Name: 实验小鼠模型阴道接种和样品采集的协议念珠菌阴道炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学习使用实验小鼠模型研究阴道念珠菌感染的方法，通过阴道接种、灌洗和淋巴结取样技术定量真菌负荷。该方案适用于免疫学和微生物学研究。

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本研究工作由R01 AI32556（美国国立卫生研究院下属国家过敏与传染病研究所）资助。部分研究工作还得到了路易斯安那州疫苗中心以及由路易斯安那州校董会资助的南路易斯安那传染病研究研究所的支持。

1. 阴道接种 白色念珠菌
<ol>
	<li>接种前3天，将动物固定以暴露腹部，在下腹部皮下注射100 μl含有0.1–0.5 mg β-雌二醇的芝麻油。进针时应位于皮肤侧方约5至10 mm处，以尽量减少注射部位的液体渗漏。 
	在此模型中，下腹部皮下给予雌激素效果最佳，因其靠近生殖道。有效剂量可能因小鼠品系、年龄或雌激素衍生物的不同而有所差异。既往研究中，使用6–8周龄的CBA-J (H-2κ)、C3H/HeN (H-2κ)、C57BL/6 (H-2b)、Balb/c (H-2d)、DBA/2 (H-2d) 和 SJL (H-2s) 小鼠时，0.1 mg/100 μl剂量已被证实有效，表现为阴道壁增厚、阴道黏液减少以及上皮细胞脱落增加。使用该浓度雌激素处理的小鼠可实现稳定的阴道Candida定植。对于其他品系或年龄的小鼠接种，建议先进行预实验，以确认在此修改条件下雌激素的有效性，并在必要时增加雌激素剂量。 
	雌激素溶液应于注射当天每次新鲜配制。为确保雌激素在芝麻油中完全溶解，需使用涡旋振荡器充分混匀，并间歇性地在37°C下加热。在整个研究期间，应每周重复注射一次。</li>
	<li>制备接种物时，从沙氏葡萄糖琼脂（SDA）平板上近期传代培养的C. albicans中挑取一环芽生孢子，接种至10 ml含0.1%葡萄糖的植物蛋白胨培养液中。将培养液置于25°C摇床水浴中孵育18小时至进入稳定生长期。</li>
	<li>孵育结束后，将培养液转移至15 ml锥形离心管中，以800 × g离心5分钟。用无菌PBS洗涤沉淀物两次。</li>
	<li>采用台盼蓝染料排斥法在血细胞计数板上计数活芽生孢子。用无菌PBS将细胞浓度调整至2.5 × 106/ml（或按所需接种浓度调整）。</li>
	<li>固定小鼠时，用两指夹住尾根部并将臀部抬起，使阴道口朝向操作者（图1A）。理想情况下，将小鼠置于平坦的网格表面（如笼盖）上，以便小鼠在尾部固定时能提供一定的对抗阻力。</li>
	<li>用移液器吸取20 μl（或不超过20 μl的所需体积）接种悬液，将移液器枪头插入阴道腔约5 mm深度（图1B）。此步骤应尽快且轻柔地完成，以尽量减少对小鼠造成的应激。</li>
</ol>
2. 阴道灌洗
<ol>
	<li>安乐死（或麻醉）后，用两根手指捏住小鼠尾根部，使其朝下，暴露阴道开口。</li>
	<li>用移液器枪头反复吸入和吹打100 μl无菌PBS，冲洗阴道腔。移液器枪头可能被细胞堵塞；若发生此情况，可先排出堵塞的细胞，再用阴道内剩余的PBS继续冲洗。将冲洗液收集至微量离心管中。</li>
	<li>也可对接受异氟烷吸入麻醉的小鼠进行阴道冲洗。操作时，将小鼠暴露于气化的异氟烷中，直至完全镇静（约30秒）。捏住小鼠尾根部使其朝下，用50 μl无菌PBS轻柔冲洗阴道腔。操作过程中应避免使用移液器枪头剧烈吹打，以尽量减少对阴道的损伤。镇静后的小鼠在暴露于常温空气30秒内应可恢复意识。
	 异氟烷可通过异氟烷挥发器与O2（推荐）进行气化，也可使用不带挥发器系统的标准滴入式密闭麻醉舱（需在镇静期间密切监测动物，以防呼吸窘迫）。
	 对同一只小鼠进行纵向多次取样时，应优先选择麻醉状态下采集阴道冲洗液的方法。连续冲洗不会影响随时间推移对真菌负荷的评估41。</li>
	<li>制备湿片时，取10 μl冲洗液滴加于载玻片上，于光学显微镜下以400–1000×放大倍数观察。此外，也可对冲洗液中的细胞组分进行染色，以观察细胞及细胞核形态。制备涂片时，取10 μl冲洗液滴加于载玻片上，用移液器枪头外壁轻轻涂布。使用CytoPrep固定剂固定涂片样本，并采用标准巴氏染色法（Pap smear）染色，于光学显微镜下以400 ×放大倍数观察。</li>
</ol>
3. 阴道真菌负荷的定量分析
<ol>
	<li>在96孔圆底板中，将灌洗液转移至顶部一行的某一孔中，并在该列接下来的5个孔中各加入180 μl无菌PBS（沿板向下）。</li>
	<li>通过将20 μl液体转移至该列的下一孔，对阴道灌洗液进行1:10连续稀释。每次转移前需反复吹打充分混匀。可使用12通道移液器同时对最多12个灌洗样本（一整行）进行连续稀释。</li>
	<li>从最低稀释度开始，将10 μl样本接种至沙保葡萄糖琼脂（SDA）平板上。使用带网格的方形培养皿制备的SDA平板，并配合可调间距多通道移液器，可在一块平板上接种最多36个样本。</li>
	<li>在34°C培养48小时后，计数菌落形成单位（CFUs）。</li>
</ol>
4. 阴道组织提取
<ol>
	<li>完成阴道灌洗操作后，将安乐死的小鼠仰卧放置，并用70%乙醇充分浸润腹股沟区域。使用一对镊子将尿道口向上提起，使阴道开口暴露。</li>
	<li>将一对弯镊插入阴道腔内并定位宫颈。在牢固夹持的同时，通过阴道腔将宫颈拉出（图2A-C）。</li>
	<li>在阴道开口基底部切除阴道，然后用手术剪将宫颈从阴道组织上分离。需注意，阴道组织处于内翻状态（即阴道的内侧上皮向外暴露）。该组织可选择横向翻转以维持阴道原有的解剖方向，或通过侧向切开展平为片状。
	 切除的阴道组织可用于：1）经胶原酶消化后提取淋巴细胞（约每只小鼠1×104个细胞）40；2）经dispase消化后分离上皮细胞（约每只小鼠5×104个细胞）28；3）冷冻或石蜡包埋制备，用于组织学分析25。</li>
</ol>
5. 腰部淋巴结切除术
<ol>
	<li>完成阴道灌洗操作后，将已处死的小鼠仰卧放置，并用70%乙醇充分浸润腹部。从下腹部开始向胸部做一侧切口，暴露内脏器官。双手各持一把镊子，将肠道向上移动，使中央血管清晰可见。</li>
	<li>定位下腔静脉和腹主动脉。通常，一对腰淋巴结位于腹主动脉旁，位置大约在肾动脉与髂总动脉起始点之间的中点处39。这些淋巴结可通过其弹性质地与脂肪组织区分，颜色较浅且更不透明（图3）。与未接种动物相比，感染动物的这些淋巴结明显更大。</li>
	<li>用显微镊置于淋巴结下方，轻轻上提，将其从周围组织中分离并切除。</li>
</ol>
6. 单细胞悬液中淋巴细胞的分离
<ol>
	<li>将淋巴结转移至无菌玻璃培养皿内一个无菌金属网筛（大小约为 3 x 3 cm2）上，培养皿中预先加入约 10 ml 的 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）（图 4）。</li>
	<li>将培养皿略微倾斜，用注射器活塞头按压淋巴结，确保将所有淋巴结充分破碎，使淋巴结内的细胞成分通过网筛，而淋巴结的非细胞成分（即膜组织、基质、脂肪）则留在网筛上。</li>
	<li>使用同一注射器和活塞头，吸取含有细胞的 HBSS 液体。再用约 5 ml HBSS 冲洗网筛，并将冲洗液全部收集至 15 ml 的锥形离心管中。</li>
	<li>以 800 × g 离心 10 分钟。弃上清前，先用移液器吸除液面上层的脂肪沉积物。用 HBSS 将细胞沉淀洗涤三次，最后将沉淀重悬于 1 ml HBSS 中，通过台盼蓝染色排除法计数活细胞数量。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
接种4天以上的雌性小鼠阴道灌洗液的细胞组分通常包含&gt;4天的Candida、上皮细胞以及细胞浸润（图5）。通过湿片显微镜检查，可根据菌丝和酵母细胞的存在直观识别Candida（图5A）。阴道灌洗液涂片可采用巴氏染色法染色，以观察上皮细胞和浸润的白细胞，其中主要为具有三叶核的中性粒细胞（图5B）。在未接种小鼠中几乎检测不到中性粒细胞，或仅有极少量（图5C）41。
图6展示了阴道真菌负荷的一个示例。在特定时间点采集的阴道灌洗液用于CFU计数培养（图6A）。在接受雌激素处理的接种小鼠中，Candida在阴道的定植/感染可持续数周（图6B），而在未接受雌激素处理的接种小鼠中，Candida无法建立阴道定植（图6C）。在整个观察期间，接受雌激素处理但未接种的小鼠始终未检出Candida（数据未显示）。此外，阴道灌洗可在每个时间点对不同的小鼠进行单次操作，也可在同一批麻醉状态下的小鼠中进行纵向连续采样。
腰淋巴结是生殖道的主要引流淋巴结，也是评估阴道攻毒后全身免疫反应最相关的部位。需要注意的是，接种小鼠的这些淋巴结可能会增大，而在未接种小鼠中通常体积较小。白细胞回收数量通常在未接种小鼠中为 8 × 105/只，接种小鼠中为 5 × 106/只。除腰淋巴结外，腹股沟淋巴结、腘窝淋巴结和肠系膜淋巴结也可使用。
<img alt="小鼠固定与注射、实验技术、样本处理、兽医操作。" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 图1. 阴道接种 Candida。A) 用于接种的小鼠固定方式。将小鼠置于金属网笼插板上，用手握住其尾根部，略微向上提起，使后肢抬起并暴露阴道开口。当小鼠试图抵抗尾部固定时，可用同一只手稳定其臀部。B) 将接种物导入阴道腔。将移液器吸头轻柔插入阴道腔约5 mm深度，随后注入悬浮接种物。
<img alt="小鼠解剖过程；科学实验中的组织提取顺序" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 图 2. 阴道组织提取。A-B) 宫颈的提取。使用弯头镊子定位宫颈，并通过阴道腔将其向外暴露。一旦宫颈移出阴道腔，进一步将其向外牵拉，以充分暴露阴道。C) 阴道的提取。使用剪刀从外阴处剪下阴道组织。分离后，将宫颈从阴道上移除。
<img alt="显示哺乳动物腹腔内腰淋巴结的解剖图，解剖学研究。" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 图3. 腰淋巴结的识别。图中指示了腰淋巴结在骨盆附近周围器官/血管中的位置。A，腹主动脉。B，膀胱。C，髂总动脉。I，肠道。L，肝脏。R，直肠。S，脾脏。U，子宫。
<img alt="细胞培养染色实验，培养皿设置，组织学样本制备过程。" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 4"> 图 4. 将腰淋巴结置于金属网筛上。将淋巴结收集至放置于培养皿中的筛网上，并加入HBSS。用注射器活塞在筛网上按压淋巴结，以获得单细胞悬液形式的淋巴细胞。
<img alt="细胞形态比较；显微镜图像；接种组与未接种组；标注的细胞结构。" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 5"> 图 5. 接种小鼠阴道灌洗液的细胞组分。A) 湿片法和 B) 巴氏染色法制备的接种后第 4 天采集的阴道灌洗样本，以及 C) 未接种小鼠的样本。图像放大倍数分别为 1000× (A) 或 400× (B, C)。B 图插图为 1000× 下阴道中性粒细胞的核形态。Candida 酵母菌 (Y) 和菌丝 (H)、上皮细胞 (EC) 及中性粒细胞 (N) 已标示。
<img alt="阴道真菌负荷研究：稀释系列、雌激素影响、CFU分析、点印迹、图表。" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig6.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图6"> 图6. 阴道真菌负荷的检测。A) 在SDA平板上培养的典型白色念珠菌（C. albicans）菌落。来自六只不同接种小鼠的原始（N）灌洗样本（第一行）经系列稀释后进行培养，用于CFU计数。B) 雌激素处理小鼠和 C) 未接受雌激素处理小鼠的阴道真菌负荷定量。在指定时间点测定接种小鼠灌洗液中每100 μl的CFU数量。

<ol><li>Abraham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+immunity+to+Trichomonas+vaginalis+in+a+mouse+model+of+vaginal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Inducible immunity to Trichomonas vaginalis in a mouse model of vaginal infection.</a> Infect. Immun. 64, 3571-3571 (1996).</li>
<li>Black, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+haplotype+does+not+impact+the+course+of+experimentally+induced+murine+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility haplotype does not impact the course of experimentally induced murine vaginal candidiasis.</a> Lab. Anim. Sci. 49 (6), 668-668 (1999).</li>
<li>Black, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+neutropenia+decreases+inflammation+associated+with+murine+vaginal+candidiasis+but+has+no+effect+on+the+course+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Inf.+Immun%22%5BJournal%5D)">Acute neutropenia decreases inflammation associated with murine vaginal candidiasis but has no effect on the course of infection.</a> Inf. Immun. 66, 1273-1273 (1998).</li>
<li>Black, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+severity+of+Candida+vaginitis+in+BALB%2Fc+nu%2Fnu+mice+versus+the+parent+strain+is+not+abrogated+by+adoptive+transfer+of+T+cell+enriched+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increased severity of Candida vaginitis in BALB/c nu/nu mice versus the parent strain is not abrogated by adoptive transfer of T cell enriched lymphocytes.</a> J. Reprod. Immunol. 45, 1-1 (1999).</li>
<li>Buchannan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stromal+and+epithelial+estrogen+receptors+in+vaginal+epithelial+proliferation%2C+stratification%2C+and+cornification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Role of stromal and epithelial estrogen receptors in vaginal epithelial proliferation, stratification, and cornification.</a> Endocrinology. 139 (10), 4345-4345 (1998).</li>
<li>Clemons, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+susceptibility+of+mice+to+Candida+albicans+vaginitis+correlates+with+host+estrogen+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic susceptibility of mice to Candida albicans vaginitis correlates with host estrogen sensitivity.</a> Infect. Immun. 72, 4878-4878 (2004).</li>
<li>Conrady, C. D., Halford, W. P., Carr, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+type+I+interferon+pathway+increases+vulnerability+of+mice+to+genital+Herpes+simplex+virus+2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Loss of the type I interferon pathway increases vulnerability of mice to genital Herpes simplex virus 2 infection.</a> J. Virol. 85 (4), 1625-1625 (2011).</li>
<li>Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+estromal-epithelial+interaction+in+hormonal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Role of estromal-epithelial interaction in hormonal responses.</a> Arch Histol Cytol. 67 (5), 417-417 (2004).</li>
<li>Enjalbert, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional%2C+synthetic+Caussia+princeps+luciferase+reporter+for+live+imaging+of+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A multifunctional, synthetic Caussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections.</a> 77 (11), 4847-4847 (2009).</li>
<li>Feinen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Th17+responses+in+a+murine+model+of+Neisseria+gonorrhoeae+genital+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Critical role of Th17 responses in a murine model of Neisseria gonorrhoeae genital infection.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 312-312 (2010).</li>
<li>Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protective+host+defenses+against+oral+and+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Distinct protective host defenses against oral and vaginal candidiasis.</a> Med. Mycol. 40, 359-359 (2002).</li>
<li>Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravaginal+live+Candida+challenge+in+humans+leads+to+new+hypotheses+for+the+immunopathogenesis+of+vulvovaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 72, 2939-2939 (2004).</li>
<li>Fidel, P. L., Cutright, J. L., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+D0870+treatment+of+experimental+Candida+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Efficacy of D0870 treatment of experimental Candida vaginitis.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 41, 1455-1455 (1997).</li>
<li>Fidel, P. L., Cutright, J. L., Steele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Reproductive+hormones+on+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Effects of Reproductive hormones on experimental vaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 68, 651-651 (2000).</li>
<li>Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+Candida+glabrata+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inf.+Dis%22%5BJournal%5D)">A murine model of Candida glabrata vaginitis.</a> J. Inf. Dis. 173, 425-425 (1996).</li>
<li>Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+vaginal+cell+populations+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Inf.+Immun%22%5BJournal%5D)">Analysis of vaginal cell populations during experimental vaginal candidiasis.</a> Inf. Immun. 67, 3135-3135 (1999).</li>
<li>Fidel, P. L., Lynch, M. E., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida-specific+cell-mediated+immunity+is+demonstrable+in+mice+with+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida-specific cell-mediated immunity is demonstrable in mice with experimental vaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 61, 1990-1990 (1993).</li>
<li>Fidel, P. L., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathogenesis+of+recurrent+vulvovaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev.+9%22%5BJournal%5D)">Immunopathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 9. 9, 335-335 (1996).</li>
<li>Fidel, P. L., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFidel%2C+PL+%22Murine+Models+of+Candida+Vaginal+Infections%2C+In+Experimental+models+in+antimicrobial+chemotherapy%22">Murine Models of Candida Vaginal Infections, In Experimental models in antimicrobial chemotherapy</a>. Zak, O., Sande, M. , 2nd ed, Academic Press Ltd. London, UK. 741-748 (1999).</li>
<li>Fidel, P. L., Vazquez, J. A., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata%3A+Review+of+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+and+clinical+disease+with+comparison+to+C.+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata: Review of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C. albicans.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12, 80-80 (1999).</li>
<li>Fulurija, A., Ashman, R. B., Papadimitriou, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+depletion+increases+susceptibility+to+systemic+and+vaginal+candidiasis+in+mice%2C+and+reveals+differences+between+brain+and+kidney+in+mechanisms+of+host+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil depletion increases susceptibility to systemic and vaginal candidiasis in mice, and reveals differences between brain and kidney in mechanisms of host resistance.</a> Microbiology. 142, 3487-3487 (1996).</li>
<li>Gill, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269 (1), 29-29 (2011).</li>
<li>Hamad, M., Abu-Elteen, K. H., Ghaleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-dependent+induction+of+persistent+vaginal+candidosis+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Estrogen-dependent induction of persistent vaginal candidosis in naive mice.</a> Cell. Immunol. 47 (7), 304-304 (2004).</li>
<li>Hamad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+the+oestrogen-dependent+vaginal+candidosis+murine+model+in+evaluating+the+efficacy+of+various+therapies+against+vaginal+Candida+albicans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Utility of the oestrogen-dependent vaginal candidosis murine model in evaluating the efficacy of various therapies against vaginal Candida albicans infection.</a> Mycoses. 49 (2), 104-104 (2006).</li>
<li>LeBlanc, D. M., Barousse, M. M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dendritic+cells+in+immunoregulation+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 74, 3213-3213 (2006).</li>
<li>McGrory, T., Garber, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intravaginal+infection+with+Trichomonas+vaginalis+and+role+of+Lactobacillus+acidophilus+in+sustaining+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Mouse intravaginal infection with Trichomonas vaginalis and role of Lactobacillus acidophilus in sustaining infection.</a> Infect. Immun. 60, 2375-2379 (1992).</li>
<li>Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+mucosal+Candida+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS.+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Animal models of mucosal Candida infection.</a> FEMS. Microbiol. Lett. 283 (2), 129-129 (2008).</li>
<li>Nomanbhoy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+and+oral+epithelial+cell+anti-Candida+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Inf.+Immun%22%5BJournal%5D)">Vaginal and oral epithelial cell anti-Candida activity.</a> Inf. Immun. 70, 7081-7081 (2002).</li>
<li>Pietrella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta-glucan-conjugate+vaccine+and+anti-beta-glucan+antibodies+are+effective+against+murine+vaginal+candidiasis+as+assessed+by+a+novel+in+vivo+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A beta-glucan-conjugate vaccine and anti-beta-glucan antibodies are effective against murine vaginal candidiasis as assessed by a novel in vivo imaging technique.</a> Vaccine. 28 (7), 1717-1717 (2010).</li>
<li>Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+Lactobacilli+in+the+control+and+maintenance+of+the+vaginal+bacterial+microflora%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora.</a> Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).</li>
<li>Saavedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+production+of+chemokines+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Inf.+Immun%22%5BJournal%5D)">Local production of chemokines during experimental vaginal candidiasis.</a> Inf. Immun. 67, 5820-5820 (1999).</li>
<li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+epidemiology+of+vulvovaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).</li>
<li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+vulvovaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis.</a> Clin. Infect. Dis. 14, Suppl 1. S148-S153 (1992).</li>
<li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vulvovaginal+candidiasis%3A+Epidemiologic%2C+diagnostic%2C+and+therapeutic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 178 (2), 203-203 (1998).</li>
<li>Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+humoral+immune+responses+against+primary+and+repeat+Neisseria+gonorrhoeae+genital+tract+infections+of+17%CE%B2-estradiol-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Local and humoral immune responses against primary and repeat Neisseria gonorrhoeae genital tract infections of 17β-estradiol-treated mice.</a> Vaccine. 26, 5741-5741 (2008).</li>
<li>Taylor, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+virulence+of+Candida+albicans+isolates+causing+mucosal+infections+in+people+infected+with+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus.</a> J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).</li>
<li>Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Th1%2FTh2+cytokine+production+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis.</a> Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).</li>
<li>Tirabassi, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mucosal+vaccination+approach+for+herpes+simplex+virus+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type 2.</a> Vaccine. 29 (5), 1090-1090 (2011).</li>
<li>Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+descriptive+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: descriptive and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J. Immunol. Methods. 312 (1-2), 12-12 (2006).</li>
<li>Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+and+lymphocyte+activation+marker+expression+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis.</a> J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).</li>
<li>Yano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

一种实验性小鼠模型 假丝酵母 阴道炎模型已在过去几十年中建立并用于研究黏膜宿主对病原体的免疫应答 假丝酵母 以及用于测试抗真菌疗法3,4,11,13,16,17,19,21,24,25,37. 此处介绍的方案采用了高效且劳动强度较低的方法，似乎是目前最优化的模型系统之一 假丝酵母 迄今为止所描述的阴道炎。这些技术能够快速定量真菌负荷并采集阴道样本。此外，先前的研究对多种单倍型小鼠品系（n=13）在接种后不同时间点进行检测，结果显示在真菌负荷及宿主对阴道定植的反应方面具有相似程度的变异性。 假丝酵母2,6,41因此，该模型可不受小鼠品系或感染时间限制地整合到现有实验方案中。然而，需注意的是，即使接种相同剂量的真菌，不同动物间的阴道真菌载量仍可能存在较大差异（图6B）。有证据表明，这种差异源于真菌在阴道上皮早期黏附程度的不同。41因此，出于统计学考虑，建议每组使用7-10只小鼠。
不同菌株之间阴道真菌载量的差异也已有证据表明 C. albi...

<table><tbody><tr><td>雌性 CBA/J 小鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td>01C38</td><td>5–6 周龄</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt; (3153A)</td><td>英国病原真菌国家保藏中心</td><td>NCPF3153</td><td></td></tr><tr><td>芝麻油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547</td><td>D&amp;#8211;s 使用前无需预先灭菌</td></tr><tr><td>&amp;#914;-雌二醇-17-戊酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1631</td><td>芝麻油中浓度为 0.1–0.5 mg</td></tr><tr><td>植物蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211906</td><td>添加 0.1% 葡萄糖作为补充</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>沙保葡萄糖琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>中性蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>1.7 U/mL</td></tr><tr><td>金属网筛</td><td>TWP</td><td>060X060S0065W36T</td><td>60 目，不锈钢</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>CytoPrep 固定液</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-570-10</td><td>用于保存涂片</td></tr><tr><td>巴氏染色液 EA-65</td><td>EMD Millipore</td><td>7054X-85</td><td></td></tr><tr><td>巴氏染色液 OG-6</td><td>EMD Millipore</td><td>7052X-85</td><td></td></tr><tr><td>Harris&amp;rsquo; 苏木精铝染液</td><td>EMD Millipore</td><td>638A-85</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>需配合异氟烷挥发器或密闭式滴加麻醉装置使用</td></tr></tbody></table>

白色念珠菌阴道炎实验小鼠模型中阴道接种与样本采集的实验方案

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

外阴阴道念珠菌病（VVC）是由念珠菌属（Candida）引起的一种女性下生殖道真菌感染，在生育年龄的健康女性中约有75%曾受其影响18,32-34。易感因素包括使用抗生素、血糖控制不佳的糖尿病，以及因妊娠、口服避孕药或激素替代治疗导致的生殖激素水平变化33,34。复发性外阴阴道念珠菌病（RVVC）定义为每年发作三次或以上，影响约5%至8%无明显易感因素的女性33。
一种阴道念珠菌病（VVC）的小鼠实验模型已被建立，用于研究其发病机制及黏膜宿主免疫应答 假丝酵母3,4,11,16,17,19,21,25,37该模型还被用于测试潜在的抗真菌疗法 体内13,24. 该模型要求将动物维持在假性动情期状态以达到最佳效果 假丝酵母 定植/感染6,14,23在这些条件下，接种的动物将可检测到持续数周至数月的阴道真菌负荷。以往研究表明，该动物模型在免疫学和生理学特性方面与人类感染具有极高的相似性。3,16,21。然而，差异包括缺乏 假丝酵母 作为小鼠正常的阴道菌群和中性阴道pH。
本文展示了一系列小鼠阴道炎模型中的关键方法，包括阴道接种、阴道样本的快速采集、阴道真菌负荷的评估，以及用于细胞提取/分离的组织制备。随后提供了阴道灌洗液成分、真菌负荷以及引流淋巴结白细胞收获量的代表性结果。通过使用麻醉剂，可在同一只小鼠上于多个时间点采集灌洗样本，从而实现对感染/定植过程的纵向评估。此外，该模型无需使用免疫抑制剂即可建立感染，从而可在明确的宿主条件下开展免疫学研究。最后，本模型及其中介绍的每种技术有望被用于研究女性下生殖道的其他感染性疾病（如细菌性、寄生虫性和病毒性感染）及其相应的局部或全身性宿主防御机制。

本文描述了在实验动物模型中评估Candida性阴道炎的关键技术。这些方法可实现阴道标本及引流腰淋巴结中淋巴细胞的快速采集。这些技术有望用于建立其他女性下生殖道疾病的鼠类模型。

外阴阴道念珠菌病（VVC）是由念珠菌属真菌引起的下生殖道感染，影响约75%的女性……

本实验的总体目标是展示利用阴道念珠菌病实验动物模型过程中涉及的具体操作问题，以定量评估阴道真菌负荷，并利用阴道或淋巴组织细胞进行特定检测，如免疫学和组织学检测。首先，将在经雌激素处理的小鼠上示范阴道接种技术，以实现上述目标。随后，在处死小鼠后，将进行阴道灌洗以回收念珠菌。然后将提取阴道组织和/或阴道引流淋巴结。灌洗液可通过显微镜观察，以显示与阴道上皮细胞相关的念珠菌，或接种于琼脂平板以定量阴道真菌负荷。细胞组分的涂片也可用于对上皮细胞和淋巴样细胞进行染色。因此，演示该技术的主要优势在于，使阴道炎动物模型的使用者能够以最高效、最有效的方式进行操作。该技术所要回答的关键问题涉及阴道炎及生态学领域，包括宿主免疫反应、细胞分布、药物疗效、免疫治疗效果，以及免疫接种的影响和该技术本身的演示。今天在我实验室进行操作的将是一名研究生 Junco Yano，她将在给予小鼠β-雌二醇注射三天后，用白色念珠菌（C. albicans）感染小鼠。首先将小鼠置于平坦的红色表面以使其抓握稳定。然后用两根手指捏住尾巴根部，向上提起臀部，使阴道开口朝向操作者。将移液器吸头插入阴道腔约五毫米深处，并吸取最多20微升的接种液悬液。为尽量减少小鼠的不适，应尽快且轻柔地完成此步骤。在完成所需的孵育时间后，根据您所在机构的规程实施安乐死。然后用两根手指捏住小鼠尾根部，将其倒置，使阴道开口暴露，便于使用移液器操作。向阴道腔内加入 100 微升无菌 PBS，反复吹打并震荡，进行灌洗。若移液器吸头被细胞堵塞，可将堵塞的细胞排出后，继续用剩余的 PBS 进行灌洗。将灌洗液收集至微量离心管中。完成阴道灌洗操作后，将小鼠仰卧放置，并用70%乙醇充分浸润腹股沟区域。使用一对镊子将尿道口向上提起，使阴道开口暴露。将一对弯镊插入阴道腔内，在保持镊子牢固夹持的同时，定位子宫颈。将宫颈经阴道腔取出，在阴道开口基底部切除阴道，然后用手术剪将宫颈从阴道上分离。由于阴道组织呈内陷状，可将其翻转以保持原有方位，或在动物仰卧位时做一侧切口将阴道展开成片状，以便进行腹膜后淋巴结切除。用70%乙醇浸润腹部。用双手持镊子从下腹部向胸部做一横向切口，暴露内脏器官。将肠管向上推移，使中央血管清晰可见。找到下腔静脉和腹主动脉。可在腹主动脉旁约位于肾动脉与髂总动脉起始处中点的位置识别出一对腰淋巴结。这些淋巴结因其弹性质地而可与脂肪组织在视觉上区分开来，其颜色较脂肪组织更浅且不透明。在感染动物中，这些淋巴结明显大于未接种动物。用微型镊子置于淋巴结下方，轻轻上提以将其从周围组织中分离，从而切除淋巴结。切除组织后，将淋巴结转移至置于无菌玻璃培养皿中的无菌金属网筛上，该培养皿内含有约10毫升的Hank's平衡盐溶液。如需分离淋巴样细胞，请参阅书面实验方案。接种至少四天后的小鼠阴道灌洗液的细胞组分通常包括念珠菌上皮细胞和细胞浸润，此处通过湿片显微镜检查显示。念珠菌可通过PHA的存在以及酵母形态进行鉴定。此处对阴道灌洗液的涂片标本进行了染色。采用巴氏涂片技术检查上皮细胞及浸润的白细胞，其中主要细胞为中性粒细胞，可通过其透明的分叶核进行识别。在未接种的小鼠中，几乎检测不到中性粒细胞。该图显示了阴道真菌负荷的一个示例。在特定时间点收集阴道灌洗液，并进行菌落形成单位（CFU）计数培养。在此示例中，于接种后第5天收集灌洗液，经连续稀释后涂布平板，并在37°C培养48小时。随后计数菌落，并计算阴道真菌负荷量。在经雌激素处理的接种小鼠中，念珠菌的阴道定植或感染可持续数周。尽管在未接受雌激素处理的接种小鼠中，念珠菌无法建立阴道定植，但在接受雌激素处理的未接种小鼠中，整个观察期间始终未检测到念珠菌。此外，阴道灌洗可在不同时间点对不同的小鼠进行单次操作，也可在同一只小鼠身上在麻醉条件下进行纵向连续操作。在进行该操作时，重要的是务必牢固固定动物，以避免对阴道造成损伤；同时请确保充分完成灌洗过程，以便在提取阴道组织时获得准确的阴道真菌负荷量。使用静置的 PBS 以防止组织脱水，在去除淋巴结及处理淋巴结细胞时请注意避免损伤主要的静脉和动脉，同时将细胞置于冰上或 4°C 环境中以维持细胞活性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用小鼠阴道念珠菌病实验模型，可重复地定量阴道真菌负荷，并切除阴道或淋巴组织，用于特定的免疫学或组织学检测。

protocols-for-vaginal-inoculation-sample-collection-experimental

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

实验小鼠模型阴道接种和样品采集的协议念珠菌阴道炎

来源：Morrill, S. R., et al. 厌氧培养细菌建立小鼠阴道定植模型。J. Vis. Exp.

建立小鼠阴道厌氧菌定植模型

来源：O'Brien, V.P. 等 复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 Gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术 J. Vis. Exp. (2020)本视频演示了制备一种 Gardnerella vaginalis...

制备用于建立小鼠复发性尿路感染模型的Gardnerella vaginalis接种物

来源： 帕特拉斯，K. A.，多兰，K. S. 一种B族链球菌感染的小鼠模型 链球菌 阴道定植 视频实验杂志 (2016)本视频展示了经激素处理的雌性小鼠的准备及其阴道接种B族链球菌的过程 链球菌...

建立阴道B族链球菌小鼠模型 链球菌 感染

本视频展示了通过经尿道导管灌注在雌性小鼠膀胱中建立尿路致病性Escherichia...

建立雌性小鼠尿路感染模型

本视频展示了以下内容的开发过程 体内 用于研究生物膜形成的鼠类模型 白色念珠菌 在皮下组织中。该实验涉及植入...

Candida albicans 在小鼠体内的生物膜形成模型

尽管已有用于研究宿主免疫抗性的 Candida 感染模型，但目前尚缺乏用于研究在 Candida...

免疫缺陷小鼠口咽念珠菌病的Th17炎症模型

本实验方案的目的是模拟人类B组 链球菌属...

一种B族链球菌的小鼠模型 链球菌 阴道定植

本文介绍了一种使用独特设计的加热/固定装置进行啮齿类动物尾静脉注射的有效且高效的方法。通过简化血管扩张的启动过程和固定操作，该方案可对大量动物进行准确及时的静脉注射，同时将动物的不适降至最低。...

一种用于小鼠真菌性脓毒症模型尾静脉注射的现代保温/固定装置

本方案介绍了一种利用厌氧培养的人源阴道细菌建立小鼠阴道定植模型的方法。我们主要关注Gardnerella vaginalis ，同时也提供了针对Prevotella bivia和Fusobacterium...

小鼠阴道定植的厌氧培养细菌模型

我们建立了一种与C.albicans相关的导管相关性感染（CRI）小鼠模型，该模型中导管表面可形成生物膜，且C.albicans与宿主之间的相互作用与临床CRI具有良好的相关性。该模型有助于筛选针对C.albicans生物膜相关CRI的治疗方法，为临床转化奠定基础。...

小鼠导管相关性Candida albicans感染模型

建立小鼠阴道上行感染、早产及新生儿发病模型

学习使用实验小鼠模型研究阴道念珠菌感染的方法，通过阴道接种、灌洗和淋巴结取样技术定量真菌负荷。该方案适用于免疫学和微生物学研究。

白色念珠菌阴道炎实验小鼠模型中阴道接种与样本采集的实验方案

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