Name: 球体的检测，以测量TGF -β诱导的入侵 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 了解如何使用MCF10A细胞系在三维胶原凝胶中定量测量TGF-β诱导的侵袭。该方法通过球体培养和侵袭面积量化，为研究癌症进展中的侵袭机制提供更接近生理环境的实验模型。

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我们感谢美国纽约OSI Pharmaceuticals的Ken Iwata提供的试剂，以及美国底特律Barbara Ann Karmanos癌症研究所的Fred Miller提供的细胞系。

1. 甲基纤维素溶液的制备（500 mL）
<ol>
	<li>将6 g甲基纤维素与磁力搅拌子放入500 ml瓶中，进行高压灭菌。</li>
	<li>在250 ml预热至60°C的无血清DMEM/F12培养基中溶解甲基纤维素，持续20分钟。</li>
	<li>加入250 ml含10%马血清的室温DMEM/F12培养基，4°C下混合过夜。</li>
	<li>通过离心澄清溶液（5000g，4°C，2小时）。</li>
	<li>取上清液（高黏度液体，约为原溶液的90–95%）转移至新离心管中。</li>
	<li>4°C保存，待用。</li>
</ol>
2. 类球体培养
<ol>
	<li>配制20%甲基纤维素溶液（10 ml 甲基纤维素和40 ml 培养基）。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次，加入0.1%胰蛋白酶，并在37 °C下孵育细胞。</li>
	<li>用培养基重悬细胞，并进行细胞计数。</li>
	<li>在20%甲基纤维素中制备每毫升含10,000个细胞的细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液加入96孔圆底悬浮培养板中（每孔100 μl）。</li>
	<li>次日，检查悬浮培养板中的球状体形成情况。球状体在1–3天后即可用于实验。</li>
</ol>
3. 胶原蛋白的制备
<ol>
	<li>在冰上配制溶液：8 ml 胶原蛋白、1 ml 10x PBS、1 ml 0.1 N NaOH 和 3 滴 0.1 N HCl。取少量溶液滴在 pH 指示试纸上，检测 pH 是否为 7.4。若超出范围，需调节 pH。</li>
	<li>在 96 孔板的各孔中加入 50 μl 中和后的胶原蛋白溶液。</li>
	<li>于 37°C 培养，直至胶原蛋白凝固（90 分钟）。</li>
	<li>在冰上配制甲基纤维素-胶原蛋白-配体溶液：针对每种配体，移取 1 份胶原蛋白溶液，每毫升胶原蛋白中加入 20 ng TGF-β。经甲基纤维素稀释并在各层间扩散后，TGF-β 的终浓度为 5 ng/ml。涡旋混匀。加入 1 份甲基纤维素溶液，再次涡旋混匀。</li>
</ol>
4. 类球体包埋
<ol>
	<li>将一个200 μl的枪头（其尖端已截去约5 mm）安装在200 μl移液器上。用该移液器吸取一个类球体，并小心地将培养基排入空板中。观察类球体是否仍留在枪头内，类球体呈白色小点状，肉眼可见。在不释放移液器推杆的情况下，吸取100 μl胶原-甲基纤维素混合液，然后将类球体排入已包被胶原的96孔板中的胶原混合液内。每种实验条件重复操作12个类球体。</li>
	<li>在37°C下静置至少30分钟，使胶原凝固。</li>
	<li>使用200 μl枪头去除气泡。</li>
	<li>加入50 μl含1.6%血清并溶解于DMSO中的培养基。对于SB-431542，将4 μl储存液（10 mM）加入1 ml培养基中。扩散后，抑制剂的终浓度为10 μM。TGF-β和抑制剂在整个实验过程中持续存在。使用显微镜在40倍放大倍数下拍摄类球体图像。</li>
	<li>在使用TGF-β和/或抑制剂刺激48小时后，使用显微镜在40倍放大倍数下拍摄类球体图像。</li>
	<li>在刺激2天后测量侵袭性类球体的面积，并减去初始面积。测量类球体面积的方法如下：在Adobe Photoshop Extended中打开类球体图像（图2A），选择“快速选择工具”（图2B）。鼠标指针将变为带加号（+）的圆形（图2C）。拖动光标划过类球体时，Photoshop将自动识别类球体的边界。若选中了类球体外部区域，可通过按Alt键或使用工具栏中标有减号（-）的负向选择工具，将该区域从选区中排除。此时光标变为带减号（-）的圆形，拖动光标划过错误选中的区域即可将其从选区中移除（图2D）。如有需要，可通过按Shift键选择多个区域。为提高精度，可在工具栏中调整画笔直径以改变鼠标指针大小（图2E）。当整个类球体被选中后，可通过菜单栏中的“分析-测量”（ANALYSIS-MEASURE）或按Ctrl + Shift + M计算选区面积（图2F）。测量记录窗口将显示文件名、选区面积（以像素为单位）及其他数据（图2G）。若进行了多次测量，第一行显示所有区域面积的总和，各单个选区的测量值则依次列于下方。所有测量数据可导出为文本文件并在Excel中打开。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
图3展示了使用MCF10A1（M1）正常乳腺上皮细胞、H-RAS转化的MCF10AneoT（M2）细胞以及由M2衍生的MCF10CA1a（M4）细胞进行类球体侵袭实验的示例。M1细胞在无刺激条件下仅表现出微弱的侵袭能力，而在TGF-β刺激下侵袭能力显著增强。相比之下，经RAS转化的M1衍生细胞M2在未添加刺激因子时已具备高效的侵袭能力，经TGF-β处理后，其侵袭能力进一步提高了4-5倍。M4细胞无论在有无TGF-β添加的情况下，均表现出最强的侵袭能力。
接下来，我们检测了是否可以利用化学抑制剂在该球体模型中干扰TGF-β诱导的侵袭。为此，我们使用了SB-431542，一种ATP类似物，可选择性抑制TβRI的激酶活性，同时也抑制激活素I型B受体（ActRIB）和激活素受体样激酶（ALK）712。正如预期，SB-431542显著抑制了TGF-β诱导的M1、M2和M4细胞的侵袭（图4），表明TGF-β诱导的侵袭依赖于TβRI激酶活性。此外，球体的基础侵袭也受到强烈抑制，提示基础侵袭同样依赖于TGF-β。
<img alt="类球体培养过程示意图；细胞接种、形成类球体、包埋于胶原中、发生侵袭。" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 三维类球体实验流程图。首先，将细胞接种于非黏附条件下、U型悬浮培养板中。细胞聚集形成多细胞类球体，随后可将其包埋于胶原基质中。在该胶原基质中，细胞能够发生侵袭。
<img alt="图像编辑过程；选择工具和测量特征；数字分析步骤示意图。" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 使用 Adobe Photoshop Extended 对类球体面积进行定量分析。（A）在 Adobe Photoshop Extended 中打开类球体图像（B）选择快速选择工具（C）拖动光标覆盖类球体以选中其区域（D）使用反向快速选择工具去除误选区域（E）调整快速选择工具的画笔大小以更精确地选择区域（F）选择测量命令进行记录（G）测量记录示例。
<img alt="细胞侵袭实验结果；显微镜图像，TGF-β处理比较，柱状图分析。" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. TGF-β诱导的自发永生化MCF10A1（M1）(A)、RAS转化的MCF10AneoT（M2）(B)及其转移性衍生细胞MCF10CA1a（M4）(C)的球状体侵袭。将M1、M2和M4球状体包埋于胶原中，并按所示用5 ng/mL的TGF-β处理48小时。A-C 分别为包埋当天及两天后的代表性图像。D 侵袭程度通过第2天与第0天面积差值进行相对定量。结果以均值±标准差表示。改编自13。
<img alt="细胞迁移实验，基质金属蛋白酶分析；细胞形态，TGF-β作用，M1 M2 M4。" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4a"> 
<img alt="柱状图比较M1、M2、M4细胞在对照组和SB-431542处理下的相对侵袭能力。" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4b"> 
图4. SB-431542抑制基础状态及TGF-β诱导的球状体侵袭。将M1、M2和M4球状体包埋于胶原中，并根据所示条件用5 ng/ml TGF-β和/或10 μM SB-431542处理。图A为培养2天后的代表性图像。相对侵袭程度通过第2天与第0天的面积差进行量化（图B）。结果以均值±标准差表示。改编自13。

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<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突。

我们建立了一种球状体模型，其中 MCF10A1 细胞及其恶性衍生物以 TGF-β 依赖的方式侵入胶原基质。首先，在含有甲基纤维素的 96 孔圆底悬浮培养板中形成球状体。当然，U 形聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被的培养板也可用于此目的。此步骤中甲基纤维素绝对必需，因为在缺乏甲基纤维素的情况下细胞会死亡。TGF-β 直接加入到胶原-甲基纤维素混合物中，因为我们发现当该因子添加至胶原层上方的培养基中时，细胞对 TGF-β 的反应较弱。然而，建议不要将溶解于 DMSO 中的化学抑制剂直接加入胶原中，因为 DMSO 会在冰冻的胶原-甲基纤维素混合物中析出。因此，我们将这些化合物加入胶原层上方的培养基中。
随后，将细胞嵌入胶原蛋白三维环境中，以使其能够侵入胶原基质。在比较不同MCF10A1细胞系的侵袭特性时，我们发现，从相对良性的M1细胞，到发生RAS转化的M2衍生细胞，再到具有转移特性的M4变体，基础侵袭能力以及TGF-β诱导的侵袭能力依次增强。因此，这些细胞系的侵袭特性与其相对的侵袭性状态相关7,8,14。
<p class="jove_co...

<table><tbody><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>PureCol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>9533</td><td></td></tr><tr><td>96 孔悬浮培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黏附性 TC 培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr></tbody></table>

用于测量tgf-β诱导侵袭的球体侵袭实验

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-β 在乳腺癌进展中具有双重作用：在早期阶段作为肿瘤抑制因子，但在晚期阶段则促进侵袭和转移1,2。此外，TGF-β 在乳腺癌中常呈过表达，其表达水平与不良预后及转移相关3,4。目前对 TGF-β 诱导侵袭的机制尚不完全清楚。
TGF-β 通过 TGF-β II 型（TβRII）和 I 型（TβRI）受体介导其细胞反应。在 TGF-β 诱导形成异源复合物后，TβRII 磷酸化 TβRI。活化的 TβRI 通过磷酸化受体依赖性 Smad 蛋白（R-Smads），即 Smad2 和 Smad3，启动其细胞内经典的信号通路。这些活化的 R-Smads 与 Smad4 形成异源复合物，随后在细胞核内累积，调控靶基因的转录5。除了上述 Smad 信号通路外，受体活化还可导致多种非 Smad 信号通路的激活，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路6。
为了研究 TGF-β 在乳腺癌不同阶段的作用，我们采用了 MCF10A 细胞系统。该系统包括自发永生化的 MCF10A1（M1）乳腺上皮细胞7，H-RAS 转化的 M1 衍生细胞 MCF10AneoT（M2），后者在小鼠体内可产生癌前病变8，以及由 M2 异种移植瘤建立的 M2 衍生细胞 MCF10CA1a（M4），该细胞可形成高级别癌，并具有向肺部转移的能力9。这一 MCF10A 系列为研究不同恶性程度但遗传背景一致的细胞反应提供了可能。
为分析TGF-β诱导的侵袭，我们建立了嵌入三维胶原基质中的同源MCF10A球状细胞培养模型 体外 （图1）。此类模型与人类肿瘤非常相似 体内 通过建立氧气和营养物质的梯度，使类球体外层形成活跃且具有侵袭性的细胞，而内层则为静止或甚至坏死的细胞10基于球体的检测方法也被证实比单层培养更能准确地模拟药物耐药性11该MCF10 3D模型系统使我们能够研究TGF-β信号通路对处于不同恶性阶段的乳腺细胞侵袭特性的影响。

本文描述了一种在三维胶原凝胶中定量检测转化生长因子（TGF）-β诱导侵袭的实验方法。该方法利用代表乳腺癌不同发展阶段的MCF10A系列细胞系，也可适用于其他细胞系，并可用于研究其他潜在的侵袭激活剂或抑制剂。

用于测量TGF-β诱导侵袭的球体侵袭实验

TGF-β 在乳腺癌进展中具有双重作用：在初期阶段作为肿瘤抑制因子，但随后促进侵袭和转移……

以下实验的总体目标是在三维环境中，通过检测细胞球体在胶原基质中的侵袭情况，来评估潜在调控因子对TGFβ诱导的侵袭过程的影响。该实验首先制备细胞球体，随后将PHE包埋于胶原中，以构建三维环境。接下来，对侵袭面积进行定量分析。为了确定处理对TGF-β诱导侵袭的影响，结果显示TGF-β信号通路的调节因子会影响类固醇在三维胶原基质中的侵袭特性。该技术相较于现有方法（如划痕实验）的主要优势在于，能够更好地模拟三维微环境。该方法有助于解答T细胞领域中的关键问题，例如鉴定参与TGF-β诱导侵袭的新基因。为进行TGF-β诱导侵袭实验，首先在含有磁力搅拌子的500毫升瓶中加入6克甲基纤维素，并进行高压灭菌。将甲基纤维素溶于250毫升预热的无血清D-M-E-M-F 12培养基中，持续20分钟，随后加入250毫升室温下含10%马血清的D-M-E-M-F 12培养基，于4°C混合过夜。次日，在4°C条件下以5,000 ×g离心两小时，澄清溶液。将澄清且高度黏稠的溶液转移至新离心管中，于4°C保存备用，用于phe的培养。使用10毫升制备好的甲基纤维素细胞储存液和40毫升生长培养基配制20%的甲基纤维素细胞溶液。用PBS洗涤MCF 10 A细胞两次。加入0.1%胰蛋白酶，于37摄氏度孵育细胞，直至所有细胞脱落。用10毫升生长培养基重悬细胞，并使用细胞计数器对细胞进行计数。在20%甲基纤维素中制备每毫升10,000个细胞的悬液。针对每个测试条件，将100微升细胞悬液加入96孔圆底悬浮培养板的12个孔中。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中过夜培养。次日观察类球体的形成情况。类球体将在一到三天内准备好使用。在冰上配制以下溶液：8 毫升胶原蛋白、1 毫升 10×PBS、1 毫升 0.1 N 氢氧化钠和 3 滴 0.1 N 盐酸。用 pH 指示试纸检测溶液，确保其 pH 值为 7.4。若pH值超出范围，则进行调节。向96孔板的各孔中加入50 µL中和后的胶原蛋白溶液，在37°C孵育约90分钟，或直至胶原蛋白完全凝固。针对每种待测配体，于冰上配制甲基纤维素-胶原蛋白配体溶液。每种处理从一毫升胶原蛋白溶液开始，加入20纳克TGF-β，通过涡旋混合，使终浓度为每毫升5纳克。然后加入一毫升甲基纤维素溶液，使终体积为两毫升，并进行涡旋。再次操作以包埋类固醇时，使用已将尖端切去5毫米或更长的200微升移液器吸头，安装在200微升移液器上。然后用移液器吸取一个S类球体。小心地将培养基排入一个空培养皿中，同时确保S类球体保留在吸头内。不要松开移液器的推杆。吸取 100 µL 胶原蛋白-甲基细胞混合物，将 S 类球状体胶原混合物加入经胶原蛋白包被的 96 孔板中的孔内，每种条件填充 12 个孔。在 37 °C 下静置至少 30 分钟，使胶原蛋白凝固，并使用 200 µL 吸头去除气泡。通过将 4 微升 SB 4 31 542 储存液加入含 1.6% 马血清的 1 毫升 D-M-E-M-F 12 培养基中，配制 40 微摩尔/升的 TGF β 抑制剂 SB 4 31 542 溶液。扩散后，向每孔加入 50 微升含抑制剂的培养基。抑制剂的终浓度为 10 微摩尔/升。在显微镜下使用40倍放大倍数拍摄类固醇图像，然后在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。孵育两天后再次拍照，并通过在Adobe Photoshop中打开球状体图像来测量侵袭性类固醇的面积。展开后选择快速选择工具。拖动光标经过类球体时，鼠标指针将变为带加号的圆形。软件会自动识别类球体的边界。如果选择了类固醇外部的区域，可通过按 alt 键或使用工具栏中的负选择工具（负号）来排除该区域。将光标拖动至错误选中的区域，软件将从选区中移除该区域。如果类球体内部的某个区域被取消选择，可按住 Shift 键的同时拖动鼠标重新将其包含在选区内。为了更精确地操作，可通过工具栏中调整画笔直径来改变鼠标指针的大小。要计算所有活动选区的面积，请在菜单栏中选择分析测量功能。此时将弹出一个测量记录窗口，显示文件名以及选区面积（以像素为单位）。如果在一个球状体中测量了多个选区，第一行将显示所有区域面积的总和，其下方各行则列出各个选区的单独面积。它将列出各个选择项的数值。将数据导出为文本文件，并在 Excel 中打开。此处展示了一个 S 型球状体实验的示例，所用细胞包括 MCF 10 A1 正常乳腺上皮细胞、经 HAS 转化的 MCF 10 A neo T 细胞以及由 M2 衍生的 MCF 10 CA1a 细胞。M1细胞在未受刺激时仅表现出微弱的侵袭能力，但在TGFβ刺激后侵袭能力显著增强。相比之下，经RA转化的M1衍生细胞M2在无需添加刺激因子的情况下即能有效侵袭，且侵袭能力进一步提高了四到五倍。经TGFβ处理后，M4细胞无论在有无TGFβ刺激的条件下均表现出最强的侵袭能力。本实验结果的图示通过 Photoshop 获得，此处示例显示：SB 431542（一种 ATP 类似物，可选择性抑制 TGF-β 受体 I 型激酶活性），同时对 I 型 B 受体和类受体激酶 7 具有活性，被加入细胞培养物中。SB 431542 强烈抑制了 TGF-β 诱导的 M1、M2 和 M4 细胞侵袭，表明 TGF-β 诱导的侵袭依赖于 TGF-β 受体 I 型的激酶活性。此外，PHE 的基础侵袭也受到显著抑制。本实验结果的图示再次通过 Photoshop 制作并展示于此处。完成此操作后，可进一步采用RNA提取或蛋白质提取等其他方法，以回答更多问题，例如哪些基因被表达或哪些蛋白质被表达。观看本视频后，您应能够充分理解如何寻找调控tavita诱导侵袭的新分子。

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医学

球体的检测，以测量TGF -β诱导的入侵

来源：Guyon, J.，等．用于胶质母细胞瘤的三维球体模型．J. Vis. Exp.

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