小鼠副嗅觉系统急性组织切片中信息素感知的成像研究

本实验的总体目标是建立小鼠RO鼻器官或VNO的急性组织切片制备方法，以便对活体组织中的神经元亚群或单个神经元进行钙成像实验。该目标首先通过从小鼠鼻部取出VNO，然后在解剖显微镜下于冷A CSF中将其从软骨囊中显微解剖分离来实现。随后，将分离的VNO垂直固定于琼脂块中，并使用切片机切割急性冠状组织切片，以验证组织完整性。

在共聚焦显微镜下观察免疫组织化学染色后的少数切片。其他切片则加载钙离子敏感性染料，随后灌注假定的信息素配体，并通过钙成像观察神经元的激活情况。该方法有助于解决嗅觉领域中的关键问题。

例如，有数百种信息素受体在犁鼻器中表达，但其中仅有极少数受体的配体已被鉴定。信息素受体在异源表达系统中极难表达。因此，我们需要建立一种高效的体内检测方法，以将特定信息素与其对应的特定受体相匹配。

我们可以使用触觉小鼠，其中特定神经元亚群表达未知的受体，并可通过GFP的表达来识别。我们还可以利用该检测方法对参与弗雷蒙信号转导级联的离子通道和酶进行药理学研究，以演示该实验流程。今天将由我实验室的两位研究人员Julian和Fabian进行操作。在开始解剖之前。

配制新鲜、冰冷的、用氧碳混合气饱和的人工脑脊液：除氯化钙外，将所有组分混合。通过直接向溶液中通入氧碳混合气使其达到饱和。然后加入氯化钙，并用双蒸水定容至所需体积。

使用前将A型人工脑脊液（A CSF）置于冰上。在成年小鼠安乐死后进行断头操作，准备一个含有冰冷且持续通氧、碳酸化的A型人工脑脊液的培养皿。移除下颌骨后，将小鼠头部放入培养皿中。

将小鼠头部置于解剖显微镜下，以观察腭部。接着，使用显微剪刀在腭部上端水平方向做一切口，然后用显微解剖镊去除腭膜。用人工脑脊液（A CSF）润湿并清洁暴露的腔体。

剪切鼻中隔的上部和下部。然后小心取出含有犁鼻器的鼻中隔，并立即将其垂直放入清洁的人工脑脊液（A CSF）中。使用显微解剖镊将犁鼻器的两部分分离。

识别犁鼻器（VNO）的软骨囊，然后小心地将其去除，确保所有软骨碎片均被清除。此处所示为分离的VNO、软骨碎片以及未解剖的VNO。首先准备3%低熔点琼脂糖，然后准备好所需工具的工作区域。用琼脂糖填充包埋模具，在将解剖好的VNO浸入前，确保温度低于41摄氏度。将组织垂直放置，以获得冠状切片。

将包埋模具置于冰上一分钟，直至钻头凝固。一分钟后，取出钻头块，将琼脂切割成楔形，然后使用微量切片机将其粘附在切片机支撑物上，在冷脑脊液中以每秒0.5毫米的速度、0.7毫米的振幅和100微米的厚度切出冠状VNO切片。

用毛刷收集组织切片，并将其置于盛有冷A型人工脑脊液（A CSF）的组织培养皿中，以验证所获取组织切片的结构完整性。随后可对切片进行固定，并针对细胞骨架成分或其他目标蛋白进行免疫染色。此处，紫色显示的乙酰化微管蛋白免疫染色结果表明组织切片具有良好的结构完整性。此外，在特定神经元群体中观察到某种信息素受体被绿色荧光蛋白（GFP）标记，可见神经元形态保存良好，细胞体呈小椭圆形，具有延伸至管腔表面并以微绒毛终止的长树突，上述观察均在暗室中进行。

将VNO切片置于含有7 µM URA 2:00 AM和0.1% Ionic的冷A CSF加样液中，在37°C孵育1小时。孵育后，将加载好的切片置于冰上并用含氧碳酸盐溶液保存直至使用。使用画笔将加载好的切片转移至含有A CSF的灌流腔室中，并用组织切片固定锚固定切片。

将灌流室置于钙成像系统的显微镜载物台上，并持续用室温的含氧碳酸盐人工脑脊液灌流。使用与染料相对应的荧光波长观察已加载的VNO切片，对于4-O-AM，该波长范围为340至380纳米。使用适当的软件记录细胞内钙离子比率的变化。需要灌流系统以实现化学刺激。

在此，显示的是小鼠犁鼻器组织的冠状切片，其中表达V1RB2信息素受体的神经元亚群同时表达GFP，并针对乙酰化微管蛋白（显示为紫色）进行免疫染色。切片的高倍镜视野显示组织完整性得以保持。具有长树突的神经元延伸至管腔表面，树突末端和微绒毛中可见结构蛋白的表达，可用于钙成像。

首先使用霍夫曼相差显微镜观察载有FU的组织切片，从血管开始定位感兴趣区域，第一个白色箭头指向血管，观察者缓慢向管腔移动，第二个白色箭头指向管腔，进而到达神经上皮区域。RO鼻神经元呈椭圆形的细胞体，第三个白色箭头所指为其细长的树突，可据此识别。

第四个白色箭头指向管腔内的神经元树突 knob。第五个白色箭头指示的是与信息素 RA 负载细胞接触的微绒毛，此处显示的三个 80 纳米颗粒随后依次在三个 40 纳米和三个 80 纳米波长下进行照射，该荧光波长比值图对应于所选神经元内钙离子浓度的变化，即黑色、红色和蓝色圆圈所示区域。使用 ATP 检测法评估神经元的活性。

注意三个选定神经元之间钙反应的差异，以及编号为二的神经元（红圈）对TP无反应，因此将被排除在后续分析之外。随后，通过使用尿液和小鼠信息素混合物进行化学刺激，并观察组织切片深层区域。可定位到一群同时表达GFP和V1RRB2受体的神经元。

此处展示了一个同时表达GFP和V1RB2受体的神经元，以及一个不表达V1RB2的神经元。两个细胞均加载了URA 2:00 AM，表达V1RB2的神经元在灌注其受体配体2-庚酮时表现出钙离子峰。有趣的是，不表达V1RB2的神经元也对2-庚酮产生反应，表明犁鼻器中信息素编码的复杂性。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何提取并显微解剖小鼠的耳蜗柯蒂氏器，以进行急性组织切片制备。该方案也可适用于采用其他钙离子染料和显微镜配置的生理学研究。祝您的实验顺利成功。