Name: 循环压力为生物反应器的设计体外主动脉心脏瓣膜的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 了解循环压力生物反应器在心血管研究中的应用，通过模拟不同压力条件研究主动脉心脏瓣膜组织的机械生物学响应。该方法有助于深入理解心脏瓣膜疾病的发病机制并开发组织工程构建物。

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作者感谢 Shad Schipke 和 Daniel Chesser 在系统设计与制造方面的协助，以及 Valtresa Myles 在 manuscript 准备过程中的帮助。

1. 组织收获与制备
<ol>
<li>应在成年猪死亡后立即获取主动脉瓣，猪的体重不应超过120磅。</li>
<li>用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗瓣膜两次，并在冰上运输至实验室。</li>
<li>所有后续操作均应在无菌条件下进行。</li>
<li>确保瓣叶无任何退变、撕裂或钙化迹象。从瓣环起沿距离的1/3处剪切，将瓣叶从主动脉根部分离。</li>
<li>将瓣叶分别放入六孔板的各个孔中，加入3 ml杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），培养基中添加1%抗生素/抗真菌溶液和10%胎牛血清，于37°C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
<li>作为替代方案，可将分离的细胞接种至六孔培养板中，并用于压力装置。瓣膜内皮细胞和间质细胞的分离可参照先前所述方法进行13, 14。</li>
</ol>
2. 压力研究
<ol>
<li>已设计一种定制的压力系统，用于研究循环压力对主动脉瓣组织的力学生物学效应15。</li>
<li>登录计算机并打开 labVIEW 程序（图1）。</li>
<li>校准：<ol>
<li>实验前应正确校准系统。</li>
<li>将电源连接至电路板，以为控制空气进出腔室的电磁阀供电。</li>
<li>确保压缩空气已连接至系统，并将气源完全打开。</li>
<li>打开信号放大器，确保电压读数为 0.00，必要时进行调整。</li>
<li>labVIEW 界面上有一个标有“TEST/RECORD”的开关，确保其处于“TEST”位置。点击标有“Air Supply”的按钮，以打开进气电磁阀。</li>
<li>使用气体压力调节器，将压缩空气以 1 PSI 的压力对腔室加压。腔室内的压力可通过位于腔室后端板上的数字压力表读取。待压力平衡后，记录信号放大器的电压读数。重复此步骤，分别在 2、3、4 和 5 PSI 下进行。</li>
<li>绘制压力与电压的校准曲线。压力单位应从 PSI 转换为 mmHg。所得曲线方程可输入至 labVIEW 程序代码中。</li>
</ol>
</li>
<li>拆下压力腔室的铝制前板，并用 70% 乙醇喷洒腔室内部，静置至少 10 分钟，使残留乙醇蒸气充分挥发。</li>
<li>将含有瓣叶样本的六孔板放入腔室内，重新安装前端板。手动拧紧位于端板四个角的四根螺纹杆上的螺母，确保密封严密。将压力腔室放入 37°C 培养箱中。图 2 显示了压力腔室的示意图。</li>
<li>界面将提示用户设置系统在压缩空气输入与输出之间循环的时间。为模拟舒张期和收缩期条件，应分别将时间设置为 0.6 秒和 0.4 秒，频率为 1 Hz。用户还应输入数据文件保存路径。</li>
<li>在 labVIEW 中点击“运行”，并将“TEST/RECORD”开关切换至“RECORD”位置。</li>
<li>通过 labVIEW 界面上的图表确认压力已达到预期水平。可通过气体压力调节器调节压力。</li>
<li>按所需时长运行程序。</li>
<li>实验完成后，点击 labVIEW 上的停止按钮，关闭气源，并打开压力腔室的排气阀。</li>
<li>从腔室中拆下前端板，取出含有样本的六孔板。样本现可用于基因表达、蛋白表达、组织学、力学性能等分析。</li>
</ol>
3. 代表性结果：
该压力系统能够模拟在正常血压、I期和II期高血压条件下观察到的最大跨瓣压力。然而，该系统无法模拟体内的收缩期压力梯度，后者在体内基本为零。频率保持在1 Hz，进气时间为0.6秒，排气时间为0.4秒。系统获得的正常和升高压力条件下的代表性压力波形如图3所示。
<img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig1.jpg" alt="实验用数据采集界面，包含压力传感器、空气供应监测器和控制图表。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 图1： LabVIEW 界面的屏幕截图。
<img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig2.jpg" alt="静态平衡；结构梁组件示意图；螺栓与框架设计。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图2"> 图2： 压力室示意图 A. 压力室的等轴测视图； B. 压力室的侧视图； C. 压力室的俯视图。
<img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig3.jpg" alt="血压随时间变化的曲线图，显示在三次不同试验中6秒内的压力波动。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 图3： 压力室内部压力模拟图，分别对应（A）正常血压、（B）I期高血压和（C）II期高血压条件。

<ol><li>Freeman, R. V., Otto, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+calcific+aortic+valve+disease%3A+pathogenesis%2C+disease+progression%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies.</a> Circulation. 111, 3316-3326 (2005).</li>
<li>Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+of+degenerative+disease+of+the+trileaflet+aortic+valve%3A+review+of+subject+and+presentation+of+a+new+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory.</a> Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).</li>
<li>Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+calcific+deposits+in+operatively+excised+stenotic+or+purely+regurgitant+aortic+valves+and+their+relation+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress.</a> Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).</li>
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<li>Cawley, P. J., Otto, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+calcific+aortic+valve+stenosis+-+fact+or+fiction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction.</a> Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).</li>
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<li>Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+ex+vivo+culture+system+to+investigate+the+effects+of+shear+stress+on+cardiovascular+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue.</a> J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).</li>
<li>Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cyclic+stretch+bioreactor+for+tissue-engineered+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves.</a> Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).</li>
<li>Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bioreactor+for+the+controlled+application+of+complex+mechanical+stimuli+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Inst+Mech+Eng+H%22%5BJournal%5D)">A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering.</a> Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).</li>
<li>Wartella, K. A., Wayne, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+for+biaxial+mechanical+stimulation+to+tissue+engineered+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs.</a> J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).</li>
<li>Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+study+of+a+novel+urinary+bladder+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor.</a> Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).</li>
<li>Butcher, J. T., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valvular+endothelial+cells+regulate+the+phenotype+of+interstitial+cells+in+co-culture%3A+effects+of+steady+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress.</a> Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).</li>
<li>Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+Strain+Regulates+Pro-Inflammatory+Protein+Expression+in+Porcine+Aortic+Valve+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Valve+Dis%22%5BJournal%5D)">Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells.</a> J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).</li>
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<li>Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immediate-early+gene+responses+to+elevated+pressure+in+porcine+aortic+valve+interstitial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Valve+Dis%22%5BJournal%5D)">Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells.</a> J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).</li>
<li>Brathwaite, D., Weissman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+onset+of+atrial+arrhythmias+following+major+noncardiothoracic+surgery+is+associated+with+increased+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality.</a> Chest. 114, 462-468 (1998).</li>
<li>Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+arrhythmias+in+colorectal+surgical+patients%3A+incidence+and+clinical+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Colorectal+Dis%22%5BJournal%5D)">Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates.</a> Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).</li>
<li>Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+arrhythmias+after+non-cardiothoracic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery.</a> BMJ. 7, 333-333 (2006).</li>
<li>Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+arrhythmias+in+general+surgical+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+R+Coll+Surg+Engl%22%5BJournal%5D)">Postoperative arrhythmias in general surgical patients.</a> Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

该压力系统成功地使主动脉瓣瓣叶暴露于能够代表舒张期跨瓣压力的周期性压力下。然而，该系统无法模拟收缩期跨瓣压力，因为压力仅下降至40 mmHg。跨瓣压力是指升主动脉与左心室之间的压力差。在舒张期，当瓣膜关闭时，正常血压条件下的压力差为80 mmHg，I期和II期高血压条件下分别为90 mmHg和100 mmHg。在收缩期，当瓣膜开放时，左心室与升主动脉之间的压力差为零。主动脉瓣疾病中发生的细胞变化被认为与较高的舒张期压力相关；因此，压力未能降至零可能并非主要问题。这一判断基于如下假设：驱动生物学反应的是压力的大小，而非压力的振幅。根据对20个压力周期的数据分析，压力从100 mmHg降至0 mmHg所需时间为1.20 ± 0.04秒。由于主动脉瓣关闭的时间约占心动周期的2/3，因此为在生理条件下实现瓣膜开闭的相同平衡，空气进入压力腔室的时间需达2.4秒。因此，若要同时研究收缩期和舒张期跨瓣压力水平对主动脉瓣力学生物学的影响，应采用0.28 Hz的频率。然而，若需在1 Hz的生理频率下同时模拟收缩期和舒张期跨瓣压力，则可在排气电磁阀上加装真空泵和储气罐。可设定真空泵以移除固定量的压力，当排气阀开启时，系统将把为完全降低设定压力水平所需量的空...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>抗真菌/抗生素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>氟橡胶隔膜电磁阀</td><td>McMaster-Carr</td><td>4868K11</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>PX302-200GV</td><td></td></tr><tr><td>载荷传感器调节器</td><td>Encore Electronics, Inc.</td><td>4025-101</td><td></td></tr><tr><td>数据采集（DAQ）模块</td><td>Measurement Computing</td><td>PMD1608</td><td></td></tr></tbody></table>

设计一种用于循环压力生物反应器的装置 离体 主动脉心脏瓣膜的研究

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

主动脉瓣位于左心室和主动脉之间，允许单向血流，防止血液反流回心室。主动脉瓣瓣叶由悬浮在细胞外基质（ECM）中的间质细胞构成，表面覆盖有一层内皮细胞单层。该瓣膜承受着严酷且动态的环境，持续受到剪切力、弯曲、张力和压缩力的作用。研究表明，病变瓣膜中的钙化病灶常出现在机械应力较高的区域，这是由于内皮损伤或间质基质受损所致1-3。因此，流行病学研究显示高血压是主动脉瓣疾病发生的主要危险因素之一，这一点并不令人意外4。
目前针对瓣膜疾病的唯一治疗选择是通过生物瓣膜或机械瓣膜进行手术置换5。深入理解瓣膜在物理应力作用下的生物学反应，将有助于阐明瓣膜病变的机制。这反过来可能促进非侵入性治疗方法（如药物干预或预防）的开发。已有多种生物反应器被用于研究天然或组织工程心脏瓣膜的力学生物学特性6-9。此外，脉动式生物反应器也被开发用于研究多种组织，包括软骨10、骨11和膀胱12。本研究的目的是开发一种循环加压系统，用于阐明主动脉瓣瓣叶在压力负荷增加时的生物学响应。
该系统由一个丙烯酸腔室组成，用于放置样品并产生循环压力；采用氟橡胶隔膜电磁阀来控制压力循环的时序；并通过计算机控制电气设备。压力通过压力传感器进行监测，信号经由载荷传感器调节器进行调理。LabVIEW 程序通过模拟设备调节压力，以适当速率将压缩空气泵入系统。该系统可模拟与主动脉瓣相关的动态跨瓣压力水平；通过锯齿波实现压力的缓慢上升，典型地再现了舒张期跨瓣压力梯度的变化特征，随后出现急剧的压力下降，以模拟收缩期瓣膜的开启。LabVIEW 程序允许用户控制循环压力的幅度和频率。该系统能够对组织样品施加生理和病理条件下的压力刺激。该装置可用于加深我们对心脏瓣膜如何响应局部力学环境变化的理解。

已设计出一种循环压力生物反应器，可对心脏瓣膜组织施加生理和病理条件下的压力。LabVIEW 程序允许用户控制压力的大小、振幅和频率。该装置可用于研究心脏瓣膜组织或分离细胞的力学生物学特性。

主动脉瓣位于左心室与主动脉之间，允许单向血流通过，防止血液反流回心室。主动脉……

本实验的总体目标是确定主动脉心脏瓣膜组织或细胞对循环压力的生物学反应。首先从功能不良的心脏中分离瓣膜组织，并在组织培养基中过夜孵育。实验的第二步是确保压力系统已校准。接下来。将瓣膜组织或细胞放入压力系统中。将腔室置于37摄氏度的培养箱中，并在所需的时间内以设定的强度和频率开始循环压力处理。最后，从系统中取出组织进行生物学分析。最终，可以获得显示压力升高如何通过实时 PCR、Western 印迹或显微镜技术影响基因和蛋白质表达的结果。该技术的主要优势在于，我们能够将机械压力的作用与其他机械力和生化刺激因素的影响分离开来。相较于动物模型等其他技术，这是一个优势，尽管动物模型也可用于帮助我们理解机械力如何影响生物学过程以及心脏瓣膜的发病机制。它还可用于开发组织工程构建物。现在由我实验室的研究生toy fate为我们演示该操作流程。准备用于加压的组织。研究在成年雌性猪死亡后立即采集其主动脉瓣，猪的体重不超过120磅。用无菌PBS清洗瓣膜两次，然后置于冰上并运送至实验室。所有后续步骤均应在无菌条件下进行。确保小叶无任何退化、撕裂或钙化迹象。从瓣环起沿距离的三分之一处切割，将小叶从主动脉根部切除。将小叶分别放入六孔板的各个孔中，每孔加入3 mL DMEM，添加1%抗生素-抗真菌溶液和10%胎牛血清，于37°C及5%二氧化碳条件下孵育过夜。该压力系统为定制装置，旨在研究周期性压力对主动脉瓣组织的力学-生物学效应。使用该系统时，首先登录计算机并打开LabVIEW程序。检查压缩空气是否已连接至系统，并将气源完全打开至最大流速。打开信号放大器。确保电压读数为 0.00，必要时进行调整。实验室视图界面有一个标有“测试记录”的开关，将开关置于“测试”位置。点击标有“气源”的按钮，以打开进气电磁阀。使用气体压力调节器，用压缩空气对腔室加压至1 PSI。通过腔室后端板上的数字压力表读取腔室内的压力。当压力达到平衡后，记录信号放大器的电压读数。依次对 2、3、4 和 5 PSI 重复该步骤。随后绘制压力与电压之间的校准曲线。将压力从 PSI 转换为毫米汞柱。将图表中的方程输入到 LabVIEW 程序的代码中。取下压力室的铝制前板，并用 70% 乙醇喷洒压力室。将含有小叶样本的六孔板放入腔室中，并重新安装前端板。通过手动拧紧位于四根螺纹杆上的螺母，确保密封处密闭不漏气。将压力腔室放入37摄氏度的培养箱中。输入系统在压缩空气输入和输出之间循环的时间。为了模拟每秒一次的舒张期和收缩期条件，这些时间应分别设置为 0.6 秒和 0.4 秒。然后在 LabVIEW 中输入数据文件路径。点击运行并切换测试记录开关以开始记录。通过LabVIEW界面中的图表检查压力是否达到所需水平。如有必要，使用气体压力调节器调整压力。实验完成后，在实验室界面中点击“停止”，关闭气源并打开压力室的排气阀。最后从培养箱中取出压力系统，然后拆下压力室前端的端板，取出六孔板。现在可以对样本进行基因表达、蛋白质表达、组织学和机械性能分析，以表征正常和升高压强下的压力波形。系统获得的条件如图所示，为体内条件。在舒张期，左心室与升主动脉之间存在压强差，使主动脉瓣在正常生理条件下保持关闭状态。这种跨瓣压力为80毫米汞柱。然而，在一级和二级高血压状态下，跨瓣压力可分别升高至90和100毫米汞柱。该压力系统能够模拟在正常、一级和二级高血压条件下所观察到的最大跨瓣压力。此处展示了从系统中获得的正常和压力升高条件下的代表性压力波形。通过遵循该操作流程，我们能够在瓣膜上进行其他方法，如PCR、Western印迹以及显微镜检查。这有助于我们理解基因表达和蛋白质合成的变化，进而加深对心脏瓣膜中机械传导机制的认识。该技术在帮助我们理解力学生物学及疾病机制方面发挥了重要作用，并且未来还可能帮助我们理解其他在体内可能经历压力变化的组织所发生的变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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