Name: 大肠癌细胞表面蛋白的分析，使用一种抗体的芯片和荧光多路复用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 17 s
Description: 学习使用DOT scan抗体芯片和荧光多路复用技术分析大肠癌细胞表面蛋白，通过捕获活细胞进行分子分型，识别不同细胞亚群并发现潜在预后生物标志物。

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我们感谢皇家阿尔弗雷德亲王医院和康科德退伍军人医院解剖病理学实验室的工作人员采集了结直肠癌及正常肠黏膜的新鲜样本。本工作由新南威尔士州癌症研究所转化项目基金资助。

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="细胞分离与抗体点阵图示；肿瘤解离、细胞抗原分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 从结直肠癌手术样本制备活细胞悬液的工作流程。
1. 临床样本解离
所有样本均在方案编号 X08-164 下，经知情同意后，自澳大利亚新南威尔士州坎珀当的皇家阿尔弗雷德亲王医院（Royal Prince Alfred Hospital）和澳大利亚新南威尔士州康科德西区的康科德复员医院（Concord Repatriation Hospital）采集。
<ol>
 <li>采集新鲜的结直肠癌（CRC）或腺瘤标本，以及距离肿瘤至少10 cm的正常肠黏膜组织。切除后，将样本置于pH 7.3的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中，4°C下保存不超过12小时。</li>
 <li>遵循人类病原体相关安全规范，在II级生物安全柜中处理所有临床样本。使用两把手术刀片在培养皿中将组织切成约2 mm的立方体。</li>
 <li>将肿瘤组织和正常组织分别置于Eppendorf管中，加入等体积含2%（v/v）IV型胶原酶（Worthington, Lakewood, NJ, USA）和0.1%（w/v）牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNAse I; Sigma-Aldrich）的RPMI 1640培养基，在37°C孵育60分钟，期间轻柔混匀数次。</li>
 <li>使用10 mL注射器的推杆将部分消化的组织通过细金属网筛过滤，并用HBSS冲洗细胞。</li>
 <li>将所得细胞悬液依次通过200 μm和50 μm的Filcon滤膜（BD Biosciences），以去除细胞团块。此系列过滤步骤可有效去除大部分DNA、黏液及细胞聚集体。</li>
 <li>将细胞悬液在20°C下以400 × g离心5分钟。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于含10%二甲基亚砜（DMSO）的热灭活胎牛血清（FCS）中，缓慢冷冻于冻存管，随后置于-80°C保存。冷冻过程有助于减少样本中的黏液并裂解红细胞。</li>
</ol>
2. 细胞捕获的样品制备
<ol>
 <li>在37°水浴中快速解冻样本，并将细胞重悬于10 mL HBSS中以去除DMSO。</li>
 <li>在20°条件下，以410 × g离心细胞悬液5分钟。</li>
 <li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 μL HBSS中。</li>
 <li>室温下用0.1% (w/v) DNA酶I处理样本20分钟。</li>
 <li>取10 μL细胞悬液与等体积台盼蓝混合，将10 μL混合液加入血细胞计数板。在100倍放大倍率的光学显微镜下计数活细胞（因排斥台盼蓝而呈透明状），死细胞则摄取染料而着色。微阵列细胞捕获至少需要4 × 106个活细胞。</li>
 <li>DNA酶处理后，将细胞悬液重悬于10 mL HBSS中，在20°条件下以410 × g离心5分钟。</li>
 <li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于RPMI 1640培养基中，终体积为200 μL。</li>
</ol>
3. 抗体微阵列细胞捕获
<ol>
 <li>将DotScan抗体微阵列浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中约20秒，以润湿硝酸纤维素区域。用折叠的Kimwipe小心擦拭微阵列的玻璃边缘，避免触碰硝酸纤维素区域。</li>
 <li>向微阵列孵育槽中加入水，以提供湿润环境。将微阵列放入孵育槽中，并用移液器将RPMI 1640培养基中的细胞悬液滴加到湿润的硝酸纤维素区域上。在硝酸纤维素区域的每个角落滴加液滴，以确保细胞均匀分布。</li>
 <li>将微阵列在37°C下孵育1小时。孵育过程使细胞沉降并与微阵列上的抗体接触。表达与所接触抗体相对应的表面抗原的细胞将被捕获。</li>
 <li>孵育结束后，将微阵列轻轻且垂直地浸入三个盛有至少15 mL PBS的槽中，以洗去未结合的细胞（每次洗涤20秒）。</li>
 <li>用PBS配制3.7%（w/v）的甲醛溶液，用于通过交联固定细胞和抗体。轻轻移取约1 mL溶液覆盖微阵列的硝酸纤维素区域，在室温下孵育20分钟。</li>
 <li>随后将微阵列依次浸入三份PBS（每份15 mL，每次30秒）中，以洗去多余的甲醛。</li>
 <li>用Kimwipe擦拭玻片的边缘和背面，并在硝酸纤维素区域保持湿润的状态下，使用DotScan扫描仪对微阵列进行扫描。光学扫描可提供混合细胞群体的抗原表达模式，例如结直肠癌细胞、白细胞及其他肿瘤间质细胞。</li>
</ol>
4. 荧光多重检测
<ol>
 <li>从扫描仪中取出微阵列，加入200 μL封闭缓冲液（2% w/v BSA，2%热灭活人AB血清，PBS，pH 7.3），在室温下于微阵列托盘中孵育20分钟。</li>
 <li>在覆盖铝箔的Eppendorf管中配制多重检测溶液：20 μL藻红蛋白-抗CD3抗体（Beckman Coulter，Gladesville，NSW，澳大利亚，#IM12824；终稀释倍数1/7.5）、10 μL Alexa Fluor 647-抗EpCAM抗体（Biolegend，San Diego，CA，美国；稀释倍数1/15）、2 μL热灭活人AB血清（Sigma-Aldrich，Castle Hill，NSW，澳大利亚）以及118 μL封闭缓冲液。</li>
 <li>吸除微阵列上多余的封闭缓冲液，将多重检测溶液用移液器加至硝酸纤维素区域，并均匀铺展。室温避光孵育30分钟。</li>
 <li>将微阵列垂直浸入三槽新鲜PBS（每槽15 mL）中，每次30秒。</li>
 <li>让微阵列在避光条件下自然干燥，并置于4°C的载玻片盒中保存。微阵列可在避光条件下保存长达3个月而不损失荧光信号。</li>
 <li>使用Typhoon FLA 9000扫描仪（GE Healthcare，Rydalmere，NSW，澳大利亚）扫描干燥的微阵列，分辨率为50（PE检测使用532 nm激光和580 BP30发射滤光片；Alexa 647检测使用633 nm激光和670 BP30发射滤光片）。扫描时将微阵列的硝酸纤维素面朝下放置于玻璃扫描托盘上。</li>
 <li>将荧光图像保存为TIFF文件，并使用Photoshop将图像尺寸设置为17 x 25 cm，分辨率为72像素/cm。将图像导入DotScan分析软件以分析各点的信号强度。</li>
 <li>DotReader可捕获点结合模式的数字图像，并在8位灰度标度（1–256 U）上量化每个抗体点上的细胞结合密度。对于具有相应免疫球蛋白同型的抗体，需从其结合值中扣除偶发的非特异性同型对照结合信号。每个微阵列的点荧光强度均以最强信号点为100%进行归一化处理。信号/斑点强度记录于.xml文件（原始数据）中，或以柱状图形式呈现在.pdf文件（最终报告）中。</li>
 <li>微阵列热图及层次聚类分析使用TM4微阵列软件套件中的MultiExperiment Viewer（MeV）4.4版本（<a href="http://www.tm4.org/mev.html">http://www.tm4.org/mev.html</a>）完成。基于背景校正后的数据，采用MeV软件进行完全连锁聚类分析，相似性度量使用欧氏距离。采用双尾Student t检验（假设方差相等）评估结果的统计学显著性。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
DotScan 芯片实验的结果应在重复芯片之间显示出一致的细胞结合模式。强信号点结合（CD44/CD29）可使网格准确覆盖芯片区域。图2展示了细胞捕获和多重检测的理想示例。图3展示了一些在细胞捕获过程中常见的问题及可能的解决方案。
通过测量以1至256灰度级表示的点阵强度，可对微阵列细胞结合结果进行定量分析。图4展示了来自58例手术切除的结直肠癌（CRC）样本的数值数据，这些样本经EpCAM-Alexa 647抗体染色，以热图形式呈现并进行层次聚类分析。尽管样本数量有限，相同分期的结直肠癌倾向于聚类在同一组中。
<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig2.jpg" alt="蛋白质微阵列示意图及数据可视化：a）布局，b）灰度结果，c）红色荧光，d）蓝色荧光。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 临床结直肠癌肿瘤（澳大利亚临床病理分期，ACP B1期）的细胞结合模式。（a）DotScan抗体图示，显示重复微阵列左半部分的抗体位置（已标出）。上部区域包含DotScan白血病微阵列原有的82种抗体。额外添加了40种抗体，对应文献中发现表达上调的特定表面抗原，构成结直肠癌“卫星”微阵列。下部区域为同型对照抗体。（b）结直肠癌细胞与微阵列结合的光学图像。（c）CD3荧光图像，显示T细胞。（d）EpCAM荧光图像，显示结直肠癌细胞。
<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig3.jpg" alt="静态平衡；ΣFx=0；点阵模式分析；实验；力分布可视化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. DotScan 结果不佳的示例及可能的解决方案。（a）细胞结合率低；解决方案：确保阵列上至少有 4×10⁶ 个活细胞。（b）同型对照结合及非特异性细胞结合；解决方案：在样品与微阵列孵育前，加入热灭活的人 AB 血清，以减少同型对照结合。偶尔，结直肠癌（CRC）样本会出现少量细胞与硝酸纤维素膜的非特异性结合，但不会显著影响结果。（c）孵育过程中硝酸纤维素膜干燥；解决方案：确保样品覆盖整个硝酸纤维素区域，并将微阵列置于水平面上孵育。（d）高背景干扰；解决方案：确保孵育后对微阵列进行充分洗涤。
<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig4.jpg" alt="结直肠癌分析；光学与多重扫描；EpCAM、CD3标志物；对比柱状图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. DotScan分析软件生成的柱状图，表示在1至256灰度范围内细胞结合密度。坐标轴上的数字代表CD抗原。其他缩写包括：TCR，T细胞受体；κ、λ，免疫球蛋白轻链；sIg，表面免疫球蛋白；DCC，结直肠癌缺失蛋白；EGFR，表皮生长因子受体；FAP，成纤维细胞活化蛋白；HLA-A,B,C、HLA-DR，分别为人类白细胞抗原A、B、C和DR；MICA，主要组织相容性复合物I类链相关蛋白A；MMP-14，基质金属肽酶14；PIGR，多聚免疫球蛋白受体；TSP-1，血小板反应蛋白-1；Mabthera，人源化抗CD20抗体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3322/3322fig4large.jpg">点击此处查看大图</a>。

<ol><li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Technol.+Cancer.+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297(2002).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

在本视频中，我们演示了如何以简单且半定量的方式使用 DotScan 抗体微阵列来研究来自结直肠癌组织的细胞群体的表面抗原谱型。
从组织中获得有活力的单细胞悬液对实验的成功至关重要，因为细胞在孵育过程中与抗体点牢固结合需要依赖能量的过程（例如抗原成帽和/或伪足形成），而死细胞则会在后续洗涤步骤中被去除。最初使用Ⅰ型胶原酶进行组织解离8，但随后被胶原酶4取代，后者对细胞膜的损伤更小，因其含有的蛋白酶污染物较少。这一改变未影响细胞得率、活力或结合模式。某些肿瘤及对照样本中的黏液会降低细胞得率并干扰细胞捕获。通过将解离后的细胞悬液保存在-80°C的10% DMSO/FCS中，可最大程度减少黏液的黏附性，推测是由于冻融过程改变了黏液的理化性质所致。9随后，所有样本在解离后均用含10% DMSO/FCS的冻存液保存，并快速解冻以制备活细胞悬液，确保结合模式一致。样本中存在 &lt;存活率为50%或在对照/管家基因点（CD44/CD29）上显示结合不良的样本被排除在分析之外。
一些抗体克隆在结合硝酸纤维素膜时表现出亲和...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au

Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table><tbody><tr><td>汉克斯&amp;rsquo; 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6136-10X1L</td><td>以 25 mM Hepes (Sigma #H3375) 缓冲</td></tr><tr><td>II级Airpure生物安全柜</td><td>西屋电气</td><td>1687-2340/612</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>利文斯通</td><td>090609</td><td>100 个装</td></tr><tr><td>含 2 mM Hepes 的 RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4130-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV型</td><td>沃辛顿生物化学</td><td>4188</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 注射器（10 mL）</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SS+10L</td><td>100个装的一盒</td></tr><tr><td>Filcon 滤膜（200 &amp;mu;m)</td><td>BD 生物科学</td><td>340615</td><td></td></tr><tr><td>Filcon 滤器（50 &amp;mu;m)</td><td>Filcon 滤膜（50 &amp;#181;m)</td><td>Filcon 滤膜（50 &amp;#181;m) Filcon 滤膜（50 &amp;#181;340603</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>7017</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板 Technocolor Neubar</td><td>Hirschmann</td><td>暂无内容</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>尼康 TMS</td><td></td></tr><tr><td>Cyrovial 管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>121278</td><td></td></tr><tr><td>冷冻保存管</td><td>Nalge Nunc International</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DotScan抗体微阵列试剂盒</td><td>Medsaic</td><td>暂无内容</td><td></td></tr><tr><td>DotScan 微阵列洗涤槽</td><td>Medsaic</td><td>暂无内容</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>金佰利公司</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DotReader™</td><td>Medsaic</td><td>暂无内容</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-10G</td><td></td></tr><tr><td>2% 热灭活 AB 血清</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>藻类学&amp;#8211;CD3-藻红蛋白偶联物</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>ET386</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor647 标记的 EpCAM</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-08</td><td>532 nm 激光器，PE 采用 580 BP30 发射滤光片；633 nm 激光器，Alexa647 采用 670 BP30 发射滤光片</td></tr><tr><td>多实验查看器 v4.4</td><td>TM4 微阵列软件套件</td><td>打开 &amp;#8211; 开源软件（参考文献11）</td><td></td></tr></tbody></table>

使用抗体微阵列和荧光多重技术对结直肠癌细胞表面蛋白进行分析

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

目前结直肠癌（CRC）的预后评估和分类依赖于整合了组织病理学和临床发现的分期系统。然而，在大多数结直肠癌病例中，细胞功能障碍是由大量突变引起的，这些突变会改变蛋白质的表达和翻译后修饰1。
已鉴定出多种细胞表面抗原（包括分化簇（CD）抗原）可作为结直肠癌（CRC）潜在的预后或转移性生物标志物。这些抗原是理想的生物标志物，因为它们的表达常随着肿瘤进展或其他细胞类型（如肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs））的相互作用而发生变化。
对于某些肿瘤类型，利用免疫组织化学（IHC）进行癌症亚型分类和预后评估已有充分依据2,3。然而，目前尚无任何单一的“标志物”在预后价值上超越临床病理分期，也未获得广泛认可以用于所有结直肠癌（CRC）病例的常规病理报告中。
一种较新的疾病表型预后分层方法依赖于利用多种“标志物”的表面蛋白谱。尽管使用iTRAQ等蛋白质组学技术进行肿瘤表达谱分析是发现生物标志物的有力工具，但其并不适用于诊断实验室的常规使用，且无法区分混合细胞群体中的不同细胞类型。此外，这些方法在对纯化后的质膜糖蛋白进行谱型分析时需要大量肿瘤组织。 
在本视频中，我们介绍了一种利用DotScan结直肠癌抗体微阵列对解离的结直肠癌样本中活细胞进行表面蛋白质组分析的简便方法。该122种抗体微阵列包含一个标准的82种抗体区域，可识别多种谱系特异性白细胞标志物、黏附分子、受体以及炎症和免疫反应标志物5，同时包含一个卫星区域，用于检测40种可能对结直肠癌具有预后意义的标志物。细胞仅会结合到其表达相应抗原的抗体位点上。通过光学扫描确定的每点细胞密度，反映了表达该抗原的细胞比例、抗原的表达水平以及抗体的亲和力6。
对于结直肠癌组织或正常肠黏膜，光学扫描可反映混合细胞群体的免疫表型。随后可利用荧光多重技术，对芯片上捕获的特定目标细胞亚群进行分析。例如，Alexa 647 标记的抗上皮细胞黏附分子（EpCAM；CD326）是一种广谱上皮细胞分化抗原，用于检测结直肠癌细胞以及正常肠黏膜中的上皮细胞；而藻红蛋白标记的抗 CD3 抗体则用于检测浸润性T细胞7。DotScan 结直肠癌微阵列有望成为基于解剖学分期的结直肠癌诊断系统的替代性诊断原型。

我们描述了一种用于解离结直肠癌（CRC）组织以获得可存活单细胞的方法，随后将这些单细胞捕获在定制的识别表面抗原的抗体微阵列上（DotScan CRC 微阵列）。通过使用荧光染料标记的单克隆抗体进行荧光多重检测，可对结合在微阵列上的细胞亚群进行表型分析。

目前，结直肠癌（CRC）的预后评估和分类依赖于整合了组织病理学和临床发现的分期系统。然而，在大多数情况下……

本实验的总体目标是利用DOT扫描抗体微阵列对结直肠癌组织中的表面抗原进行分子谱型分析。此外，采用荧光多重技术以在混合细胞群体中区分具有特定分子谱型的细胞类型。分化簇（Cluster of differentiation，CD）抗原已被鉴定为结直肠癌中潜在的预后或转移性生物标志物。这些抗原是理想的生物标志物，因为它们的表达水平通常会随着肿瘤进展或其他细胞类型的相互作用而发生变化。在本视频中，我们采用DOT scan抗体微阵列通过细胞表面表达的抗原来捕获活细胞。DOT scan抗体微阵列由载玻片和一层硝酸纤维素组成。DOT扫描抗体微阵列面板通过CD29和CD44组成的定位点进行定位。在阵列的每侧还设有重复的点样阵列。第一个面板包含DOT扫描白血病微阵列原有的82种抗体，另外40种抗体则是基于其在结直肠癌卫星微阵列中的预后潜力而筛选加入的。最后的面板包含冰冻类型对照抗体。此处，将结直肠癌组织和正常肠黏膜进行消化和过滤，以获得可存活的单细胞悬液。该悬液可冷冻保存或留待后续使用。将细胞悬液用于DOT扫描抗体微阵列上的细胞捕获，通过荧光多重检测技术对不同细胞亚型表面表达的抗原进行分析。所得表达谱显示，结直肠癌细胞与正常肠黏膜之间在抗原表达上存在显著差异。这种差异在肿瘤相关白细胞群体中也有体现。多种肿瘤表达谱的层次聚类显示，疾病特征与结直肠癌分期聚类分布。大家好，我是来自澳大利亚悉尼大学分子生物科学学院的Jerry。今天我将向大家展示一项针对结直肠癌组织表面抗原进行分析的实验。该实验采用点阵扫描抗体微阵列结合荧光多重检测技术。点阵扫描微阵列技术能够在活体癌细胞及其相关的炎性白细胞上同时分析约140种表面抗原。可使用荧光标记的抗体来区分微阵列上捕获的细胞亚群，这些抗体可结合目标细胞上高表达的标记抗原。利用三种具有不同特异性的抗体及其相应的荧光标记，可在单个微阵列上同时分析最多三种不同的细胞亚群。DOT扫描微阵列检测法是一种相对简便的方法，目前已用于多种癌症的细胞表面蛋白谱分析。DOT 扫描的一个关键特征是能够通过细胞表面抗原捕获活细胞，因此我们获得的结合模式反映了细胞的表面特征。表面抗原在肿瘤发生、转移以及抗肿瘤的炎症反应中发挥着重要作用。全面的表面特征或免疫表型可作为疾病的标志物，用于改进癌症分类，从而在术后实现最佳治疗方案。好的，我们开始。在本实验中，收集了临床结直肠癌肿瘤样本（A至D级），置于Hank's缓冲液中。首先，使用两把手术刀小心地将肿瘤切成约1毫米厚的薄片。将切片放入 2% collagenase type four 和 10% DNA 酶溶液中进行消化。从同一患者距原发肿瘤部位 10 厘米处采集正常肠黏膜组织作为对照样本，并与肿瘤样本同样处理。将肿瘤组织在37摄氏度下消化一小时，以促进结缔组织的降解，D ns 可清除任何受损细胞释放的DNA。孵育结束后，将组织悬液通过金属网筛过滤，同时在样品上方加入Hanks缓冲液，并使用10 mL注射器的推杆辅助推动细胞穿过网筛。重复此过程数次，直至大多数细胞均已通过金属网筛。筛网可将细胞与未消化的结缔组织分离。接下来，使用10 mL注射器吸取细胞悬液，依次通过孔径为200微米的滤膜和孔径为50微米的滤膜进行进一步过滤。这些更精细的过滤步骤有助于去除多余的黏液或DNA，并分散细胞团块，从而获得可存活的单细胞悬液。对正常黏膜进行相同的处理。我们发现，正常黏膜往往含有较多的结缔组织，因此需要更多次的洗涤才能通过滤网。在20摄氏度下以410 ×g离心5分钟，制成细胞悬液。为准备低温保存，我们将细胞沉淀重悬于750微升胎牛血清中，随后加入等体积含DMSO的胎牛血清。因此，在此DMS中逐滴加入溶液，同时持续混合，将上清液分装至冻存管中，并置于隔热容器内。这些样品可在-80°C下保存长达一年。绝缘材料和DMSO应确保细胞缓慢冻结，避免破裂。储存的副作用是红细胞群体的裂解。幸运的是，我们并不需要这些红细胞。进行实验时，将样品从储存处取出并迅速处理。在37摄氏度水浴中，用10 mL Hank's缓冲液重悬细胞悬液，缓冲液有助于稀释10% DMSO和胎牛血清，于20摄氏度、410 ×g条件下离心5分钟，以分离中心部位的细胞。接下来，将上清液倾出，并用500微升Hank's缓冲液重悬细胞。在冻融过程中，部分细胞可能破裂，导致DNA释放到悬液中。为解决这一问题，需在室温下用0.1% DNase处理样品。在此期间，可进行细胞活力计数。将台盼蓝与10微升细胞悬液等量混合，取10微升混合液加入细胞计数板中。在显微镜下，健康且具有活力的细胞呈透明状，而膜结构受损的非活细胞则呈蓝色。进行 DOT 扫描抗体的细胞捕获至少需要 400 万个活细胞。MICRORAY 下降。DNA 处理用 10 毫升 Hank's 缓冲液将细胞再次洗涤，并在 20 摄氏度下以 410 ×g 离心五分钟。我们将最终的细胞悬液用200微升RPMI培养基重悬。该培养基所含营养成分相对高于Hanks缓冲液，有助于细胞在抗体微阵列上捕获，同时维持细胞活性。结直肠癌点阵扫描抗体微阵列由140种不同的抗体点组成，在硝酸纤维素膜上呈重复排列。阵列上的每个点包含 10 纳升针对细胞表面抗原的单克隆抗体。制备抗体微阵列时，先将其浸入 PBS 槽中润湿硝酸纤维素膜，并擦拭阵列的玻璃边缘。使用 Kim 擦拭纸时需小心，避免接触硝酸纤维素区域，将微阵列放入槽中，然后用移液器将细胞悬液点加到硝酸纤维素上。细胞悬液的均匀分布可确保所有抗体都有机会捕获细胞。将微阵列在37摄氏度下孵育一小时。在孵育过程中，不同的细胞会逐渐沉降并与阵列上的抗体接触。呈现与其抗体相对应的表面抗原，经孵育后将结合并捕获细胞。通过轻轻将芯片浸入三份新鲜的PPS溶液中，洗涤去除未结合的细胞。用10%来自外部高度的PPS溶液固定已捕获的细胞。轻轻加入足量固定剂以覆盖硝酸纤维素载样区域，室温孵育20分钟。随后，将微阵列在新鲜的PBS中浸洗三次，每次浸洗一次。每次洗涤时，将芯片置于 PBS 中浸泡 30 秒，因为过量的残留物可能干扰荧光多重检测。现在我们可以初步检查是否存在细胞结合，方法是将微阵列置于光源下观察，以进行更精确的分析。DOT 扫描仪及分析软件可扫描结合模式，并对混合细胞群体中抗原的表达水平提供定量结果。该软件在八位灰度级上将细胞结合强度与背景噪声进行比较。强度单位被归一化至最大值256。为了便于阵列间的比较，任何阳性冰型对照结合值将从相应Ig同种型的抗体中扣除。向微阵列中加入 200 µL 封闭缓冲液，在室温下孵育 20 分钟。为准备荧光多重检测，在 118 µL 封闭缓冲液中加入 10 µL 炽热标记的 CD3 和 20 µL Alexa 标记的 EpAM。此外，向混合物中加入 2 µL 热灭活血清，以防止非特异性结合。封闭完成后，弃去封闭缓冲液，加入多重检测溶液，在避光条件下室温孵育30分钟。孵育期间，CD3偶联抗体将结合至阵列上表达CD3的T细胞，而EPAM偶联抗体则结合至阵列上的上皮细胞或结直肠癌细胞。随后，用新鲜PBS洗涤微阵列3次，避光干燥后进行荧光扫描。使用 Typhoon FLA 9000 扫描仪检测荧光信号。FICO 红细胞谱型采用 523 纳米激光激发，配以 580 BP 30 发射滤光片（EP camm Alexa 647）；Alexa 647 采用 633 纳米激光激发，配以 670 BP 30 发射滤光片。所获得的荧光图像转换为 tip 格式以进行分析。使用 DOT 扫描软件。荧光多重检测技术使我们能够在同一组织样本中区分不同细胞群体的抗原谱型。此处显示的图像来自一个结直肠癌样本。这三幅图像分别为光学扫描、CD3表达细胞的荧光扫描以及EPAM表达细胞的荧光游戏副本。DOT扫描微阵列的结果应显示两张重复载玻片之间的细胞结合模式一致。载玻片边缘出现强烈的对齐点结合信号，表明已捕获足够数量的细胞。可生成 PDF 报告以提供细胞结合的定量数值。柱状图展示了正常黏膜与肿瘤样本之间抗原表达的差异。光学结果总体呈现了样本中所有细胞类型的抗原表达情况，而AAM多重检测结果则更清晰地展示了正常上皮细胞与癌细胞之间抗原表达的差异。尽管许多差异表达的抗原作为一组已被确认为结直肠癌生物标志物，但它们联合起来所提供的疾病特征谱远比任何单一生物标志物更准确，可用于疾病分层。CD3多重检测结果显示，相较于正常组织，癌症样本中含有更多的T细胞。肿瘤浸润性T细胞常表达激活标志物，提示这些T细胞可能是肿瘤浸润性淋巴细胞或与炎症相关的T细胞。可通过开源的热图与数据分析软件Multi Experiment Viewer 4.4进行大规模分析。对结直肠癌样本进行层次聚类分析，可用于与疾病分期或患者预后进行关联分析。庞大的疾病特征谱库是预测结直肠癌患者预后或确定术后治疗方案的重要工具。我们刚刚展示了如何利用DOT扫描抗体微阵列和荧光多重技术，对结直肠癌组织中混合细胞群体的表面抗原表达进行分析。进行本实验时需牢记的一个重要环节是：必须使用新鲜组织，且至少需要400万个活细胞，以确保实验成功。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。

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