模仿人类小分子RNA的LightSwitch萤光素酶检测系统使用3'UTR记者构造的microRNA识别目标在贴壁细胞
September 28th, 2011
微RNA（miRNA）是基因表达的重要调节因子，已被证明在许多生物过程中发挥的作用。为了更好地了解miRNA的UTR区的相互作用，我们已经创建了一个全基因组的3 UTR的荧光素酶记者的集合，搭配了一种新的荧光素酶基因的检测试剂，LightSwitch系统。
该程序的总体目标是将报告基因构建体与微型 RNA 模拟物共转染，以验证人类三个引物 T 中预测的微 RNA 靶标，这是通过首先布置实验设计来实现的，包括选择细胞系和选择微 RNA 模拟物以及实验和对照三个引牙 UTR Go 克隆报告基因构建体然后在转染前约 24 小时放置贴壁细胞。该程序的下一步是将每个实验或对照的三个引物 UTR go 克隆报告基因构建体与微 RNA 模拟物或非靶标和对照共转染，然后进行 24 至 48 小时的孵育。作为最后一步，将电灯开关荧光素酶检测试剂直接添加到细胞和培养物中，并在板式发光仪上读取 Lumin 气味信号。
最终，通过使用报告基因检测技术测量荧光素酶信号敲低，可以获得显示哪些人类三个引物 urs 是给定 micro RNA 的靶标的结果。这种方法可以帮助回答 micro RNA 研究人员的关键问题，因为它提供了一种功能测定来验证活细胞中预测的 micro RNA 三个主要 UTR 靶标相互作用。实验设计从选择合适的高转染贴壁细胞系开始，基于 micro RNA 模拟物的分析在 micro RNA 内源性表达水平低的细胞系中效果最佳。
然后选择 micro RNA 模拟物和非靶标对照对，包括非靶标对照至关重要，因为 cot 横切质粒和小 RNA 寡核苷酸会导致信号低于单独横切质粒。接下来，从 switchgears 全基因组集合中选择预克隆三个引物 UTR Go 克隆报告基因构建体。转到在线目录并单击 UTR 搜索按钮。
输入基因名称、基因符号或登录号列表后，搜索结果将提供载体和序列信息以及库存状态。现在选择 control reporter 构造。选择具有三个引物 ur 的对照构建体，不太可能被所选的 micro RNA（如管家、urs 或随机片段）靶向，以控制 micro RNA 过表达对整体细胞健康或检测信号的非特异性影响。
还可以考虑使用合成的 micro RNA 靶标报告基因作为第一天种子低传代贴壁细胞模拟活性的阳性对照，这样它们在 24 小时后将达到 80% 至 100% 的汇合度进行转染。使用高度融合的细胞是获得良好结果的关键。将细胞接种在白色 96 孔组织培养板中，总体积为 100 微升。
同时。查看透明板中突然汇合的适当细胞数量：在细胞就座后第 2 天 24 小时。准备转染解冻。
在室温下克隆报告基因构建体和微 RNA。解冻后，充分混合，在不含水的 RNA 中将 micro RNA 稀释至 2 微摩尔的工作浓度，goone 血浆 DNA 以 30 ng/μL 的浓度递送，无需进一步稀释。为了制备转染混合物，应考虑每个 D-N-A-R-N-A 组合应一式三份转染，体积应根据正在进行的检测数量进行缩放。
每次转染混合 9.85 μL 无血清培养基和 0.15 μL Dharma effect DUO 来制备转染试剂混合物。让混合物在室温下孵育 5 分钟。然后通过将 3.33 μL 的 go 克隆报告基因构建体与足够的 micro RNA 模拟物混合以达到所需的最终浓度，为每次测定制备 D-N-A-R-N-A 混合物。
用无血清培养基将体积调至 10 μL。接下来，将 10 μL 转染试剂混合物与 10 μL 每种 D-N-A-R-N-A 混合物混合并充分混合。每次测定的最终体积为 20 μL。
盖上盖子，在室温下孵育 20 分钟。孵育后，加入 80 微升预热的无抗生素。对每孔总体积为 100 μL 的完全培养基进行检测，最终模拟物浓度在 10 至 15 纳摩尔之间。
作为最后一步，小心地从接种细胞的每个孔中取出培养基，并替换为 100 μL 适当的最终转染混合物。将板放回培养箱中并孵育 24 至 48 小时。大多数混合物将在 24 小时内产生显着效果。
48 小时的孵育期将导致更高的孔间信号变化 在转染后第 3 天 24 小时，使用光开关荧光素酶检测试剂进行荧光素酶检测，细胞可以立即检测或在零下 80 摄氏度冷冻，然后再检测。添加冻融循环将导致增强的细胞裂解和更高的报告基因信号。将转染细胞板置于室温下。
然后根据试剂盒说明制备电灯开关荧光素酶测定溶液，并倒入无菌储液器中。使用多通道移液器将 100 μL 电灯开关测定溶液直接添加到每个样品中。在白色 96 孔板中，盖上板，避光，孵育后在室温下孵育 30 分钟。
在板上读取每个孔两秒钟 发光计，通过 cot 在 HT 10 80 细胞中测量 LE seven A 对三个引物 UTR 荧光素酶报告基因活性的敲低。用 let seven A 模拟或非靶对照横切每个报告基因构建体以分析结果。考虑来自非靶对照的信号对于每个构建体为 100%。
通过将来自特定 micro RNA 模拟物的信号除以非靶标对照信号来计算敲低百分比。任何给定的 micro RNA 模拟物都可能对整体细胞活力或检测信号产生非特异性影响，以校正任何非特异性影响。将实验性 UTR 靶标观察到的敲低结果与使用内务管理或随机对照 T 观察到的敲低结果进行比较，如图所示。
PONC 和干旱的 3 B 人 3 个引物 urs 是来自人类 3 个引物 UTR 报告基因的 7 个 A 微 RNA 信号的靶标，而干旱的 3 个 B 基因在 let 7 A micro RNA 模拟物存在下被显著敲低。而 housekeeping 和 random sequence URS 的信号则不是。观看本视频后，您应该对如何成功设置 cot、在活细胞中转染 microRNA 模拟物和三种引物 UTR 报告基因构建体以及在发光仪上读取信号以测量信号锁定有很好的了解。
概述
本研究着重于microRNAs（miRNAs）通过与3' UTRs相互作用来调节基因表达的作用。为了在人类细胞中验证这些相互作用，开发了一个新型荧光素酶检测系统，称为LightSwitch。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因调节
- MicroRNA生物学
- 荧光素酶检测技术
背景
- MicroRNAs对于基因表达调节至关重要。
- 理解miRNA-UTR相互作用对于阐明其生物学作用至关重要。
- 现有的研究这些相互作用的方法需要改进。
- LightSwitch系统为验证提供了一种新的方法。
研究目的
- 创建全基因组3' UTR荧光素酶报告基因集合。
- 在人类细胞中验证预测的miRNA靶标。
- 通过实验检测增强对miRNA功能性的理解。
使用的方法
- 与miRNA模拟物共转染报告基因构建物。
- 使用荧光素酶检测来测量报告基因活性。
- 选择适当的细胞系进行转染。
- 实验设计包括用于特异性的对照。
主要结果
- 通过荧光素酶信号测量成功验证了miRNA靶标。
- 识别了被miRNAs靶向的特定3' UTRs。
- 展示了LightSwitch系统的有效性。
- 结果表明在实验设计中控制构建物的重要性。
结论
- LightSwitch系统是miRNA研究的有价值工具。
- 研究结果有助于理解miRNA-UTR相互作用。
- 这种方法可以帮助回答基因调节领域的关键问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Functional validation of microRNA target interactions is critical for de-risking therapeutic hypotheses in early discovery. The LightSwitch Luciferase Assay System enables quantitative, reproducible measurement of miRNA-3'UTR effects in adherent cells, supporting target confidence and predictive modeling. This approach aids in prioritizing targets with mechanistic evidence before advancing to lead identification or phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides functional evidence for predicted miRNA-mRNA interactions through luciferase signal knockdown in a cellular context.
- Operational Value: Uses standardized Go Clone reporter constructs and synthetic miRNA mimics for consistent, scalable target interrogation.
- Predictive Value: Enables comparison of experimental versus control UTR reporters to distinguish specific from non-specific miRNA effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Designed for adherence cells in white 96-well plates, compatible with high-throughput transfection and luminescence detection.
- Reproducibility: Includes non-target controls to normalize for transfection efficiency and cell health artifacts.
- Scalability: Supports triplicate testing and volume scaling based on assay count, enabling plate-based workflow integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated miRNA targets can inform biomarker selection or pathway modulation strategies in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Confirms direct 3'UTR engagement, reducing ambiguity in miRNA mechanism of action prior to preclinical investment.
- Predictive Confidence: Quantitative knockdown data supports go/no-go decisions in target selection pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, connecting computational target prediction to functional validation before lead identification or assay development stages.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by validating whether a miRNA directly regulates a candidate target gene in living cells.
- Screening: Generates quantitative luminescence readouts that enable comparison across multiple 3'UTR constructs in parallel.
- Analytics: Percent knockdown calculation normalizes experimental signal to non-target control, supporting data-driven target ranking.
- Translational Research: Identified targets can be pursued in disease models where miRNA dysregulation is implicated.
- Enterprise Reuse: Standardized reporter constructs and protocols allow reuse across multiple miRNA target validation projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct evidence of miRNA-mediated gene regulation.
- Operational Value: Standardized reagents and plate-based format improve reproducibility across teams and sites.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection, reducing late-stage failure due to incorrect mechanistic assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation strength.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and nucleic acid transfection.
- Needs access to a plate luminometer and white 96-well tissue culture plates for optimal signal detection.
- Dependent on availability of specific 3'UTR Go Clone reporter constructs from the LightSwitch library.
- Requires optimization of cell confluence and transfection ratios for consistent results across adherent cell lines.
- Limited to adherent cell systems; suspension cells may require protocol adaptation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Experimental Design and GoClone 3'UTR Reported Selection
2:36
Co-transfection of 3' UTR Reporters and microRNA
5:00
Measurement of Luciferase Activity with LightSwitch Assay Reagents
5:48
Luciferase Knockdown Assay: Analysis and Representative Results
6:54
Conclusion
