通过小型双特异性亲和标签实现的正交蛋白质纯化

以下实验的总体目标是通过两步亲和纯化流程制备高纯度的重组蛋白。为实现这一目标，将基于白蛋白结合结构域的双特异性纯化标签克隆至含有目的基因的表达载体中，并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。第二步是将含有目标蛋白的细菌裂解液通过固定化人血清白蛋白（HSA）的层析柱进行纯化。

随后，使用含有固定化Z结构域（来源于金黄色葡萄球菌蛋白A）的MAB select superior resistance或sure柱进行进一步纯化。该步骤可获得高纯度产物，适用于要求严苛的应用。接下来，通过SDS-PAGE检测纯度，必要时结合质谱分析，以确保目标蛋白已成功纯化至均一。结果显示，与仅使用本方案中新型双特异性纯化标签的单步纯化相比，连续两步纯化具有更高的纯化效率。该技术相较于现有方法（如单步亲和纯化）的主要优势在于，无论目标蛋白的性质如何，均可通过仅含一个亲和标签的简单流程获得高纯度蛋白。

该方法可用于具有广泛不同特性的蛋白质。此外，由于标签非常小，易于在细菌宿主中表达。通常，初次进行该纯化操作的人员会发现该方法非常简单直接。

关键步骤是在将样品上样到第二根层析柱之前调节其 pH 值。通过向源自链球菌蛋白 G 的白蛋白结合结构域中引入一个额外的结合位点，开发出一种具有两种内在亲和性的微型纯化标签。该 46 个氨基酸组成的白蛋白结合结构域折叠成稳定的三螺旋束结构，包含一个主要位于第二螺旋上的人血清白蛋白（HSA）结合位点；通过在第一和第三螺旋中对 11 个表面暴露的氨基酸进行基因随机化，利用噬菌体展示的组合文库，经过多轮针对源自金黄色葡萄球菌蛋白 A 的 D 域（diametric Z domain）的生物淘选，成功构建出一种对 HSA 和 Z 结构域均具有亲和力的双特异性分子，称为 ABDZ1。为构建双特异性融合标签表达质粒，需准备两侧带有合适限制性酶切位点的 ABDZ1 基因 PCR 片段，以便将其插入表达质粒中目标基因的起始端或终止端；使用选定的限制性内切酶在适当的反应缓冲液中对 ABDZ1 PCR 片段和含有目的基因的纯化表达载体进行酶切，并在连接前纯化酶切产物。

接下来，将经限制性酶切的ABDZ1片段连接至含有目的基因的表达载体中，并将连接产物转化入大肠杆菌。将转化后的细胞涂布于添加了适当抗生素用于筛选的琼脂平板上。通过PCR筛选若干菌落，并利用DNA测序对获得的表达盒进行序列验证。

最后，从经测序验证的菌落的过夜培养物中提取质粒，并将其转化至首选表达菌株中以表达目标蛋白。将带有新型标签融合至其末端的菌体，首先挑取单个细菌菌落接种于10毫升添加了5克/升酵母提取物及适当抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在150 RPM、37摄氏度条件下过夜培养。次日，将1毫升过夜培养物接种至100毫升新鲜培养基中，并诱导目标蛋白表达。

当细胞进入对数生长期后，将细胞在25摄氏度、150 RPM条件下诱导蛋白表达过夜，次日通过离心收集细胞。BDZ1融合蛋白的正交亲和纯化首先通过固定化HSA或zoma的柱子进行初步纯化，随后利用双特异性标签的第二种亲和性进行连续的纯化步骤。

带有固定化 Z 结构域（如 MA select sure）的层析介质可 readily 用于抗体的纯化。而人血清白蛋白（HSA）可通过化学偶联至层析介质，以构建第二种基质，用于进行正交亲和纯化。重悬沉淀，加入 25 毫升洗脱缓冲液。随后以 60% 振幅进行超声破碎，每超声 1 秒，暂停 1 秒，总时长 3 分钟。

离心样品后，在进一步纯化之前，将含有目标蛋白的上清液通过0.45微米滤膜过滤。接下来，在合适的蛋白纯化系统上，用10倍柱体积的流动缓冲液以每分钟1毫升的流速平衡1毫升HSA Spheros柱或与HSA偶联的NHS活化柱。平衡完成后，以每分钟0.5毫升的流速上样细菌裂解液，然后将流速重置为每分钟1毫升，并用5倍柱体积的流动缓冲液洗涤柱子，随后用5倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤。

以每分钟1毫升的洗脱缓冲液洗脱样品，并收集组分。监测280纳米处的吸光度，以选择洗脱峰中的组分。为进一步纯化，合并蛋白浓度最高的组分，然后稀释两倍。

确保运行缓冲液的 pH 值接近中性。此步骤对蛋白质与 Z 结构域的结合至关重要。如有必要，加入 1 M Tris-HCl（pH 8）以提高 pH 值。

接下来，以每分钟0.5毫升的流速将样品加载到已用Sure平衡液预平衡的1毫升High Trap MA Sure色谱柱上，流速重置为每分钟1毫升后，用5个柱体积的Sure运行缓冲液洗涤色谱柱。然后，对于敏感的目标蛋白，使用pH为2.7的0.2摩尔乙酸溶液进行洗脱。

收集后可通过添加T tris直接中和EIT。可使用H-C-L-S-D-S胶片评估蛋白质纯度。充分还原样品至关重要，因为在非还原条件下，A BDZ1中的游离半胱氨酸可能导致产物发生二聚化。

最后一步，在HSA柱上采用正交方案纯化后，再经MA select sure柱进一步纯化，可通过质谱分析纯化产物的分子量。在多个纯化阶段收集的不同样品通过SDS-PAGE进行分析。样品包括ABDZ1标签本身，以及三种与ABDZ1融合的不同人类靶蛋白，这些靶蛋白代表了不同的溶解度类别、分子量和等电点。

第1至第4泳道显示三种不同的AB DZ1融合蛋白以及AB DZ1标签本身的纯化前蛋白裂解物。第5至第8泳道显示蛋白质经HSA纯化步骤后的结果。最后，第9至第12泳道为最终单克隆抗体选择Sure纯化步骤的结果。

此外，本研究还分析了从相同裂解液中获得的样品，这些裂解液在相同层析柱上以相反顺序进行纯化。泳道一至三显示纯化前的裂解液，而泳道四至六为在 MAB Select Sure 柱上完成第一步纯化后所采集的样品。泳道七至九中的高纯度产物来自最终的 HSA 纯化步骤。

结果清楚地表明了双标签和两个高特异性纯化步骤的实用性。尽管从凝胶可以看出，初始纯化步骤后已获得较为理想的纯度，但后续步骤可得到纯度极高的产物，非常适合高要求的应用。一旦掌握，该方法的核心纯化步骤可由一人在数小时内完成，从而获得适用于多种不同应用的高纯度重组蛋白。

例如，通过此方法纯化得到的生物分子可用于其他应用，例如相互作用研究，以回答诸如复合物结合强度之类的问题。观看本视频后，您应能充分理解如何利用这种双亲和标签获得真正纯净的蛋白质产物。