在小鼠嗅球成像气味诱发的活动，利用光学反射和自体荧光信号
2011年10月31日
本文介绍了内在的光信号和flavoproteins自体荧光信号成像的协议，在小鼠嗅球表面的气味诱发的地图活动。
本实验的总体目标是在麻醉小鼠并暴露颅骨后，使用内在光信号和黄素蛋白自发荧光信号或 FAS 成像绘制小鼠嗅球表面的气味诱发活动。嗅球上方的骨头变薄。使用手术刀刀片的尖端拉出骨瓣，然后取出一个由牙科水泥制成的腔室，并围绕着嗅球的裸露表面。
它装满了 aros，并在这种准备工作的顶部放置了一个盖玻片。使用固有光信号和 FAS 成像在同一只小鼠中依次获取嗅觉图，使用光学反射和自发荧光信号对小鼠嗅球中的其他诱发活动进行成像有助于回答有关嗅球中顺序特殊涂层的关键问题。与现有方法（例如两个 doxy 葡萄糖成像或 FMRI）相比，该技术的主要优点是可以以单个魅力列表的特殊分辨率记录顺序诱发电活动。
一般来说，刚接触这些方法的人在工作开始时会遇到困难，因为手术和器械技能的获得速度都很慢。这种方法的视觉演示对于引起人们对手术和成像程序关键步骤的关注至关重要。捏住鼠标的后爪以确认麻醉，然后用剪刀去除头皮上的毛发。
用浸泡在蒸馏水中的无菌纱布垫擦去皮肤上残留的毛发。将鼠标放置在立体定位框架中，使鼻子与后脑勺位于同一平面上。为了将嗅球水平放置，请牢牢固定耳杆和鼻杆，以防止移动。
将眼药膏涂抹在眼睛上以防止成像时干燥，然后使用无菌剪刀用 Betadine 对头皮区域进行消毒。在后脑勺的耳朵之间切开一个切口，然后在两侧朝向耳朵底部切开，沿着眼睑向前后方向切开。通过切开鼻子上的皮肤来完成去除头皮。
使用鼻杆作为指南。将动物置于立体显微镜下，并使用蘸有盐水的棉签轻轻分离颅骨顶部的骨膜。使用一对镊子去除剩余的组织，并用手术刀刮擦颅骨表面，以确保准备工作清洁，以便在整个实验过程中保持嗅球区域湿润。
将一块可吸收的明胶、用蒸馏水浸泡的海绵放在位于眼睛之间的嗅球上方的骨头上。取下明胶海绵，首先用 10 号手术刀刀片轻轻刮擦骨头。在刀片和骨骼之间保持 45 度的恒定角度，并将刀片从眼睑移动到球状区域的矢状侧。
在变薄过程中，小心不要对骨骼施加垂直压力或刮擦静脉窦上方的骨骼。每 5 分钟停止一次，并将水合明胶海绵放在骨头上以冷却制剂。用海绵擦拭颅骨以去除骨头，除尘并定期擦拭手术刀尖端，以保持其清洁和锋利。
继续直到看到海绵状骨层或小梁。当可以看到嗅球的细血管系统时，停止抓挠骨头，用 11 号手术刀的尖端画一个矩形区域并关闭嗅球。将窗口保持在静脉窦的边界内会继续刮擦矩形区域内的骨头。
要格外小心手术刀尖端的深度，以免接触硬脑膜表面。为了了解剩余骨头的厚度，用镊子的尖端轻轻推动它。如果骨骼在压力下折叠，请进行下一步。
加入一滴生理盐水，并使用水平方向的手术刀尖端提起骨瓣。用镊子小心地取下皮瓣，以免撕下剩余的骨头。暴露嗅球表面后，检查是否有任何出血或血管。吻合。
用浸泡在盐水中的明胶海绵擦拭该区域。为了保持嗅球湿润，使用 29 号注射器涂抹聚丙烯酸酯牙科粘接剂，在颅窗周围的骨头上形成一个孔。将一滴低熔点 aros 放在硬脑膜上，并将无菌盖玻片放在颅窗上进行成像。
将立体定位框架放在立体显微镜下，颅窗以视野焦点为中心，以使毛细血管进入视野。切换到 580 纳米绿光并捕获解剖控制图像，以检查成像过程中的准备状态。然后继续使用 630 纳米照明下的本征光信号成像或黄素蛋白自发荧光信号成像来捕捉刺激试验在 480 纳米照明下，标准成像会话包括 5 到 10 秒的基线，其中仅提供空气，然后是 3 到 10 秒的气味刺激，具体取决于所选的气味浓度。
最后，记录 70 到 82 秒的空气输送以进行基线恢复。在这里，嗅球的脉管系统通过颅窗成像，然后使用 h sinal 作为使用 iOS 和 FAS 成像捕获的气味剂的刺激试验的结果。使用 iOS 成像，气味诱发的活动显示为由 AL 激活的吸收区域的暗区由白色箭头表示，并且在单次和平均多次试验中都可以看到活跃区域。
在相同的小鼠 OD 诱发活动中切换到 FAS 成像现在显示为由黑色箭头指示的自发荧光发射的白色区域，并且在单次和平均多次试验中也可以看到。请注意，使用 iOS 成像看到的吸收黑色区域和使用 FAS 成像看到的自发荧光发射的白色区域重叠。这种空间匹配证实了这两种技术允许对相同的嗅觉肾小球进行可视化：一旦掌握成像顺序，使用光学反射和自发荧光信号的诱发活动可以在一小时内完成手术，在几个小时内完成图像采集。
使用这些光学成像方法的主要缺点是它们不能以自由移动的小鼠的方式应用于可视化嗅觉图。由于光子对生物组织的穿透有限，它们在 90 年代后期发育后无法进入腹侧嗅肾小球，在嗅觉系统中记录内在信号。也许是光学成像领域研究人员探索 od 特殊涂层特性的一种方式。
在嗅球中，黄素蛋白自发荧光成像是一种很有前途的技术，可以为使用内源性光信号的特殊 OD 涂层提供新的见解。
概述
本文介绍了用于成像固有光学信号和黄素蛋白自体荧光信号的协议，以绘制小鼠嗅球表面的气味引发活动的图。所描述的方法允许对嗅球活动进行高分辨率成像，为嗅觉的神经机制提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 嗅觉处理
- 成像技术
背景
- 了解嗅觉处理对于洞察感官感知至关重要。
- 固有光学信号和黄素蛋白自体荧光等成像技术对于研究大脑活动非常有价值。
- 绘制气味引发的活动可以揭示感官反应的空间组织。
- 现有方法可能缺乏进行详细分析所需的分辨率。
研究目的
- 开发一种用于绘制嗅球中气味引发活动的协议。
- 利用固有光学信号和黄素蛋白自体荧光进行高分辨率成像。
- 展示这些成像技术相对于传统方法的优势。
使用的方法
- 通过暴露嗅球来麻醉小鼠并为成像做准备。
- 薄化嗅球上方的骨头以便于成像。
- 使用固有光学信号和黄素蛋白自体荧光对气味刺激的反应进行序列成像。
- 成像会话包括基线和气味刺激阶段，以评估引发的活动。
主要结果
- 气味引发的活动被可视化为吸收和自体荧光区域。
- 结果显示了对不同气味的不同激活模式。
- 两种成像技术提供了关于嗅球活动的互补信息。
- 高空间分辨率允许对感官反应进行详细绘图。
结论
- 开发的协议能够有效绘制嗅球活动。
- 固有光学信号和黄素蛋白自体荧光是神经科学研究的强大工具。
- 这些方法可以增强我们对大脑中感官处理的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mapping odor-evoked neural activity in the olfactory bulb supports target validation in neuroscience drug discovery by enabling visualization of functional neural circuits involved in sensory processing. This approach provides mechanistic de-risking for compounds targeting olfactory pathways or related neurological disorders by linking molecular interventions to measurable changes in neural activation patterns. The technique enhances predictive confidence in early discovery by offering a disease-relevant system to assess target engagement and circuit-level effects prior to phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing odor-evoked activation patterns in glomeruli as functional modules of sensory processing.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of neural circuit engagement in response to sensory stimuli.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking target modulation to measurable changes in spatial activation maps.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and evoked activity profiles in the olfactory bulb.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sequential imaging of intrinsic optical signals and flavoprotein autofluorescence under controlled stimulation.
- Scalability: Highlights platform reuse across stimulation trials and odorants to enable reliable compound evaluation in sensory neuroscience.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by linking olfactory bulb activation patterns to sensory processing pathways relevant to neurological disorders.
- Mechanistic De-risking: Describes continuity from discovery through preclinical validation by mapping neural responses that reflect target-mediated changes in brain activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by providing quantitative spatial readouts that correlate with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation by providing neural activity readouts that inform target confidence and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by visualizing odor-evoked activation in glomeruli.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through sequential baseline and stimulation imaging using 630 nm and 480 nm illumination.
- Analytics: Highlights measurements such as absorbance changes (intrinsic optical signals) and autofluorescence emission (flavoprotein signals) that enable comparison of neural activation across conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking olfactory bulb activation patterns to sensory processing pathways relevant to therapeutic targeting.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for longitudinal studies and cross-compound comparison in the same preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in sensory processing pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of neural activity mapping across trials and subjects.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neuroscience programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on neural activation thresholds and spatial patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neuroscience, surgical preparation, and optical imaging techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including stereotaxic frame, stereo microscope, light sources at 580 nm, 630 nm, and 480 nm, and image acquisition systems.
- Cross-team standardization requirements for surgical preparation, anesthesia depth, and imaging parameters across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, noting current application in mouse olfactory bulb with potential for extension to other sensory regions.
- Practical limitations supported by source material: inability to visualize olfactory maps in freely moving mice and limited photon penetration restricting access to ventral olfactory glomeruli.
