在37°C孵育1小时。孵育后，将加载好的切片置于冰上并用含氧碳酸盐溶液保存直至使用。使用画笔将加载好的切片转移至含有A CSF的灌流腔室中，并用组织切片固定锚固定切片。将灌流室置于钙成像系统的显微镜载物台上，并持续用室温的含氧碳酸盐人工脑脊液灌流。使用与染料相对应的荧光波长观察已加载的VNO切片，对于4-O-AM，该波长范围为340至380纳米。使用适当的软件记录细胞内钙离子比率的变化。需要灌流系统以实现化学刺激。在此，显示的是小鼠犁鼻器组织的冠状切片，其中表达V1RB2信息素受体的神经元亚群同时表达GFP，并针对乙酰化微管蛋白（显示为紫色）进行免疫染色。切片的高倍镜视野显示组织完整性得以保持。具有长树突的神经元延伸至管腔表面，树突末端和微绒毛中可见结构蛋白的表达，可用于钙成像。首先使用霍夫曼相差显微镜观察载有FU的组织切片，从血管开始定位感兴趣区域，第一个白色箭头指向血管，观察者缓慢向管腔移动，第二个白色箭头指向管腔，进而到达神经上皮区域。RO鼻神经元呈椭圆形的细胞体，第三个白色箭头所指为其细长的树突，可据此识别。第四个白色箭头指向管腔内的神经元树突 knob。第五个白色箭头指示的是与信息素 RA 负载细胞接触的微绒毛，此处显示的三个 80 纳米颗粒随后依次在三个 40 纳米和三个 80 纳米波长下进行照射，该荧光波长比值图对应于所选神经元内钙离子浓度的变化，即黑色、红色和蓝色圆圈所示区域。使用 ATP 检测法评估神经元的活性。注意三个选定神经元之间钙反应的差异，以及编号为二的神经元（红圈）对TP无反应，因此将被排除在后续分析之外。随后，通过使用尿液和小鼠信息素混合物进行化学刺激，并观察组织切片深层区域。可定位到一群同时表达GFP和V1RRB2受体的神经元。此处展示了一个同时表达GFP和V1RB2受体的神经元，以及一个不表达V1RB2的神经元。两个细胞均加载了URA 2:00 AM，表达V1RB2的神经元在灌注其受体配体2-庚酮时表现出钙离子峰。有趣的是，不表达V1RB2的神经元也对2-庚酮产生反应，表明犁鼻器中信息素编码的复杂性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何提取并显微解剖小鼠的耳蜗柯蒂氏器，以进行急性组织切片制备。该方案也可适用于采用其他钙离子染料和显微镜配置的生理学研究。祝您的实验顺利成功。

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小鼠嗅上皮组织快速解剖与解离以制备单细胞核悬液

学习制备小鼠犁鼻器急性组织切片的方法，用于钙成像技术观察神经元对信息素的反应。该技术有助于研究嗅觉信号传导机制并鉴定未知的信息素受体。

小鼠副嗅觉系统急性组织切片中信息素感知的成像研究

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