球体的检测，以测量TGF -β诱导的入侵
November 16th, 2011
描述一个分析，定量分析转化生长因子（TGF）-β诱导的三维胶原凝胶侵袭。这个实验需要的细胞株MCF10A系列，代表不同阶段乳腺癌的发展优势。通过这种方法可以用于其他细胞系，并可能被用来调查其他潜在的激活或入侵抑制剂。
以下实验的总体目标是在三维环境中测量 TGF β 诱导的侵袭的潜在调节因子的影响。这是通过首先制作细胞的球状体来实现的。然后将 PHE 嵌入胶原蛋白中，从而提供 3D 环境。
接下来，对侵袭区域进行量化。为了确定治疗对 TGF β 诱导的侵袭的影响，结果表明 TGF-β 通路的调节剂会影响 3D 胶原蛋白基质中类固醇的侵袭特性。与现有方法（如 scratch ass essay）相比，这种技术的主要优点是它更好地概括了 3D 环境。
这种方法可以帮助回答 T meter 领域中的关键问题，例如鉴定参与教师 β 诱导入侵的新基因。为了制备用于 TGF β 诱导侵袭测定的甲基细胞溶液，首先将 6 克甲基纤维素高压灭菌在含有磁力搅拌的 500 毫升瓶中。将甲基纤维素溶解在 250 毫升预热的不含血清的 D-M-E-M-F 12 中 20 分钟，第二天加入 250 毫升含有 10% 马血清混合物的室温 D-M-E-M-F 12 过夜，在 4 摄氏度下以 5， 000 G 离心 2 小时澄清溶液。
将透明、高粘度的溶液转移到 4 摄氏度的新试管中，直到用于培养 phe。使用 10 毫升制备的甲基细胞原液和 40 毫升生长物制备 20% 甲基细胞溶液。培养基用 PBS 洗涤 MCF 10 A 细胞两次。
加入 0.1% 胰蛋白酶并在 37 摄氏度下孵育细胞，直到所有细胞分离。将细胞重悬于 10 mL生长培养基中，并使用细胞计数仪对细胞进行计数。在 20% 甲基细胞中制备每毫升 10， 000 个细胞的悬浮液。
对于每种测试条件，将 100 微升细胞悬液添加到 96 孔圆底悬吊板的 12 个孔中。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育过夜。第二天检查球体的形成。
球体将在 1 到 3 天内准备好使用。在冰上制备 8 毫升胶原蛋白、1 毫升 10 XPBS、1 毫升 0.1 正常氢氧化钠和 3 滴 0.1 正常盐酸的溶液。在 pH 试纸上点样，检查溶液的 pH 值为 7.4。
如果 pH 值超出范围，请调整 pH 值。将 50 微升中和胶原蛋白溶液加入 96 孔板的孔中，在 37 摄氏度下孵育约 90 分钟或直到胶原蛋白凝固。对于每个待测配体，在冰上制备甲基细胞胶原配体溶液。
从每次治疗 1 毫升胶原蛋白溶液开始，然后加入 20 纳克 TGF β，最终浓度为每毫升 5 纳克，通过涡旋混合。然后加入 1 毫升甲基细胞溶液，使最终体积为 2 毫升并涡旋。再次，要嵌入类固醇，放置一个 200 微升的移液器吸头，在 200 微升移液器上，该吸头的吸头被切断了 5 毫米或更多。
然后用移液管拿起一个 s 球体。小心地将培养基分配到空板中，同时确保 S 球体保持在吸头内。不要松开柱塞。
取 100 微升胶原蛋白甲基细胞混合物，并将 S 球状胶原蛋白混合物分配到 96 的胶原蛋白包被孔中。孔板为每种条件填充 12 个孔。让胶原蛋白在 30 摄氏度下凝固至少 37 分钟，然后用 200 微升的尖端去除气泡。
通过将 4 微升 SB 4 31 542 储备溶液加入 1 毫升含有 1.6% 马血清的 D-M-E-M-F 12 中，制备 40 微摩尔的 TGF β 抑制剂 SB 4 31 542 溶液。扩散后，向每个孔中加入 50 微升含抑制剂的培养基。抑制剂的最终浓度为 10 微摩尔。
在显微镜下使用 40 倍放大倍率拍摄类固醇的照片，然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育。孵育两天后，再次拍照，并通过在 Adobe Photoshop 中打开球状体图片来测量侵入类固醇的面积。extended 并选择快速选择工具。
将光标拖动到椭球体上时，鼠标指针将变为带加号的圆圈。软件将识别椭球体的边界。如果选择了类固醇之外的区域，则通过按 alt 键或使用负数选择工具（工具栏中的负号）来排除该区域。
将光标拖动到错误选择的区域上，软件会将其从选择中删除。如果取消选择椭球体中的某个区域，则可以通过在按住 Shift 键的同时拖动来再次包含该区域。要更准确地工作，请通过更改工具栏中的画笔直径来调整鼠标指针的大小。
要计算所有活动选择项的面积，请在菜单栏中选择 analysis measure （分析度量）。将出现一个测量记录窗口，以像素为单位显示文件名和选择区域。如果在一个椭球体内测量多个选择，则第一行将显示所有区域和下面行的总和。
它将列出各个选择的值。将数据导出为文本文件并在 Excel 中打开它。此处显示了 MCF 10 A 1、正常乳腺上皮细胞、HAS 转化的 MCF 10 A neo T 细胞和 M 2 衍生的 MCF 10 CA one A 的 S 球体测定的实例。
M1 细胞在没有刺激的情况下仅表现出微弱的侵袭，但在 TGF β 刺激后侵袭明显更好。相比之下，RAs 转化的 M1 衍生物 M 2 在没有添加刺激的情况下有效侵袭，并且进一步增加了 4 到 5 倍。TGF β 处理后，M 4 细胞在无 TGF β 版和有 TGF β 版的情况下均表现出最强的侵袭性。
使用 Photoshop 获得该实验结果的图形表示，在本例中所示，SB 4 31 5 42 一种 A TP 类似物和 TGF β 受体 1 激酶活性的选择性抑制剂，以及在 1 型 B 受体中具有活性和在激酶 7 受体样受体中具有活性，被添加到细胞培养物 SB 4 31 5 42 中， TGF β 诱导的 M1、M 2 和 M 4 细胞的侵袭有效抑制，表明 TGF-β 诱导的侵袭是 TGF-β 受体 1 激酶依赖性的。此外，PHE 的基础侵袭受到强烈抑制。该实验结果的图形表示再次使用 Photoshop 创建，如下所示。
在此程序之后，可以执行其他方法，如 RNA 分离或蛋白质分离，以回答其他问题，例如表达哪些基因或表达哪些蛋白质。看完这个视频，你应该对如何找到 tavita 诱导的侵袭的新调节剂有一个很好的了解。
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概述
本文描述了一种用于定量测量转化生长因子（TGF）-β诱导的MCF10A细胞系在三维胶原凝胶中侵袭的测定方法。该方法可以适用于其他细胞系，以探索各种侵袭的激活剂或抑制剂。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 肿瘤学
- 侵袭测定
背景
- TGF-β是癌症进展的关键调节因子。
- 三维胶原凝胶为研究细胞行为提供了更生理相关的环境。
- MCF10A细胞系代表了乳腺癌的不同阶段。
- 现有方法可能无法准确反映三维侵袭动态。
研究目的
- 测量潜在调节因子对TGF-β诱导的侵袭的影响。
- 量化细胞在三维环境中的侵袭面积。
- 改进传统的二维测定。
使用的方法
- 从MCF10A细胞系中创建球体。
- 将球体嵌入胶原中以形成三维基质。
- 定量处理后的侵袭面积。
- 评估影响TGF-β通路的调节因子。
主要结果
- TGF-β通路的调节因子显著影响侵袭。
- 三维胶原基质更好地重现体内条件。
- 定量测量为侵袭机制提供了洞见。
- 该方法相比传统的划痕测定具有优势。
结论
- 该测定方法有效地测量了三维环境中TGF-β诱导的侵袭。
- 结果可以为乳腺癌进展的未来研究提供信息。
- 这种方法可能适用于其他细胞系和条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables quantitative measurement of TGF-β-induced invasion in a 3D collagen matrix, addressing a key challenge in modeling metastatic potential in breast cancer. By using the MCF10A isogenic series, it supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method improves predictive confidence by recapitulating in vivo-like invasion dynamics better than 2D assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates TGF-β receptor dependence in invasion using pharmacological inhibitors like SB 431542.
- Operational Value: Enables functional validation of targets across a malignancy gradient (M1, M2, M4) in a single isogenic system.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing on non-Smad pathways (e.g., MAPK) in TGF-β-mediated invasion.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative invasive area readouts via image analysis for dose-response screening.
- Operational Value: Standardizes spheroid formation and collagen embedding for reproducible 3D assay performance.
- Scientific Value: Measures modulator effects on invasion, enabling hit identification in pathway-focused screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links TGF-β signaling to invasive phenotypes in disease-relevant models of breast cancer progression.
- Operational Value: Provides a continuous readout from early to late malignancy stages for translational biomarker alignment.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing basal vs. TGF-β-stimulated invasion across cell states.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering a 3D-functional readout that bridges phenotypic screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses on TGF-β pathway modulators in a physiologically relevant context.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based outputs suitable for high-content adaptation.
- Analytics: Provides invasive area measurements in pixels, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects invasion phenotypes to malignancy grade using the MCF10A series.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying invasion regulators beyond TGF-β, such as cytokines or kinase inhibitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by quantifying invasion in 3D, improving target confidence.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized spheroid and collagen preparation steps.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing pathway-specific effects on invasion.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on invasion modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and spheroid handling.
- Dependent on collagen preparation and pH control for matrix consistency.
- Necessitates standardized imaging and image analysis protocols (e.g., Photoshop selection tools).
- Adaptation to other cell lines may require optimization of spheroid formation conditions.
- Limited to invasive phenotypes detectable as area expansion beyond spheroid boundaries.
