Name: 颅面间质细胞的电 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学习利用电穿孔技术将带电大分子导入非洲爪蟾颅面间充质细胞，通过荧光显微镜实时观察胚胎发育过程中的组织变化。该方法为发育生物学研究提供了精确的时空控制手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢 Nancy Papalopulu 和 Boyan Bonev 在 Xenopus 电穿孔实验方面的帮助。同时感谢 Marc Dionne 对本文的审阅，感谢 Jeremy Green 和 John Wallingford 的有益讨论，以及感谢 Liu 实验室成员提供的支持。本研究由英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，项目编号 BB/E013872/1）和惠康基金会（Wellcome Trust，项目编号 081880/Z/06/Z）向 KJL 提供资助。

第1A部分. 仪器设备
显微镜：配备低倍物镜的直立式体视解剖显微镜
<ul>
 <li>电压/脉冲发生器： BTX ECM 830 方波电穿孔系统</li>
 <li>拉针仪： P-87 微电极拉制仪（Sutter Instrument Company, CA）</li>
 <li>操纵器： 粗调，或根据实验准备情况选用兼具粗调和微调功能的操纵器。</li>
 <li>微电极夹持器： Fine Science Tools</li>
 <li>电极： 自制</li>
 <li>电穿孔室： 自制</li>
</ul>
L 形电极：
<ol>
 <li>剪取8 cm长的高纯度0.4 mm钨丝（Goodfellow），使用橡皮泥（我们使用Blu-Tack）在其中点固定一个1 ml注射器。使钨丝从注射器尖端露出4 cm，并在距末端1 cm处将尖端弯成L形（图1A）。</li>
 <li>修整尖端，使其末端长度为0.5 mm。此尖端即为电极终端。</li>
 <li>将多余的钨丝沿注射器平行引出，用于连接电脉冲发生器。</li>
 <li>重复上述步骤，制备一对电极。</li>
 <li>通过直流电缆将电极连接至方波脉冲发生器。</li>
</ol>
电穿孔室
<ol>
 <li>用约 5 mm 的无毒黏土铺满 90 mm 培养皿底部。</li>
 <li>向培养皿中加入电穿孔介质。</li>
 <li>使用 5 号钟表匠镊子雕刻出 T 形凹槽（图 2）。长槽尺寸约为 2 mm × 2 mm × 10 mm，短槽约为 2 mm × 2 mm × 5 mm。电穿孔培养皿可清洗后重复使用。</li>
</ol>
第1B部分. 试剂
DNA 或带电大分子
<ul>
 <li>微量移液器：1 mm 宽、4 英寸长的硼硅酸盐玻璃毛细管（WPI，TW100-F）</li>
 <li>培养基：正常两栖类培养基（NAM）</li>
 <li>&gt;10 X 储存液：1100 mM NaCl，20 mM KCl，10 mM Ca(NO3)2•4H2O，1 mM EDTA。
 <ul>
 <li>高压灭菌后于 4 °C 保存。</li>
 <li>1 X NAM：由 10x 储存液稀释而成，用 0.1 mM NaHCO3 和 0.2 mM Na3PO4 缓冲。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Xenopus laevis 蝌蚪，28 期</li>
</ul>
DNA 制备：
<ol>
 <li>使用标准方案制备表达质粒。</li>
 <li>用无核酸酶的 H2O 将 DNA 重悬至终浓度为 1 μg/μl。</li>
</ol>
* 我们在使用含有强CMV启动子的载体（如pCS2+ [16]）时已获得成功。进行谱系分析时，我们通常加入编码绿色荧光蛋白的DNA（pCS2+GFP），终浓度为0.1 μg/μl。[我们还测试了0.1–3 μg/μl范围内的DNA浓度。发现低于0.8 μg/μl的浓度标记细胞效率较低，而高于2 μg/μl的DNA浓度并不能提高电穿孔效率。]
吗啉代寡核苷酸制备：
（注意：MOs 需要进行荧光素标记（3'-羧基荧光素修饰）或其他带电修饰。）
<ol>
 <li>将吗啉寡核苷酸（MOs）（Genetools，<a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a>）用无核酸酶的 H2O 溶解，配制成 2 mM 的储存液。</li>
 <li>将储存液分装后于 65°C 加热 5 分钟。</li>
 <li>用无核酸酶水稀释至终浓度为 0.5 mM。</li>
</ol>
* 测试了 0.1–1 mM MO 溶液。0.5 mM MO 溶液已足以对多种间充质细胞进行电穿孔。
微量移液器
<ol>
 <li>使用硼硅酸盐玻璃毛细管（直径1 mm，长4英寸，WPI编号TW100-F）制备微电极。用拉针仪制备具有8–12 mm长锥形部分和尖细末端的微电极。</li>
 <li>用镊子从尖端起约2 mm处夹碎尖端，形成锯齿状断裂。</li>
</ol>
培养基
<ol>
 <li>孵育培养基：用1x储存液配制新鲜的3/4正常两栖类培养基（NAM），加入0.025 mg/ml的庆大霉素。</li>
 <li>电穿孔培养基：配制方法同上，加入0.1%苯佐卡因（Benzocaine，Sigma，06950）。</li>
</ol>
2. 电穿孔
微量移液器设置
<ol>
 <li>用微量移液器吸取约 1 μl 注射溶液。</li>
 <li>将微量移液器固定在显微操作仪上，并连接至显微注射仪（Picospritzer II）。</li>
 <li>将微量移液器与桌面呈 50° 角放置。</li>
 <li>设定注射压力为 20 PSI。</li>
 <li>校准微量移液器，使每次脉冲注射量为 30 nl。</li>
</ol>
蝌蚪制备
<ol>
 <li>将28期的Xenopus幼体置于电穿孔培养基中孵育5分钟，以进行麻醉。</li>
 <li>将已麻醉的蝌蚪转移至盛有电穿孔培养基的电穿孔室中。将胚胎置于长槽内，使头部位于T型连接处，背侧朝下，腹侧暴露。头部应略高于尾部。</li>
 <li>使用镊子，用周围的塑泥轻轻固定蝌蚪。注意：若蝌蚪未被固定，其可能在电穿孔过程中抽搐并接触电极，此时应弃用该蝌蚪，因其面部组织将受到严重损伤。</li>
</ol>
电穿孔
<ol>
 <li>将微量移液器尖端插入胶腺后方并进入面部间充质。</li>
 <li>向间充质中注射 30 nl 溶液。</li>
 <li>撤回微量移液器。</li>
 <li>迅速将电极尖端与胚胎头部平行对齐（图 3）。</li>
 <li>施加 8 次 50 ms、20 V 的方波脉冲。</li>
 <li>撤回电极。</li>
 <li>用镊子小心地将蝌蚪从孔中释放，并转移至 3/4 NAM、0.025 mg/ml 庆大霉素中。</li>
 <li>蝌蚪可在 3/4 NAM、0.025 mg/ml 庆大霉素中孵育过夜或更长时间。</li>
 <li>24 小时后通过荧光显微镜筛选电转效率高的胚胎。</li>
</ol>
3. 代表性结果：
使用荧光分子可方便地筛选电穿孔的胚胎。图4显示了在14.5°C下孵育的、电穿孔后约12小时、48小时和96小时的典型MO电穿孔蝌蚪群体。通过荧光显微镜观察，可在电穿孔后立即检测到MO信号，且该信号在电穿孔后数天内持续存在。根据我们的经验，荧光在46期（约5天后）仍可微弱观察到。在软骨组织中，荧光在分化开始后（约42期）显著减弱；然而，在咽部内胚层等其他细胞类型中，MO荧光仍保持较强信号。荧光显微镜显示，寡核苷酸被整合至包括软骨在内的多种颅面组织中。寡核苷酸的荧光信号常可在头部两侧的组织中观察到，这可能是由于注射液在电穿孔前迅速扩散至疏松的颅面间充质所致。
 
 
 
<img alt="钨丝装置，1ml 注射器，电极末端；直流电缆，用于电学实验。" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 1"> 
图 1 自制电极。将L形钨丝使用无毒黏土或橡皮泥固定在1 ml注射器上。（A）电极末端长度为5 mm。（B）成对安装电极，使末端相互平行。通过直流电缆将电极连接至脉冲发生器。
<img alt="28期蝌蚪电穿孔实验装置示意图，包含尺寸标注和组件标签。" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2 电穿孔腔室。（A）在直径90 mm的培养皿中用黏土衬底，加入培养液，并用5号钟表镊雕刻出T形腔室。（B）长臂尺寸为2 mm × 2 mm × 10 mm，短臂为2 mm × 2 mm × 5 mm。胚胎头部置于T形连接处，腹面朝上。
<img alt="基因编辑过程示意图；用于发育研究的胚胎显微注射方法。" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 
图3 电穿孔操作流程示意图。将28期蝌蚪置于电穿孔室中，腹面朝上。将微移液管插入胶质腺下方的面部间充质组织中，进行注射。移出微移液管后，将L形电极平行置于头部两侧。施加8次50毫秒、20伏的方波脉冲。撤回电极。将蝌蚪培养至所需发育阶段。利用荧光显微镜观察吗啉寡核苷酸（MOs）或绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况。
<img alt="蝌蚪发育阶段；荧光显微镜；形态学观察；基因表达分析。" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 4"> 
图 4 电穿孔后 12 小时（A）、48 小时（B）和 96 小时（C）的代表性蝌蚪（分别为阶段 30、34 和 44）。（A"–B"）在阶段 30 和 34 时，可在颅面间充质中观察到荧光标记的吗啉代寡核苷酸（MO）。在阶段 44 时，软骨中可检测到荧光信号（箭头，C'–C"）。肠道具有强烈的自发荧光。

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
<li>Falk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Electroporation+in+vivo+within+the+Intact+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).</li>
<li>Kuriyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tsukushi+controls+ectodermal+patterning+and+neural+crest+specification+in+Xenopus+by+direct+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22of+BMP4+and+X-delta-1+activity.+Development%22%5BJournal%5D)">Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation.</a> of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).</li>
<li>Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+effective+gene+knock-down+in+early+chick+embryos+using+morpholinos+but+not+pRFPRNAi+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors.</a> Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).</li>
<li>Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> Embo. J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109, 205-216 (2002).</li>
<li>Grossin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+rat+articular+cartilage+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation.</a> Faseb. J. 17, 829-835 (2003).</li>
<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
<li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

在本视频中，我们展示了通过电穿孔介导将基因递送至非洲爪蟾（Xenopus）蝌蚪面部间充质的可行性。利用该方法，我们可以绕过基因功能操作在早期发育阶段产生的影响，从而在较晚的时间点靶向特定组织。我们的研究表明，颅面间充质细胞的异质性群体均可被影响，使我们能够追踪电穿孔细胞的谱系，并研究目标蛋白的细胞自主性需求。结合活体成像技术，我们可以利用该方法在颅面发育过程中随时间推移研究基因功能。这一新方法凸显了非洲爪蟾（Xenopus）在器官发生研究中的可操作性。我们预期该方法也可广泛适用于其他组织的形态发生与分化研究。

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

颅面间充质细胞的电穿孔

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

电穿孔是一种在精确的时间点和特定位置将DNA及其他带电大分子高效导入组织的有效方法。例如，电穿孔已被成功用于研究神经和视网膜发育 非洲爪蟾，鸡和小鼠 1-10然而，需要注意的是，在所有这些研究中，研究人员并未以软组织为靶标。由于我们关注颅面发育，因此我们改进了一种方法以靶向面部间充质。
在查阅文献时，我们惊讶地发现，有关成功将基因转入软骨组织的报道极少。这些研究大多属于基因治疗领域，例如将siRNA或蛋白质递送至软骨细胞系，或应用于关节炎动物模型11-13。在其他系统（如鸡或小鼠）中，对面部间充质进行电穿孔操作一直具有挑战性（个人通讯，伦敦国王学院颅面发育系）。我们推测，在Xenopus的前软骨及软骨组织中进行电穿孔可能效果更佳。在我们的研究中，我们发现，在发育早期阶段（28期），当面部原基仍由软组织构成、尚未发生软骨分化时，基因可高效转入面部软骨组织。
非洲爪蟾 是研究颅面发育的一个非常易于操作的脊椎动物体系。颅面结构在其中更易于观察 非洲爪蟾 比其他任何脊椎动物模型都更为显著，主要原因是 非洲爪蟾 胚胎体外受精，便于分析最早期的发育阶段，并支持以单细胞分辨率进行活体成像，同时可重复利用母体 14在体外发育的脊椎动物模型中， 非洲爪蟾 在颅面部分析方面，比斑马鱼更有用，因为 非洲爪蟾 幼虫体型更大，更易于解剖，且面部发育区域比鱼类相应区域更便于成像。此外 非洲爪蟾 在进化上比斑马鱼更接近人类&tilde;1亿年更近 15最后，在这些阶段， 非洲爪蟾 蝌蚪具有透明性，同时表达荧光蛋白或分子可便于直观观察发育中的软骨。我们预期该方法将使我们能够快速高效地在活体中检测候选分子 体内 模型系统。

颅面软骨在发育过程中与其他组织紧密接触，在活体动物中难以进行操作。我们正在利用电穿孔技术在颅面骨骼生长过程中递送分子工具，同时避免早期胚胎效应。该方法将使我们能够高效地验证候选分子 体内

电穿孔是一种在精确的时间点和特定位置将DNA及其他带电大分子高效导入组织的有效方法。

本实验的总体目标是将带电大分子电穿孔导入颅面间充质组织。首先将一只麻醉后的28期胚胎置于电穿孔腔室内，随后将含有带电大分子的溶液微量注射至颅面间充质组织中。随后迅速施加电流，从而将带电核苷酸导入其他细胞中。该操作步骤的最后一步是通过荧光显微镜观察电穿孔处理的组织。最终可获得结果，显示颅面组织的变化。这些结果可以通过荧光、显微镜或免疫组织化学方法在活体或固定组织中进行分析。与显微注射和基因突变等现有方法相比，电穿孔的主要优势在于能够对分子工具实现组织特异性和时间特异性的控制。今天演示该实验操作的是我实验室的博士后 Jackie Tabler。本实验所需的 L 形电极由高纯度 0.4 毫米钨丝制成，每个电极需先截取八厘米长的钨丝。然后使用类似蓝丁胶的材料将一支一毫升注射器固定在钨丝的中点位置，使注射器尖端露出四厘米长的钨丝。将钨丝末端距离顶端一厘米处弯成L形。修剪尖端，使其末端长度为0.5厘米。该提示是将电极末端的多余钨丝与注射器平行放置。在制作第二个电极后，此钨丝将用于连接电极脉冲发生器。使用胶带将一对电极相互固定，使电极末端平行排列，间距为一厘米。最后，通过直流电缆将电极连接至方波脉冲发生器。为制备自制的电穿孔室，先在直径90毫米的培养皿底部铺上约5毫米厚的无毒石膏场景造型黏土，然后加入电穿孔培养基，使石膏场景完全浸没。然后使用5号钟表匠镊子在石膏模型中雕刻出T形电穿孔腔室。该腔室的长边尺寸应约为2毫米×2毫米×10毫米，短边尺寸应为2毫米×2毫米×5毫米。该操作所用的微移液管由硅酸盐玻璃毛细管制成。使用拉针仪制备微毛细管，使其具有8至12毫米长的锥形部分和尖细的尖端，然后用镊子在距离尖端约2毫米处夹碎尖端，形成锯齿状断裂，以制备显微注射针。首先，向其中注入约1微升的注射溶液，本演示中该溶液含有荧光标记的寡核苷酸。接着，将微毛细管固定在显微操作器上，并将其角度调整为与实验台面成50度角。将注射压力设置为 20 PSI，并校准显微注射针，使其每次脉冲注射 30 微升。为准备电穿孔，将 28 期的爪蟾幼虫置于含 0.1% 苯佐卡因的普通两栖类培养液中孵育 5 分钟以进行麻醉，随后将麻醉后的蝌蚪转移至电穿孔 chamber 中。其中充满电穿孔介质。该操作中最困难的部分是将显微电极插入蝌蚪体内。为了确保成功，必须将胚胎牢固固定，然后在显微注射后迅速施加电流。将胚胎置于长形凹槽中，使其头部位于T形连接处。保持背侧朝下、腹侧暴露，使用镊子将头部略微抬高，使其略高于尾部，然后用周围的石膏固定蝌蚪。固定蝌蚪至关重要，以防止其在电穿孔过程中抽搐，否则可能导致面部组织严重损伤。开始此操作时，将微移液管尖端插入胶腺后方并进入面部间充质。向间充质内注射30纳升溶液，随后撤回微移液管。迅速将电极尖端与胚胎头部平行对齐，并施加8次50毫秒、20毫伏的方波脉冲。然后使用镊子收回电极。小心地将蝌蚪从孔中释放。接着用移液器将蝌蚪转移至含有0.025毫克/毫升的四分之三浓度诺姆溶液中。庆大霉素蝌蚪可在转染24小时后于该培养基中孵育过夜或更长时间。通过荧光显微镜筛选蝌蚪，以评估电穿孔效率。使用荧光分子可便于对电穿孔胚胎进行筛选。该图显示了电穿孔后约12小时、48小时和96小时的典型形态寡核苷酸电穿孔蝌蚪，分别对应于30期、34期和44期。在30期和34期，可在颅面间充质中观察到荧光标记的形态寡核苷酸。在 44 期时，可在白色箭头所示的软骨中检测到荧光。高度自发荧光的区域是肠道。通过此方法，我们可追踪电感受细胞的谱系以及目标蛋白的分子需求。该方法可与活体成像技术相结合，以在颅面发育过程中随时间推移研究基因功能。

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

颅面间质细胞的电

单细胞电穿孔（SCE）是一种专门技术，可用于将DNA或其他大分子递送至完整组织内的单个细胞中，包括在体实验样本。本文详细描述了在非洲爪蟾（Xenopus...

活体完整发育大脑中的单细胞电穿孔技术

本实验方案描述了一种分离和培养小鼠耳蜗柯蒂器官（可选择性保留或去除螺旋缘和螺旋神经节神经元）的方法。我们还展示了通过电穿孔技术在柯蒂器官外植体中表达外源报告基因的方法。...

小鼠耳蜗柯蒂氏器的原代培养与质粒电穿孔转染

本文介绍了一种组织移植技术，旨在测试颅面发育过程中头部表面外胚层的信号传导和模式形成特性。...

评估颅面发育过程中外胚层上皮的信号特性

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

本文介绍了一种利用独特手术方法和特殊形状电极将基因转入发育中 小鼠大脑...

小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

为了快速评估基因在大脑皮层发育过程中的功能，我们描述了涉及以下内容的方法 离体...

神经元形态发生研究方法 离体 胚胎小鼠大脑皮层中的RNAi电穿孔技术

神经元网络如何在胚胎大脑中建立是发育神经生物学中的一个基本问题。在此，我们将电穿孔技术与新型遗传工具相结合，如在禽类后脑中使用Cre/Lox质粒和PiggyBac介导的DNA转座系统，以标记背侧中间神经元，并在不同发育阶段追踪其轴突投射及突触靶点。...

电穿孔法标记鸡胚后脑以示踪轴突投射路径及突触靶点

软脑膜表面是中枢神经系统中一个独特的前体细胞区域，正受到越来越多的关注。本文详细介绍了一种利用改良电穿孔技术快速进行该前体区域遗传操作的方法。该方法可用于研究细胞谱系和参与细胞分化过程的信号通路，进而阐明子代细胞的命运及其生物学特性。...

新生小鼠软脑膜表面电穿孔技术

我们介绍一种从胚胎小鼠内耳分离和培养耳蜗外植体的方法。同时，我们还演示了通过方波电穿孔法将基因转入耳蜗外植体的技术。体外外植体培养结合基因转移技术，使研究人员能够研究在发育过程中改变基因表达所产生的影响。...

小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

在此，我们介绍一种结合了 体内...

颅顶耳长肌体内联合电穿孔与短期再神经支配

本文介绍了通过电穿孔技术对人脑皮层类器官切片进行急性基因操作的方法。这些皮层类器官模型特别适合显微注射，因为切片后可轻易识别出类似脑室的结构，从而能够对人类皮层发育、神经发育障碍以及皮层进化进行功能研究。...

电穿孔转染人脑皮层类器官切片用于基因功能研究

学习利用电穿孔技术将带电大分子导入非洲爪蟾颅面间充质细胞，通过荧光显微镜实时观察胚胎发育过程中的组织变化。该方法为发育生物学研究提供了精确的时空控制手段。

颅面间充质细胞的电穿孔

探索更多视频