颅面间质细胞的电

该程序的总体目标是将带电的大分子电作到颅面部间充质中。这是通过首先将麻醉的 28 期胚胎定位在电穿孔室内来实现的。下一步是将含有带电大分子的溶液微量注射到 C 颅面间充质中。

紧随其后的是施加电流，从而将带电核苷酸引入其他细胞。该程序的最后一步是通过荧光显微镜观察电穿孔组织。最终，可以获得显示颅面部组织变化的结果。

这些结果可以使用荧光、显微镜或免疫组织化学在体内或固定组织中进行分析。与显微注射和突变等现有方法相比，电穿孔的主要优势是对我们的分子工具进行组织和时间控制，我实验室的博士后 Jackie Tabler 将证明我们今天的程序。此过程所需的一对 L 形电极由高纯度的 0.4 毫米钨丝制成，每个电极首先切割 8 厘米的钨丝。

然后使用腻子（如蓝色粘性）影响钨丝中点的 1 毫升注射器，使注射器尖端露出 4 厘米的金属丝。将尖端弯曲成 L 形，距末端 1 厘米。修剪尖端，使末端长度为 0.5 厘米。

这个尖端是将多余的钨丝平行于注射器的电极末端。在制作第二个电极后，它将用于连接电极脉冲发生器。用胶带将一对电极彼此固定，使电极端子 I 平行运行，相距 1 厘米。

最后，通过直流电缆将电极连接到方波脉冲发生器。为了准备定制的电穿孔室，请在 90 毫米培养皿的底部铺上大约 5 毫米的无毒石膏场景造型粘土。用电穿孔介质填充培养皿，浸入石膏场景。

然后使用 5 号制表师的镊子在石膏场景中雕刻一个 T 形井，以形成电穿孔。井的长边尺寸约为 2 毫米 x 2 毫米 x 10 毫米，短边应为 2 毫米 x 2 毫米 x 5 毫米。用于此程序的微量移液器由硅酸盐玻璃毛细管制成。

使用针式拔出器制备具有 8 至 12 毫米长锥度和细尖端的微量移液器，使用镊子将尖端从尖端挤压约 2 毫米，形成锯齿状断裂以设置微量移液器。首先，用大约 1 微升的注射溶液填充它，在该演示中，该溶液包含荧光标记的寡核苷酸。接下来，将微量移液器固定在微量纵器中，使微量移液器与桌面成 50 度角。

将注射压力设置为 20 PSI 并校准微量移液器，每个脉冲注射 30 升。在准备电穿孔时，通过孵育 5 分钟来麻醉第 28 期异种幼虫。在电穿孔培养基中，即含有 0.1% 苯佐卡因的普通两栖动物培养基，将麻醉的蝌蚪转移到电穿孔室中。

其中充满了电穿孔介质。该过程最棘手的部分是将微型宠物插入蝌蚪中。因此，为了确保成功，您必须非常紧密地固定胚胎，然后在显微注射后快速施加电流。

将胚胎放置在长孔中，使头部位于 T 连接处。背侧朝下，腹侧露出，与尾巴相比，头部应使用镊子略微抬高，轻轻地将蝌蚪固定在井中，周围有石膏场景。固定蝌蚪以防止其在电穿孔过程中抽搐非常重要，这可能会对面部组织造成严重损伤。

要开始此过程，请将微量移液器吸头插入水泥腺后方并插入面部 mechy。将 30 纳升溶液注入间充质中，缩回微量移液器。快速将电极尖端平行于胚胎头部对齐，并施加 8 个 50 毫秒 20 毫伏方形脉冲。

然后使用镊子缩回电极。小心地将蝌蚪从井中释放出来。然后用移液管将蝌蚪以 0.025 毫克/毫升的浓度转移至四分之三 nom。

庆大霉素蝌蚪可以在该培养基中孵育过夜或在 24 小时后孵育更长时间。通过荧光显微镜筛选蝌蚪以进行高效电穿孔。使用荧光分子可以轻松筛选电穿孔胚胎。

该图显示了电穿孔后 1248 小时和 96 小时左右的典型形态寡核苷酸电穿孔蝌蚪批次。分别在第 30、34 和 44 阶段。荧光形态寡核苷酸可以在第 30 和 34 阶段的颅面部中可见。

在第 44 阶段，可以在白色箭头指示的软骨中检测到荧光。高度自发荧光的区域是肠道。按照此程序，我们可以追踪电细胞的谱系以及目标蛋白质的分子需求。

这种方法可以与实时成像技术相结合，以研究颅面发育过程中基因功能随时间的变化。