Name: 由一个小型的双特异性亲和标签的推动正交蛋白质纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习利用小型双特异性亲和标签进行两步亲和层析纯化重组蛋白的方法。该技术通过HSA和Z结构域柱实现高效纯化，适用于多种特性的蛋白质，为生物化学研究提供简便可靠的解决方案。

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本项目由克努特和爱丽丝·瓦伦贝里基金会以及瑞典研究理事会资助。

1. 目的基因/ABDz1标签融合构建体的克隆
<ol>
 <li>准备ABDz1基因的PCR片段，该片段两侧需含有合适的限制性酶切位点，用于在表达质粒中与目标基因的N端连接（含有ABDz1的质粒可通过材料转移协议免费获得）。</li>
 <li>在合适的反应缓冲液中，使用选定的限制性内切酶对纯化的表达载体和PCR片段进行酶切，并在连接前纯化产物。</li>
 <li>将经酶切处理的ABDz1片段连接至含有目的基因的表达载体中，并将连接产物转化至E. coli（原始方法中使用了RR1ΔM15菌株8）。将转化后的细胞涂布于添加了适当抗生素的琼脂平板上进行筛选。</li>
 <li>对若干菌落进行PCR筛选，并通过DNA测序验证所获得的表达盒序列。</li>
 <li>从经测序验证的菌落的过夜培养物中提取质粒，随后将其转化至优选的表达菌株中（原始方法中使用的是E. coli Rosetta (DE3)菌株，该菌株携带pRARE质粒，有助于提高由人类基因编码的蛋白质的表达水平）。</li>
</ol>
2. 蛋白质表达
<ol>
 <li>挑取单个细菌菌落接种于10 ml添加了5 g/l酵母提取物和适当抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤中，于37 °C、150 rpm条件下过夜培养。</li>
 <li>取1 ml过夜培养物接种至100 ml新鲜培养基中，当细胞进入对数生长期时诱导蛋白表达（若使用lac操纵子，通常使用1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导）。</li>
 <li>于25 °C、150 rpm条件下过夜培养，并通过离心收集细胞。</li>
</ol>
3. 正交亲和纯化
<ol>
 <li>将沉淀重悬于25 ml洗脱缓冲液（25 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，1 mM EDTA，0.05 % (w/v) Tween 20，pH 8.0）中，使用超声波在60 %振幅、1.0/1.0脉冲模式下破碎细胞3分钟。离心样品，并将含有目标蛋白的上清液经0.45 μm滤膜过滤，用于后续纯化。</li>
 <li>在合适的蛋白纯化系统上，用10倍柱体积（CV）的洗脱缓冲液以1 ml/min流速平衡1 ml HSA Sepharose柱或根据供应商建议预先偶联HSA的NHS活化柱。以0.5 ml/min流速上样细菌裂解液，随后将流速调回1 ml/min。</li>
 <li>用5 CV洗脱缓冲液洗涤柱子，接着用5 CV洗涤缓冲液（5 mM NH4Ac，pH 5.5）洗涤。</li>
 <li>以1 ml/min流速用洗脱缓冲液（0.5 M HAc，pH 2.5）洗脱样品并收集组分，监测280 nm处的吸光度，以选择洗脱峰中的组分进行进一步纯化。</li>
 <li>合并蛋白浓度最高的组分，用SuRe洗脱缓冲液（20 mM磷酸盐，150 mM NaCl，pH 7.2）稀释两倍，并确保pH接近中性。如有必要，加入1 M Tris-HCl（pH 8）调节pH。</li>
 <li>将样品以0.5 ml/min流速上样至已用10 CV SuRe洗脱缓冲液（以1 ml/min流速）平衡的1 ml HiTrap MabSelect SuRe柱，上样后将流速重置为1 ml/min。</li>
 <li>用5 CV SuRe洗脱缓冲液（步骤5）洗涤柱子，然后用0.2 M HAc（pH 2.7）洗脱蛋白。对于敏感的目标蛋白，可在收集洗脱液的同时直接加入Tris-HCl进行中和。</li>
</ol>
如果调换色谱步骤的顺序，则可将MabSelect SuRe柱的洗脱液用运行缓冲液（步骤3.1）稀释，并通过加入1 M Tris-HCl将pH值提高至约8。通常情况下，当SuRe基质用于第二步时，观察到的峰更窄。
4. 采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估纯度
<ol>
 <li>将纯化的组分上样至还原性SDS-PAGE，并可根据需要通过质谱法分析纯化产物的分子量。必须充分还原样品，因为ABDz1中的游离半胱氨酸在非还原条件下可能导致产物发生二聚。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
作为原理验证，利用ABDz1标签对三种代表不同溶解度类别、分子量和等电点的人类靶蛋白（表1）进行了正交亲和纯化评估。将ABDz1基因与靶基因进行遗传融合，并在大肠杆菌（E. coli）中表达。图2展示了该方法所有步骤的流程图。通过正交纯化方案纯化后，对不同阶段收集的样品进行SDS-PAGE分析（图3）。结果明确显示了双标签和两个高特异性纯化步骤的优势。尽管从凝胶结果可见，初始纯化步骤后已获得较为理想的纯度，但后续步骤进一步获得了极高纯度的产物，非常适合高要求的应用。
<img alt="蛋白质螺旋示意图，标注氨基酸序列，结构生物学，分子分析。" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 用于筛选双特异性 ABDz1 标签的组合文库设计。 
该 46 个氨基酸组成的白蛋白结合结构域折叠成稳定的三螺旋束，其人血清白蛋白结合位点主要位于第二螺旋。通过在第一和第三螺旋中对 11 个暴露于表面的氨基酸进行基因随机化，构建出新的结合表面。图中显示了这 11 个位点，并按照 Kraulis 等人9 的编号方式进行标注。利用噬菌体展示的组合文库，对金黄色葡萄球菌蛋白 A 的 Z 结构域二聚体进行生物淘选，最终鉴定出双特异性 ABDz1 分子。
<img alt="重组蛋白纯化示意图；克隆、表达、纯化流程；SDS-PAGE 结果。" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 正交亲和纯化方案的简化流程图。 
包含 ABDz1 序列的 PCR 片段在合适的表达载体中与目的基因进行（N 端）连接。连接产物转化至 E. coli 中用于序列验证和质粒制备。随后将质粒转化至表达宿主中，从初始的过夜培养物开始进行大规模培养以表达重组蛋白。通过离心收集细菌，并通过超声破碎裂解，获得含有目标蛋白的细菌裂解液。经过滤步骤去除残留的固体颗粒后，裂解液在液体处理系统上依次进行两步正交亲和纯化。收集两步纯化中洗脱的峰组分，通过 SDS-PAGE 检测纯度，并与纯化前的裂解液进行比较评估。
<img alt="蛋白质纯化SDS-PAGE凝胶电泳结果；泳道分析，分子量标记物。" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 与ABDz1融合表达并纯化的目标蛋白的SDS-PAGE分析。 
从三种与ABDz1融合表达、具有不同特性的蛋白以及ABDz1标签本身的细菌裂解液中取样，并与经HSA柱纯化后、再经MabSelect SuRe柱纯化所得相应峰组分的样品一同进行分析（A）。泳道1-4代表纯化前裂解液样品，泳道5-8代表HSA柱纯化（第一步）样品，泳道9-12代表MabSelect SuRe柱纯化（第二步）样品。样品加载顺序如下：ABDz1-141377、ABDz1-HT875、ABDz1-HT2375和ABDz1。此外，还分析了相同裂解液样品在相同层析柱上以相反顺序进行纯化所获得的样品（B）。泳道1-3代表纯化前裂解液样品，泳道4-6代表MabSelect SuRe柱纯化（第一步）样品，泳道7-9代表HSA柱纯化（第二步）样品。样品加载顺序与（A）相同，但未包含标签蛋白本身。由这些结果可知，无论操作步骤顺序如何，该两步纯化方法均可获得高纯度蛋白。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>名称b</td>
 <td>靶蛋白 Uniprotc</td>
 <td>分子量 （kDa）</td>
 <td>溶解度 等级d</td>
 <td>融合产物的 分子量（kDa）</td>
 <td>融合产物的 等电点</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>141377</td>
 <td>B7Z315</td>
 <td>17.4</td>
 <td>4</td>
 <td>23.7</td>
 <td>8.5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HT875</td>
 <td>P01040</td>
 <td>10.8</td>
 <td>3</td>
 <td>17.1</td>
 <td>4.9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HT2375</td>
 <td>P00740</td>
 <td>8.9</td>
 <td>5</td>
 <td>15.2</td>
 <td>6.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol class="lalpha">
 <li>ABDz1 标签的分子量为 6.3 kDa，等电点为 6.7。</li>
 <li>目标蛋白是 Uniprot 蛋白的一部分。</li>
 <li><a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a>。</li>
 <li>带有 N 端 His6ABP10 的蛋白片段的溶解度分类。</li>
</ol>
表1. 在概念验证研究中评估的带有ABDz1标签a的靶蛋白及融合产物。
选择三种具有不同分子量、溶解度和等电点的独特人类蛋白质，通过正交亲和方法进行表达和纯化。

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍的正交亲和纯化方案可高效纯化多种目标蛋白。通过将白蛋白结合结构域的固有结合位点与一种新型结合表面相结合，开发出一种小型双特异性蛋白标签。该标签使用非常简便，只需将其克隆并表达为任何感兴趣蛋白的融合蛋白，适用于任意首选表达载体。两步蛋白纯化过程可采用大多数实验室常见的标准设备完成。由于ABDz1标签的功能依赖于结构域的正确折叠，以有效暴露其两个结合表面，因此该方法仅适用于以可溶形式表达的蛋白，不适用于变性条件下的纯化。此外应避免使用还原剂，因为它们会干扰ABDz1与MabSelect SuRe介质上Z结构域的结合。
正交亲和纯化为满足许多高要求应用中对高纯度蛋白质的需求，提供了一种有益的传统方法替代方案。同时，该方法在连续使用不同纯化策略时，避免了组合标签的需要。对于需要天然目标蛋白的应用，可引入蛋白酶切割位点，以实现ABDz1标签的酶切去除11。此外，ABDz1标签是迄今为止报道的首个双特异性的小型折叠蛋白结构域。其独特之处在于，提供了一种依赖于两种靶标特异性亲和相互作用的纯化策略。未来，通过开发携带新型结合表面的双特异性标签，并使其与 readily available 且廉价的层析树脂兼容，将这一概念进一步拓展将十分有意义。例如，通过将参与白蛋白结合的氨基酸替换为碱性残基，可能获得适用于离子交换层析的标签。类似的概念已通过Z结构域的电荷工程得到验证，由此产生的标签分别被称为适用于阴离子交换和阳离子交换的Zacid12和Zbasic13。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RR1&amp;#916;M15</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>35102</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Rosetta (DE3)</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70954</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Difco Laboratories</td><td>211822</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Difco Laboratories</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Vibra cell 超声破碎仪</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSA Sepharose</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td>已停产产品</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap NHS-活化 HP 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0716-01</td><td></td></tr></tbody></table>

通过小型双特异性亲和标签实现的正交蛋白质纯化

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

由于重组蛋白纯化成本较高，因此需要对实验方案进行优化。对于高通量研究，迫切需要无需针对目标蛋白进行特异性优化的通用方法1。为实现这一目标，通常采用可与目的基因进行遗传融合的纯化标签2。其中应用最广泛的亲和标签是六组氨酸标签（hexa-histidine tag），该标签适用于天然和变性条件下的蛋白纯化3。该标签的代谢负担较低，但其特异性不及其他基于亲和层析的竞争性策略1,2。
本文开发了一种双特异性纯化标签，该标签位于一个由46个氨基酸组成的小蛋白结构域上，具有两个不同的结合位点。其中的白蛋白结合结构域来源于链球菌蛋白G，对人血清白蛋白（HSA）具有强烈的内在亲和力。选取11个不参与白蛋白结合的表面暴露氨基酸位点4，通过基因随机化构建了一个组合文库。该蛋白文库具有新型随机排列的结合表面（图1），并在噬菌体颗粒上表达，以便利用噬菌体展示技术筛选结合分子。通过针对来源于金黄色葡萄球菌蛋白A的二聚体Z结构域5进行多轮生物淘选，鉴定出一种对HSA和新靶标均具有亲和力的小型双特异性分子6。
一种新型蛋白质结构域（称为ABDz1）被评估作为纯化标签，用于一系列具有不同分子量、溶解度和等电点的目标蛋白质。三种目标蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达，并在其N端融合了该新型标签，随后进行亲和纯化。使用固定化人血清白蛋白（HSA）或Z结构域的层析柱进行初步纯化，均获得了纯度相对较高的产物。采用双特异性标签的两步亲和纯化显著提高了蛋白质的纯度。目前已有商品化的Z结构域固定化层析介质（例如MabSelect SuRe），可用于抗体纯化；同时，HSA可方便地通过化学偶联固定于层析介质上，以提供第二类纯化基质。
当对回收目标蛋白的纯度要求较高时，该方法具有显著优势。标签的双功能特性允许使用两种不同的层析步骤，同时由于标签尺寸较小，对表达宿主的代谢负担也受到限制。该方法为所谓的组合标签策略提供了一种具有竞争力的替代方案，后者需联合使用多个标签1,7。

已开发出一种新颖且高效的两步亲和层析方案，并在此详细描述。该方法基于一种具有两种内在亲和性的微小纯化标签，适用于多种具有不同性质的目标蛋白。

由于重组蛋白纯化成本较高，相关实验方案需要进行优化。对于高通量研究而言，存在……

以下实验的总体目标是通过两步亲和纯化流程制备高纯度的重组蛋白。为实现这一目标，将基于白蛋白结合结构域的双特异性纯化标签克隆至含有目的基因的表达载体中，并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。第二步是将含有目标蛋白的细菌裂解液通过固定化人血清白蛋白（HSA）的层析柱进行纯化。随后，使用含有固定化Z结构域（来源于金黄色葡萄球菌蛋白A）的MAB select superior resistance或sure柱进行进一步纯化。该步骤可获得高纯度产物，适用于要求严苛的应用。接下来，通过SDS-PAGE检测纯度，必要时结合质谱分析，以确保目标蛋白已成功纯化至均一。结果显示，与仅使用本方案中新型双特异性纯化标签的单步纯化相比，连续两步纯化具有更高的纯化效率。该技术相较于现有方法（如单步亲和纯化）的主要优势在于，无论目标蛋白的性质如何，均可通过仅含一个亲和标签的简单流程获得高纯度蛋白。该方法可用于具有广泛不同特性的蛋白质。此外，由于标签非常小，易于在细菌宿主中表达。通常，初次进行该纯化操作的人员会发现该方法非常简单直接。关键步骤是在将样品上样到第二根层析柱之前调节其 pH 值。通过向源自链球菌蛋白 G 的白蛋白结合结构域中引入一个额外的结合位点，开发出一种具有两种内在亲和性的微型纯化标签。该 46 个氨基酸组成的白蛋白结合结构域折叠成稳定的三螺旋束结构，包含一个主要位于第二螺旋上的人血清白蛋白（HSA）结合位点；通过在第一和第三螺旋中对 11 个表面暴露的氨基酸进行基因随机化，利用噬菌体展示的组合文库，经过多轮针对源自金黄色葡萄球菌蛋白 A 的 D 域（diametric Z domain）的生物淘选，成功构建出一种对 HSA 和 Z 结构域均具有亲和力的双特异性分子，称为 ABDZ1。为构建双特异性融合标签表达质粒，需准备两侧带有合适限制性酶切位点的 ABDZ1 基因 PCR 片段，以便将其插入表达质粒中目标基因的起始端或终止端；使用选定的限制性内切酶在适当的反应缓冲液中对 ABDZ1 PCR 片段和含有目的基因的纯化表达载体进行酶切，并在连接前纯化酶切产物。接下来，将经限制性酶切的ABDZ1片段连接至含有目的基因的表达载体中，并将连接产物转化入大肠杆菌。将转化后的细胞涂布于添加了适当抗生素用于筛选的琼脂平板上。通过PCR筛选若干菌落，并利用DNA测序对获得的表达盒进行序列验证。最后，从经测序验证的菌落的过夜培养物中提取质粒，并将其转化至首选表达菌株中以表达目标蛋白。将带有新型标签融合至其末端的菌体，首先挑取单个细菌菌落接种于10毫升添加了5克/升酵母提取物及适当抗生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在150 RPM、37摄氏度条件下过夜培养。次日，将1毫升过夜培养物接种至100毫升新鲜培养基中，并诱导目标蛋白表达。当细胞进入对数生长期后，将细胞在25摄氏度、150 RPM条件下诱导蛋白表达过夜，次日通过离心收集细胞。BDZ1融合蛋白的正交亲和纯化首先通过固定化HSA或zoma的柱子进行初步纯化，随后利用双特异性标签的第二种亲和性进行连续的纯化步骤。带有固定化 Z 结构域（如 MA select sure）的层析介质可 readily 用于抗体的纯化。而人血清白蛋白（HSA）可通过化学偶联至层析介质，以构建第二种基质，用于进行正交亲和纯化。重悬沉淀，加入 25 毫升洗脱缓冲液。随后以 60% 振幅进行超声破碎，每超声 1 秒，暂停 1 秒，总时长 3 分钟。离心样品后，在进一步纯化之前，将含有目标蛋白的上清液通过0.45微米滤膜过滤。接下来，在合适的蛋白纯化系统上，用10倍柱体积的流动缓冲液以每分钟1毫升的流速平衡1毫升HSA Spheros柱或与HSA偶联的NHS活化柱。平衡完成后，以每分钟0.5毫升的流速上样细菌裂解液，然后将流速重置为每分钟1毫升，并用5倍柱体积的流动缓冲液洗涤柱子，随后用5倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤。以每分钟1毫升的洗脱缓冲液洗脱样品，并收集组分。监测280纳米处的吸光度，以选择洗脱峰中的组分。为进一步纯化，合并蛋白浓度最高的组分，然后稀释两倍。确保运行缓冲液的 pH 值接近中性。此步骤对蛋白质与 Z 结构域的结合至关重要。如有必要，加入 1 M Tris-HCl（pH 8）以提高 pH 值。接下来，以每分钟0.5毫升的流速将样品加载到已用Sure平衡液预平衡的1毫升High Trap MA Sure色谱柱上，流速重置为每分钟1毫升后，用5个柱体积的Sure运行缓冲液洗涤色谱柱。然后，对于敏感的目标蛋白，使用pH为2.7的0.2摩尔乙酸溶液进行洗脱。收集后可通过添加T tris直接中和EIT。可使用H-C-L-S-D-S胶片评估蛋白质纯度。充分还原样品至关重要，因为在非还原条件下，A BDZ1中的游离半胱氨酸可能导致产物发生二聚化。最后一步，在HSA柱上采用正交方案纯化后，再经MA select sure柱进一步纯化，可通过质谱分析纯化产物的分子量。在多个纯化阶段收集的不同样品通过SDS-PAGE进行分析。样品包括ABDZ1标签本身，以及三种与ABDZ1融合的不同人类靶蛋白，这些靶蛋白代表了不同的溶解度类别、分子量和等电点。第1至第4泳道显示三种不同的AB DZ1融合蛋白以及AB DZ1标签本身的纯化前蛋白裂解物。第5至第8泳道显示蛋白质经HSA纯化步骤后的结果。最后，第9至第12泳道为最终单克隆抗体选择Sure纯化步骤的结果。此外，本研究还分析了从相同裂解液中获得的样品，这些裂解液在相同层析柱上以相反顺序进行纯化。泳道一至三显示纯化前的裂解液，而泳道四至六为在 MAB Select Sure 柱上完成第一步纯化后所采集的样品。泳道七至九中的高纯度产物来自最终的 HSA 纯化步骤。结果清楚地表明了双标签和两个高特异性纯化步骤的实用性。尽管从凝胶可以看出，初始纯化步骤后已获得较为理想的纯度，但后续步骤可得到纯度极高的产物，非常适合高要求的应用。一旦掌握，该方法的核心纯化步骤可由一人在数小时内完成，从而获得适用于多种不同应用的高纯度重组蛋白。例如，通过此方法纯化得到的生物分子可用于其他应用，例如相互作用研究，以回答诸如复合物结合强度之类的问题。观看本视频后，您应能充分理解如何利用这种双亲和标签获得真正纯净的蛋白质产物。

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

由一个小型的双特异性亲和标签的推动正交蛋白质纯化

串联亲和纯化是一种用于鉴定蛋白质结合伴侣的可靠方法。作为概念验证，该方法已应用于研究较为深入的翻译起始因子...

使用串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用伙伴

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

我们介绍一种利用液体处理机器人进行亲和标签纯化重组蛋白的方法。该方法通常适用于高通量模式下小规模纯化可溶性His标签蛋白。...

高通量纯化亲和标签重组蛋白

来源：Becker, B., et al．一种基于荧光报告基因的简易检测方法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素A链（RTA）转运所需的细胞组分．J. Vis. Exp.

一种用于纯化重组细菌蛋白的亲和层析技术

在本视频中，我们演示了利用镍亲和层析技术从艰难梭菌（Clostridium...

基于镍亲和层析的蛋白质纯化：一种从细菌细胞裂解液中纯化聚组氨酸标签重组蛋白的技术

在本实验方案中，我们展示了一种高效且经济的小规模蛋白质纯化方法，该方法通过独特地结合可切割的GST标签和小型His标签，实现对重组蛋白的纯化。...

GST-His纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

串联亲和纯化（TAP）方法已广泛用于从细胞提取物（主要是真核细胞）中分离天然复合物，以进行蛋白质组学研究。本文介绍了一种经过优化的TAP方法实验方案，适用于为结构研究纯化天然复合物。...

使用串联亲和标签法纯化用于结构研究的天然复合物

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

在此方案中，将一种基于 DsRed 的表位配体固定化，以制备高选择性亲和树脂，用于从粗制植物提取物或细胞培养上清液中捕获单克隆抗体，可作为 Protein A...

用于快速开发亲和层析树脂的活化交联琼脂糖——以抗体捕获为例

本文提供了一种人源重组蛋白 flap 内切酶 1（FEN1）的亲和纯化方法，该蛋白带有...

使用快速蛋白液相色谱系统亲和纯化6X-His标签蛋白

学习利用小型双特异性亲和标签进行两步亲和层析纯化重组蛋白的方法。该技术通过HSA和Z结构域柱实现高效纯化，适用于多种特性的蛋白质，为生物化学研究提供简便可靠的解决方案。

通过小型双特异性亲和标签实现的正交蛋白质纯化

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