利用3'非翻译区报告基因构建体和microRNA模拟物在贴壁细胞中使用LightSwitch荧光素酶检测系统鉴定人类microRNA靶标

本实验的总体目标是通过将报告基因载体与microRNA模拟物共转染，以验证在人源3'非翻译区（3' UTR）中预测的microRNA靶点。该目标的实现首先需要设计实验方案，包括选择合适的细胞系、选定microRNA模拟物，以及相应的实验组和对照组3' UTR GoClone报告基因载体。转染前约24小时，将贴壁细胞接种培养。随后，将每个实验组或对照组的3' UTR GoClone报告基因载体与microRNA模拟物或非靶向对照共转染入细胞，并进行24至48小时的孵育。最后一步是直接向细胞培养物中加入LightSwitch荧光素酶检测试剂，并使用酶标仪读取发光信号。

最终可以通过报告基因检测技术测量荧光素酶信号的抑制情况，获得结果以显示哪些人类3'非翻译区（3' UTR）是特定microRNA的作用靶点。该方法可帮助microRNA研究人员回答关键问题，因为它提供了一种功能性检测手段，用于在活细胞中验证预测的microRNA与3' UTR靶点之间的相互作用。实验设计首先需要选择合适的高转染效率且贴壁良好的细胞系；基于microRNA模拟物的检测在内源性microRNA表达水平较低的细胞系中效果最佳。

然后选择microRNA模拟物（mimic）与非靶向对照（non-target control）配对，包含非靶向对照至关重要，因为共转染质粒和小RNA寡核苷酸所获得的信号低于单独转染质粒时的信号。接下来，从SwitchGear基因组范围文库中选择预先克隆的3'非翻译区（3' UTR）GoClone报告基因构建体。进入在线目录并点击UTR搜索按钮。

输入基因名称、基因符号或登录号列表后，搜索结果将提供载体信息、序列信息以及库存状态。接下来选择对照报告基因载体。应选择带有3'非翻译区（3'UTR）的对照载体，这些区域不太可能被所选的microRNA靶向，例如管家基因的3'UTR或随机片段，以排除microRNA过表达对细胞整体健康状况或检测信号产生的非特异性影响。

还可考虑在第1天使用合成的microRNA靶标报告基因作为模拟物活性的阳性对照，接种低传代贴壁细胞，使其在24小时后转染时融合度达到80%至100%。使用高融合度的细胞是获得良好实验结果的关键。将细胞以100微升总体积接种于白色96孔组织培养板中。

同时进行。在第2天（细胞接种后24小时），于透明培养板中观察细胞密度，以达到合适的汇合度。准备进行转染前的解冻步骤。

在室温下解冻报告基因构建体和微小RNA。解冻后充分混匀，将微小RNA用无RNA酶的水稀释至工作浓度为2 µM。Goone血浆DNA的浓度为30 ng/µL，无需进一步稀释。配制转染混合物时，需考虑每种DNA-RNA组合应设三个重复，总体积应根据所进行的实验数量按比例放大。

通过将每转染 9.85 µL 无血清培养基与 0.15 µL DharmaFECT DUO 混合，制备转染试剂混合物。将该混合物在室温下孵育 5 分钟。然后，通过将每项检测 3.33 µL 的 GoClone 报告质粒与适量 microRNA 模拟物混合，以达到所需的最终浓度，制备 DNA-RNA 混合物。

用无血清培养基将体积补至10微升。接着，将10微升转染试剂混合物与每种DNA-RNA混合物的10微升混合，并充分混匀。每个检测的最终体积为20微升。

盖好培养板，室温孵育20分钟。孵育结束后，每孔加入80微升预热的无抗生素完全培养基，使每孔总体积达到100微升，从而在检测中获得10至15纳摩尔的终模仿浓度。

最后一步，小心吸出接种细胞各孔中的培养基，每孔加入 100 微升相应的最终转染混合液。将培养板放回培养箱，孵育 24 至 48 小时。大多数转染混合物在 24 小时内即可产生显著结果。

48 小时的孵育期将导致信号的孔间差异增大。在转染后第 3 天（即转染后 24 小时），使用 LightSwitch 荧光素酶检测试剂进行荧光素酶检测；细胞可立即检测，或在 -80 °C 冻存后择时检测。增加冻融循环可增强细胞裂解，提高报告基因信号。将转染后的细胞板恢复至室温。

然后根据试剂盒说明书配制光开关荧光素酶检测试剂，并倒入无菌储液槽中。使用多通道移液器将100 µL光开关检测试剂直接加入每个样品孔中。将样品置于白色96孔板中，盖上盖板，避光并在室温下孵育30分钟。孵育结束后进行后续操作。

使用酶标仪对每孔进行两秒的读数，通过共转染let-7a模拟物或非靶向对照，在HT 1080细胞中检测LE7A对3'非翻译区（3'UTR）荧光素酶报告基因活性的敲低效果。分析结果时，将每种构建体的非靶向对照信号设为100%。

通过将特定 micro RNA 模拟物的信号除以非靶向对照信号，计算敲低百分比。任何给定的 micro RNA 模拟物都可能对整体细胞活力或检测信号产生非特异性影响，需对此类非特异性效应进行校正。将实验性 UTR 靶标观察到的敲低效果与管家基因或随机对照 T 观察到的敲低效果进行比较，如下图所示。

PONC 和 ARID3B 人类 3' 非翻译区（UTR）是 let-7a 微小 RNA 的靶点。在存在 let-7a 微小 RNA 模拟物的情况下，PONC 和 ARID3B 基因的 3' UTR 报告系统信号显著被抑制，而管家基因和随机序列 UTR 的信号则不受影响。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在活细胞中成功共转染微小 RNA 模拟物与 3' UTR 报告质粒，并利用化学发光仪检测信号，以评估靶向抑制效应。