Name: 一个生产缺血性损伤模型的简化技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学习一种在兔耳上建立缺血性伤口模型的微创技术，通过分离血管束减少血供，适用于糖尿病兔的伤口愈合研究。该方法皮肤损伤小，操作简便，为缺血性创面研究提供可靠模型。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1RO1DK74566 和 1RO1AM52984 的支持。作者谨此感谢 RRC 的 Jacqueline McCarty 女士在手术过程中的协助，感谢 Jianpu Wang 博士和 Harshini Sarojini 博士在部分家兔手术及术后护理中的帮助，感谢 Rong Wan 博士在组织学方面的工作，以及感谢 Ming Li 女士在高效液相色谱法测定高能磷酸化合物中的贡献。

1. 解剖学基础
兔耳自20世纪早期以来一直是伤口护理研究的常用材料th 世纪。耳部由三条血管束（中央、颅侧和尾侧）供血；其中中央血管束最大，而颅侧和尾侧血管束中的血管大小存在变异。偶尔，尾侧动脉可能缺如。1 所有这些血管在剃除耳部毛发后，均可在背侧清晰辨认。图 1）。在腹侧，远端皮肤无法从近端血管获得血液供应。耳部背侧的三条血管束具有大量分支，这些分支穿过软骨为远端腹侧皮肤提供血液供应（图 2）。在一些兔子中，腹侧还存在一条非常细小的皮下血管，仅向不超过腹侧皮肤1/3的区域供血。在行环形开放皮肤切口时，腹侧切口基本不出血。
2. 手术操作
<ol>
	<li>称量兔子体重，并剃除耳部及颈背部的毛发。</li>
	<li>术前一小时经肌肉注射给予布托啡诺（0.01 mg/kg）作为预处理用药。</li>
	<li>通过肌肉注射氯胺酮（50 mg/kg）与赛拉嗪（5 mg/kg）的混合物诱导麻醉。</li>
	<li>手术期间使用加热垫保护兔子，用眼膏保护眼睛，并持续监测其生命体征。</li>
	<li>手术区域以外科擦洗剂进行无菌准备，并铺巾使双耳暴露。</li>
	<li>一侧耳造成缺血状态，另一侧耳作为配对的非缺血对照。</li>
	<li>通过动脉和静脉辨认三条血管蒂。</li>
	<li>使用#15刀片在距离耳基部约1-2 cm处的血管蒂上做三个小的纵向切口（1-1.5 cm）。</li>
	<li>分离中央静脉并用缝线环绕以牵拉；用4-0缝线结扎中央动脉并切断。</li>
	<li>伴行的中央神经也被切断。</li>
	<li>整个头侧血管蒂被结扎并切断。</li>
	<li>尾侧血管蒂予以保留。</li>
	<li>通过三个切口建立皮下隧道。此步骤通过止血钳进行钝性分离，以及刀片和剪刀进行锐性分离完成。所有皮下组织、肌肉、神经和小血管分支均被切断。真皮下方的小血管被完全切断。使用刀片将所有皮下组织切割至软骨水平。</li>
	<li>进一步采用锐性和钝性分离清理基底部，留下约5-10 mm宽的裸露软骨。</li>
	<li>该操作可阻断所有皮下血管分支，防止其快速建立侧支循环。</li>
	<li>出血量极少。如有出血，可通过纱布压迫轻松控制，无需电凝止血。</li>
	<li>耳内侧皮肤血供较少，因此不予切开。</li>
	<li>三个皮肤切口使用4-0或5-0缝线缝合，并覆盖无菌纱布。</li>
	<li>该方法仅造成三个小皮肤切口，相比开放手术显著减少了皮肤损伤。</li>
	<li>在每只耳的腹侧使用6 mm不锈钢打孔器制作四个全层圆形皮肤伤口。伤口之间的距离至少为20-30 mm。将打孔区域内的皮肤从软骨上剥离。同时去除软骨膜，可与皮肤一同或单独去除。肉芽组织形成和上皮化的基础为软骨，但软骨本身不被穿透（图 3）。</li>
	<li>当双耳伤口均完成后，在一侧的两个伤口上施用待测药物，另一侧的两个伤口施用对照药物。使用闭塞性敷料（TegaDerm, 3M）覆盖伤口部位，以防止伤口干燥。</li>
	<li>耳部下方的伤口通常比上方的伤口愈合更快。在进行伤口愈合比较研究时，建议将一侧的两个伤口与另一侧的两个伤口进行比较，或分别比较上方与下方的伤口。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>将芬太尼透皮贴剂（25 μg/小时）贴于背部皮肤，持续释放药物 2-3 天，以减轻可能发生的疼痛。</li>
	<li>兔子可自由进食和饮水。</li>
	<li>每日进行换药：移除旧敷料，使用无菌棉签清洁伤口，拍摄数码照片用于对比评估，然后敷上新敷料，并再次用 TegaDerm 覆盖伤口。换药过程中无需麻醉。</li>
	<li>每日测量每只耳朵的皮肤温度，用于比较分析。</li>
	<li>可使用经皮氧分压仪或激光多普勒血流仪测量耳部额外的血液循环情况。</li>
	<li>缝线可在一周后拆除。</li>
	<li>对于非糖尿病动物，大多数耳部伤口通常在 2-3 周内愈合。</li>
</ol>
4. 可能出现的并发症及如何避免
这种微创手术是安全的，且并发症罕见。除术后短暂的轻度耳部水肿外，本研究中的兔子均未出现任何严重手术并发症。然而，该手术仍存在一些潜在的并发症：
<ol>
	<li>出血。如果止血不彻底或损伤了较大的血管（如主要的血管蒂之一），切口处可能发生出血。通过仔细解剖即可轻易避免此问题。除了三大血管束外，皮下还有许多细小的血管分支。制作皮下隧道时会切断这些血管，但无需结扎。仅用纱布按压即可实现止血，操作简便：将纱布一角插入隧道内数分钟即可。缝合切口前，应确认无活动性出血。</li>
	<li>切口感染与裂开：若切口受到污染，可能发生此类并发症。通过严格采用无菌技术操作可有效预防，无需使用抗生素。然而，一旦发生感染，则需进行适当的引流和更换敷料。</li>
	<li>耳部水肿：由于血管结扎及淋巴循环中断，术后数天内可能出现轻度耳部水肿。但该症状可自行消退，无需特殊治疗。</li>
</ol>
5. 典型结果
自2007年以来，我们已在70多只兔子中采用了该操作，其中包括23只糖尿病动物。在糖尿病组中，手术在不同的糖尿病持续时间后进行：7只兔子的糖尿病持续时间为两周，4只持续两个月，10只持续12个月，另有2只持续24个月。
术后即刻，缺血耳呈现发凉、发绀，伴有轻度水肿。正常耳的最主要耳动脉——中央动脉搏动明显，但缺血耳的该动脉搏动消失。耳部活动能力下降，但并未完全消失。皮肤隧道部位可见明显凹陷，但在任何动物中均未发现缺血或坏死（图4）。
使用数字温度计（Omron Healthcare 公司的 Omron 产品，美国伊利诺伊州班诺克本，或 Fisher Scientific 公司的 K 型红外点温仪，美国宾夕法尼亚州匹兹堡）测量正常耳和缺血耳的皮肤温度。非缺血耳与缺血耳之间的温度差异范围为 1 至 10 °C，大多数兔子的温差在 2–6 °C 范围内。图 5 显示了 30 只兔子的平均温度差异。术后早期温差较大，在第 15 天后逐渐降低，但在术后一个月末仍保持一定水平。
在部分动物被处死后，测定了其组织中的高能磷酸盐含量。每只耳朵取6个组织样本，采用高效液相色谱法（HPLC）测定高能磷酸盐含量。正常耳组织中的ATP和总能量浓度均高于缺血耳组织。图6展示了术后23天处死的一只兔子的示例。正常耳组织的平均ATP含量为0.349±0.047 μMol/g（均值±标准差），缺血耳为0.237±0.059 μMol/g（p&lt;0.005）。正常耳组织的平均总能量（ATP+ADP+AMP）为0.882±0.137 μMol/g，缺血耳为0.556±0.115 μMol/g（p&lt;0.001）。
在所有组别（非糖尿病或糖尿病）中，缺血耳的伤口愈合时间始终长于非缺血耳。图7展示了缺血耳与非缺血耳上26对伤口之间的愈合情况比较。正常耳朵上的愈合时间为13至18天（平均14.9±1.6天），而缺血耳朵上的愈合时间为17至27天（平均20.5±3.4天）（p=0.001）。老年及糖尿病兔的伤口愈合时间更长，尤其是当糖尿病病程超过12个月时更为明显。
在这些兔子中，所有切口均正常愈合，无任何并发症发生，包括糖尿病病程达24个月的兔子。图8为组织学样本，显示愈合后的皮下隧道中肌肉组织缺失，被纤维组织所取代，但皮肤保持完整。
<img alt="兽医手术中耳部切口与隧道形成的示意图。" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 兔耳由三条血管束供血。中央血管束最大，颅侧血管束较小，尾侧血管束最小。剃毛后，这些血管在耳表面清晰可见。
<img alt="组织病理学示意图；显微镜图像显示组织结构；医学研究分析。" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 耳背侧的三条血管束不仅为背侧皮肤供血，还通过穿行血管为腹侧皮肤供血。箭头所示为穿过软骨的穿行血管。插图为这些血管的横切面。
<img alt="显示动物实验研究中耳部伤口和皮肤切口的手术示意图。" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 在耳部腹侧创建四个直径为 6 mm 的伤口，并同时去除骨膜。肉芽组织形成和上皮化的基础是软骨，但软骨本身未被穿孔。三个小的皮肤切口以极小的皮肤损伤予以闭合。
<img alt="动物颈部手术切口缝合；术后愈合情况，兽医操作。" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 皮肤切口闭合后，皮下隧道处的凹陷清晰可见。
<img alt="术后天数与温度差的散点图；线性回归 y=-0.1019x+4.2553。" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 30只兔子正常耳与缺血耳之间的平均皮肤温度差。术后早期温差范围为 7 °C 至 10 °C。温差随时间逐渐下降，但在术后一个月末仍保持一定水平。
<img alt="能量水平条形图，ATP与总能量，非缺血与缺血组织比较。" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 术后23天，缺血耳组织的高能磷酸盐含量较非缺血耳组织显著降低（p&lt;0.001）。
<img alt="伤口愈合时间比较；柱状图；非缺血、缺血；非糖尿病、糖尿病结果。" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 缺血耳的伤口愈合时间比非缺血耳更长（每组各26个伤口）。愈合定义为受损组织完整性恢复，即伤口部位完全再上皮化。
<img alt="组织学切片，上皮组织，显微镜图像，细胞结构分析，组织层次。" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 8"> 
图 8. 显示包含皮下隧道的耳部组织学样本。愈合后的组织比正常耳部更薄，原有的骨骼肌已消失，被纤维组织所取代。然而，皮肤保持完整。

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</ol>

本研究不存在任何经济利益冲突。

糖尿病影响着美国2360万人2,3，其中15%-20%的患者在一生中会发展为足部溃疡4,5，每年治疗费用超过250亿美元3,6。然而，即使采用目前最有效的治疗方法，治愈率也仅为50%，且常常是暂时性的7，糖尿病患者溃疡的复发率高达66%3,6。当糖尿病患者出现溃疡时，感染和截肢等严重并发症的发生率显著上升。尽管已有近一个世纪的广泛研究，并开发出数千种敷料产品，但至今尚无一种被证实真正有效。早在首篇描述慢性伤口治疗的论文中就曾指出：“1830年的老溃疡到了1860年仍是老溃疡”，这一说法至今仍然适用8。对于科研人员和临床医生而言，建立合适的伤口研究动物模型一直是一项重大挑战。虽然已有多种动物模型被构建或推荐用于伤口护理研究，但目前尚无一种模型能够真正模拟人类慢性难愈合伤口的情况9,10。这是因为人类糖尿病性伤口通常合并存在组织缺血、长期高血糖、氧化应激、神经病变以及细菌定植等多种因素。缺血可能并非糖尿病足溃疡最早的病因，但却是导致伤口长期不愈的主要原因11。这是因为...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">手术期间监测所需物品&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; 用于维持正常体温的加热垫。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 经皮血氧监测仪。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 体温监测仪。 &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">手术所需器械&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; 带#15刀片的#3手术刀。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 两把镊子（一把用于皮肤，另一把用于其他软组织）。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 2–3把小止血钳。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 一至两把显微剪刀（用于组织切割）。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 一把小剪刀（用于剪断缝线）。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 持针器。 &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 若干不锈钢打孔器（用于制造伤口）。 &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

一种简化的小鼠缺血性伤口模型制备技术

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

目前糖尿病伤口研究中的一个主要障碍是缺乏一种可在糖尿病动物身上安全使用的缺血性伤口模型。在非缺血性伤口中效果良好的药物，在人类糖尿病伤口中可能无效，因为血管病变是阻碍这类伤口愈合的主要因素之一。我们于2007年发表了一篇文章，描述了一种通过微创外科技术建立的兔耳缺血性伤口模型。此后，我们进一步简化了该操作步骤，使其更易于实施。在一侧耳部，于血管蒂处距耳基1-2 cm的位置做三个小的皮肤切口。结扎并切断中央动脉及其伴行神经。整个头侧血管神经束被切断并结扎，仅保留尾侧分支完整。通过这些切口创建一个环形皮下隧道，以切断皮下组织、肌肉、神经和小血管。另一侧耳作为非缺血性对照。在每侧耳的腹侧面制作四个伤口。该技术可在同一只动物身上产生4个缺血性伤口和4个非缺血性伤口，便于配对比较。术后，缺血侧耳部温度降低、呈青紫色，活动减少，耳动脉搏动消失。缺血耳的皮肤温度比正常耳低1-10 °C，且该温差可维持一个月以上。缺血耳组织的高能磷酸化合物含量低于对照耳。在采用相同治疗条件下，缺血耳的伤口愈合时间长于非缺血耳。该技术目前已应用于80多只兔子，其中23只为糖尿病兔（糖尿病病程从2周至2年不等）。所有兔子均未出现出血、感染或皮肤切口破裂等手术并发症。与其他多种模型相比，该模型具有皮肤损伤小、缺血时间长、成功率高等诸多优点。该模型可在抵抗力降低的动物中安全使用，并可根据不同实验需求进行修改。

我们开发了一种微创技术，通过分离中央动脉和神经以及颅侧神经血管束，建立兔缺血性耳部伤口模型。随后，通过皮下隧道切断所有皮下组织。该手术对皮肤的损伤极小，可安全用于糖尿病动物。

当前糖尿病伤口研究中的一个主要障碍是缺乏一种可在糖尿病动物身上安全使用的缺血性伤口模型。某些药物在非缺血性伤口中有效……

以下实验的总体目标是实现不仅在正常兔子中，而且在具有抵抗力下降的兔子（如老年或糖尿病兔子）中创建缺血性伤口。目前用于制造缺血性伤口的所有技术都具有高度侵入性，迄今为止，尚无任何一种技术可用于糖尿病动物。本方法采用微创手术，首先在三个血管束上方各做一个小的皮肤切口。下一步是分离并保护中央静脉和耳后血管束，以减少耳部的血液供应，但不完全阻断。最后，通过皮肤切口切断或结扎其余的血管、神经和皮下组织。通过动脉搏动消失、耳部外观、温度差异以及皮下血氧饱和度来确认耳部缺血。 这种微创手术看似难以操作，但实际上非常容易。该技术的主要优势在于对皮肤的损伤极小。自2007年我们首次发表该技术以来，已收到大量相关问题。此后我们进一步简化了该操作流程。为使操作更加简便且无需使用显微镜，首先称量所选兔子的体重，随后使用氯胺酮和赛拉嗪混合物对兔子进行麻醉。监测兔子的生命体征，可在耳背侧辨识出三条供应耳部的血管束。这些包括中央束，它是最大的一束，其侧支与其他血管相连；尾侧束，其中动脉通常非常小或缺如；以及颅侧束。在腹侧，远端皮肤的血液供应不来自近端血管。相反，耳背侧的血管束会发出大量穿透软骨的分支，为远端腹侧皮肤提供血液供应。在一些兔子中，腹侧还存在一条非常细小的皮下血管，但其供血范围不超过腹侧皮肤的三分之一。在行开放环形皮肤切口时，腹侧切口基本不出血。在继续操作前，通过脚趾夹捏测试疼痛刺激反应，并利用角膜反射确认兔子无反应；通过涂抹人工泪膏保护动物的眼睛；手术过程中使用加热垫保持兔子体温。然后使用聚维酮碘和酒精擦拭双耳及其周围皮肤，并对兔子进行铺巾，仅暴露双耳。一只耳朵将被造成缺血，而另一只耳朵作为对照。手术所用器械包括带15号刀片的手术刀、两对镊子（一对用于皮肤，另一对用于其他软组织）、三把蚊式钳、一至两对弯头显微剪刀、一对用于剪断缝线和坚韧组织的小剪刀、持针器以及若干不锈钢打孔器。通过识别动脉和静脉确定三条血管蒂，开始手术。使用15号刀片，在中央血管蒂上小心地做一个垂直皮肤切口。分离中央静脉并保护其周围组织。此步骤围绕中央静脉进行游离，以便牵拉。游离出中枢神经。它通常位于静脉的内侧。用剪刀将神经切断。游离中央动脉。该动脉通常位于头侧，位置较静脉更深，结扎并切断动脉。清理耳软骨上方中央静脉周围的组织。在精索蒂上方做第二个皮肤切口，以保护精索内的组织束。游离血管并将其环绕，以加以保护。当静脉较粗大时（如此处的兔子），此操作尤为有用。在此切口与第一个切口之间制作一个隧道。切开覆盖在软骨上的皮下组织。在颅侧束上方做第三个皮肤切口。整个束被结扎并分离。第三束上方的皮肤被切开。这条静脉非常靠近皮肤，因此不要切得太深。然后将整个血管束游离出来，结扎并分离。使用手术刀和剪刀，制作一个皮下隧道。这三个切口将皮下组织、肌肉、神经和小血管分支全部切断。使用额外的锐性分离和钝性分离清理基底部，保留约5到

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医学

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