使用抗体微阵列和荧光多重技术对结直肠癌细胞表面蛋白进行分析

本实验的总体目标是利用DOT扫描抗体微阵列对结直肠癌组织中的表面抗原进行分子谱型分析。此外，采用荧光多重技术以在混合细胞群体中区分具有特定分子谱型的细胞类型。分化簇（Cluster of differentiation，CD）抗原已被鉴定为结直肠癌中潜在的预后或转移性生物标志物。

这些抗原是理想的生物标志物，因为它们的表达水平通常会随着肿瘤进展或其他细胞类型的相互作用而发生变化。在本视频中，我们采用DOT scan抗体微阵列通过细胞表面表达的抗原来捕获活细胞。DOT scan抗体微阵列由载玻片和一层硝酸纤维素组成。

DOT扫描抗体微阵列面板通过CD29和CD44组成的定位点进行定位。在阵列的每侧还设有重复的点样阵列。第一个面板包含DOT扫描白血病微阵列原有的82种抗体，另外40种抗体则是基于其在结直肠癌卫星微阵列中的预后潜力而筛选加入的。

最后的面板包含冰冻类型对照抗体。此处，将结直肠癌组织和正常肠黏膜进行消化和过滤，以获得可存活的单细胞悬液。该悬液可冷冻保存或留待后续使用。

将细胞悬液用于DOT扫描抗体微阵列上的细胞捕获，通过荧光多重检测技术对不同细胞亚型表面表达的抗原进行分析。所得表达谱显示，结直肠癌细胞与正常肠黏膜之间在抗原表达上存在显著差异。这种差异在肿瘤相关白细胞群体中也有体现。

多种肿瘤表达谱的层次聚类显示，疾病特征与结直肠癌分期聚类分布。大家好，我是来自澳大利亚悉尼大学分子生物科学学院的Jerry。今天我将向大家展示一项针对结直肠癌组织表面抗原进行分析的实验。该实验采用点阵扫描抗体微阵列结合荧光多重检测技术。点阵扫描微阵列技术能够在活体癌细胞及其相关的炎性白细胞上同时分析约140种表面抗原。

可使用荧光标记的抗体来区分微阵列上捕获的细胞亚群，这些抗体可结合目标细胞上高表达的标记抗原。利用三种具有不同特异性的抗体及其相应的荧光标记，可在单个微阵列上同时分析最多三种不同的细胞亚群。DOT扫描微阵列检测法是一种相对简便的方法，目前已用于多种癌症的细胞表面蛋白谱分析。

DOT 扫描的一个关键特征是能够通过细胞表面抗原捕获活细胞，因此我们获得的结合模式反映了细胞的表面特征。表面抗原在肿瘤发生、转移以及抗肿瘤的炎症反应中发挥着重要作用。全面的表面特征或免疫表型可作为疾病的标志物，用于改进癌症分类，从而在术后实现最佳治疗方案。

好的，我们开始。在本实验中，收集了临床结直肠癌肿瘤样本（A至D级），置于Hank's缓冲液中。首先，使用两把手术刀小心地将肿瘤切成约1毫米厚的薄片。

将切片放入 2% collagenase type four 和 10% DNA 酶溶液中进行消化。从同一患者距原发肿瘤部位 10 厘米处采集正常肠黏膜组织作为对照样本，并与肿瘤样本同样处理。

将肿瘤组织在37摄氏度下消化一小时，以促进结缔组织的降解，D ns 可清除任何受损细胞释放的DNA。孵育结束后，将组织悬液通过金属网筛过滤，同时在样品上方加入Hanks缓冲液，并使用10 mL注射器的推杆辅助推动细胞穿过网筛。重复此过程数次，直至大多数细胞均已通过金属网筛。

筛网可将细胞与未消化的结缔组织分离。接下来，使用10 mL注射器吸取细胞悬液，依次通过孔径为200微米的滤膜和孔径为50微米的滤膜进行进一步过滤。这些更精细的过滤步骤有助于去除多余的黏液或DNA，并分散细胞团块，从而获得可存活的单细胞悬液。

对正常黏膜进行相同的处理。我们发现，正常黏膜往往含有较多的结缔组织，因此需要更多次的洗涤才能通过滤网。在20摄氏度下以410 ×g离心5分钟，制成细胞悬液。为准备低温保存，我们将细胞沉淀重悬于750微升胎牛血清中，随后加入等体积含DMSO的胎牛血清。

因此，在此DMS中逐滴加入溶液，同时持续混合，将上清液分装至冻存管中，并置于隔热容器内。这些样品可在-80°C下保存长达一年。

绝缘材料和DMSO应确保细胞缓慢冻结，避免破裂。储存的副作用是红细胞群体的裂解。幸运的是，我们并不需要这些红细胞。

进行实验时，将样品从储存处取出并迅速处理。在37摄氏度水浴中，用10 mL Hank's缓冲液重悬细胞悬液，缓冲液有助于稀释10% DMSO和胎牛血清，于20摄氏度、410 ×g条件下离心5分钟，以分离中心部位的细胞。

接下来，将上清液倾出，并用500微升Hank's缓冲液重悬细胞。在冻融过程中，部分细胞可能破裂，导致DNA释放到悬液中。为解决这一问题，需在室温下用0.1% DNase处理样品。在此期间，可进行细胞活力计数。

将台盼蓝与10微升细胞悬液等量混合，取10微升混合液加入细胞计数板中。在显微镜下，健康且具有活力的细胞呈透明状，而膜结构受损的非活细胞则呈蓝色。

进行 DOT 扫描抗体的细胞捕获至少需要 400 万个活细胞。MICRORAY 下降。DNA 处理用 10 毫升 Hank's 缓冲液将细胞再次洗涤，并在 20 摄氏度下以 410 ×g 离心五分钟。

我们将最终的细胞悬液用200微升RPMI培养基重悬。该培养基所含营养成分相对高于Hanks缓冲液，有助于细胞在抗体微阵列上捕获，同时维持细胞活性。结直肠癌点阵扫描抗体微阵列由140种不同的抗体点组成，在硝酸纤维素膜上呈重复排列。

阵列上的每个点包含 10 纳升针对细胞表面抗原的单克隆抗体。制备抗体微阵列时，先将其浸入 PBS 槽中润湿硝酸纤维素膜，并擦拭阵列的玻璃边缘。使用 Kim 擦拭纸时需小心，避免接触硝酸纤维素区域，将微阵列放入槽中，然后用移液器将细胞悬液点加到硝酸纤维素上。

细胞悬液的均匀分布可确保所有抗体都有机会捕获细胞。将微阵列在37摄氏度下孵育一小时。在孵育过程中，不同的细胞会逐渐沉降并与阵列上的抗体接触。

呈现与其抗体相对应的表面抗原，经孵育后将结合并捕获细胞。通过轻轻将芯片浸入三份新鲜的PPS溶液中，洗涤去除未结合的细胞。用10%来自外部高度的PPS溶液固定已捕获的细胞。

轻轻加入足量固定剂以覆盖硝酸纤维素载样区域，室温孵育20分钟。随后，将微阵列在新鲜的PBS中浸洗三次，每次浸洗一次。

每次洗涤时，将芯片置于 PBS 中浸泡 30 秒，因为过量的残留物可能干扰荧光多重检测。现在我们可以初步检查是否存在细胞结合，方法是将微阵列置于光源下观察，以进行更精确的分析。DOT 扫描仪及分析软件可扫描结合模式，并对混合细胞群体中抗原的表达水平提供定量结果。

该软件在八位灰度级上将细胞结合强度与背景噪声进行比较。强度单位被归一化至最大值256。为了便于阵列间的比较，任何阳性冰型对照结合值将从相应Ig同种型的抗体中扣除。

向微阵列中加入 200 µL 封闭缓冲液，在室温下孵育 20 分钟。为准备荧光多重检测，在 118 µL 封闭缓冲液中加入 10 µL 炽热标记的 CD3 和 20 µL Alexa 标记的 EpAM。此外，向混合物中加入 2 µL 热灭活血清，以防止非特异性结合。

封闭完成后，弃去封闭缓冲液，加入多重检测溶液，在避光条件下室温孵育30分钟。孵育期间，CD3偶联抗体将结合至阵列上表达CD3的T细胞，而EPAM偶联抗体则结合至阵列上的上皮细胞或结直肠癌细胞。随后，用新鲜PBS洗涤微阵列3次，避光干燥后进行荧光扫描。

使用 Typhoon FLA 9000 扫描仪检测荧光信号。FICO 红细胞谱型采用 523 纳米激光激发，配以 580 BP 30 发射滤光片（EP camm Alexa 647）；Alexa 647 采用 633 纳米激光激发，配以 670 BP 30 发射滤光片。所获得的荧光图像转换为 tip 格式以进行分析。

使用 DOT 扫描软件。荧光多重检测技术使我们能够在同一组织样本中区分不同细胞群体的抗原谱型。此处显示的图像来自一个结直肠癌样本。

这三幅图像分别为光学扫描、CD3表达细胞的荧光扫描以及EPAM表达细胞的荧光游戏副本。DOT扫描微阵列的结果应显示两张重复载玻片之间的细胞结合模式一致。载玻片边缘出现强烈的对齐点结合信号，表明已捕获足够数量的细胞。

可生成 PDF 报告以提供细胞结合的定量数值。柱状图展示了正常黏膜与肿瘤样本之间抗原表达的差异。

光学结果总体呈现了样本中所有细胞类型的抗原表达情况，而AAM多重检测结果则更清晰地展示了正常上皮细胞与癌细胞之间抗原表达的差异。尽管许多差异表达的抗原作为一组已被确认为结直肠癌生物标志物，但它们联合起来所提供的疾病特征谱远比任何单一生物标志物更准确，可用于疾病分层。CD3多重检测结果显示，相较于正常组织，癌症样本中含有更多的T细胞。

肿瘤浸润性T细胞常表达激活标志物，提示这些T细胞可能是肿瘤浸润性淋巴细胞或与炎症相关的T细胞。可通过开源的热图与数据分析软件Multi Experiment Viewer 4.4进行大规模分析。对结直肠癌样本进行层次聚类分析，可用于与疾病分期或患者预后进行关联分析。

庞大的疾病特征谱库是预测结直肠癌患者预后或确定术后治疗方案的重要工具。我们刚刚展示了如何利用DOT扫描抗体微阵列和荧光多重技术，对结直肠癌组织中混合细胞群体的表面抗原表达进行分析。进行本实验时需牢记的一个重要环节是：必须使用新鲜组织，且至少需要400万个活细胞，以确保实验成功。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。