白色念珠菌阴道炎实验小鼠模型中阴道接种与样本采集的实验方案

本实验的总体目标是展示利用阴道念珠菌病实验动物模型过程中涉及的具体操作问题，以定量评估阴道真菌负荷，并利用阴道或淋巴组织细胞进行特定检测，如免疫学和组织学检测。首先，将在经雌激素处理的小鼠上示范阴道接种技术，以实现上述目标。随后，在处死小鼠后，将进行阴道灌洗以回收念珠菌。

然后将提取阴道组织和/或阴道引流淋巴结。灌洗液可通过显微镜观察，以显示与阴道上皮细胞相关的念珠菌，或接种于琼脂平板以定量阴道真菌负荷。细胞组分的涂片也可用于对上皮细胞和淋巴样细胞进行染色。

因此，演示该技术的主要优势在于，使阴道炎动物模型的使用者能够以最高效、最有效的方式进行操作。该技术所要回答的关键问题涉及阴道炎及生态学领域，包括宿主免疫反应、细胞分布、药物疗效、免疫治疗效果，以及免疫接种的影响和该技术本身的演示。今天在我实验室进行操作的将是一名研究生 Junco Yano，她将在给予小鼠β-雌二醇注射三天后，用白色念珠菌（C. albicans）感染小鼠。

首先将小鼠置于平坦的红色表面以使其抓握稳定。然后用两根手指捏住尾巴根部，向上提起臀部，使阴道开口朝向操作者。将移液器吸头插入阴道腔约五毫米深处，并吸取最多20微升的接种液悬液。

为尽量减少小鼠的不适，应尽快且轻柔地完成此步骤。在完成所需的孵育时间后，根据您所在机构的规程实施安乐死。然后用两根手指捏住小鼠尾根部，将其倒置，使阴道开口暴露，便于使用移液器操作。

向阴道腔内加入 100 微升无菌 PBS，反复吹打并震荡，进行灌洗。若移液器吸头被细胞堵塞，可将堵塞的细胞排出后，继续用剩余的 PBS 进行灌洗。将灌洗液收集至微量离心管中。

完成阴道灌洗操作后，将小鼠仰卧放置，并用70%乙醇充分浸润腹股沟区域。使用一对镊子将尿道口向上提起，使阴道开口暴露。将一对弯镊插入阴道腔内，在保持镊子牢固夹持的同时，定位子宫颈。

将宫颈经阴道腔取出，在阴道开口基底部切除阴道，然后用手术剪将宫颈从阴道上分离。由于阴道组织呈内陷状，可将其翻转以保持原有方位，或在动物仰卧位时做一侧切口将阴道展开成片状，以便进行腹膜后淋巴结切除。用70%乙醇浸润腹部。

用双手持镊子从下腹部向胸部做一横向切口，暴露内脏器官。将肠管向上推移，使中央血管清晰可见。找到下腔静脉和腹主动脉。

可在腹主动脉旁约位于肾动脉与髂总动脉起始处中点的位置识别出一对腰淋巴结。这些淋巴结因其弹性质地而可与脂肪组织在视觉上区分开来，其颜色较脂肪组织更浅且不透明。在感染动物中，这些淋巴结明显大于未接种动物。

用微型镊子置于淋巴结下方，轻轻上提以将其从周围组织中分离，从而切除淋巴结。切除组织后，将淋巴结转移至置于无菌玻璃培养皿中的无菌金属网筛上，该培养皿内含有约10毫升的Hank's平衡盐溶液。如需分离淋巴样细胞，请参阅书面实验方案。

接种至少四天后的小鼠阴道灌洗液的细胞组分通常包括念珠菌上皮细胞和细胞浸润，此处通过湿片显微镜检查显示。念珠菌可通过PHA的存在以及酵母形态进行鉴定。此处对阴道灌洗液的涂片标本进行了染色。

采用巴氏涂片技术检查上皮细胞及浸润的白细胞，其中主要细胞为中性粒细胞，可通过其透明的分叶核进行识别。在未接种的小鼠中，几乎检测不到中性粒细胞。该图显示了阴道真菌负荷的一个示例。

在特定时间点收集阴道灌洗液，并进行菌落形成单位（CFU）计数培养。在此示例中，于接种后第5天收集灌洗液，经连续稀释后涂布平板，并在37°C培养48小时。随后计数菌落，并计算阴道真菌负荷量。在经雌激素处理的接种小鼠中，念珠菌的阴道定植或感染可持续数周。

尽管在未接受雌激素处理的接种小鼠中，念珠菌无法建立阴道定植，但在接受雌激素处理的未接种小鼠中，整个观察期间始终未检测到念珠菌。此外，阴道灌洗可在不同时间点对不同的小鼠进行单次操作，也可在同一只小鼠身上在麻醉条件下进行纵向连续操作。在进行该操作时，重要的是务必牢固固定动物，以避免对阴道造成损伤；同时请确保充分完成灌洗过程，以便在提取阴道组织时获得准确的阴道真菌负荷量。

使用静置的 PBS 以防止组织脱水，在去除淋巴结及处理淋巴结细胞时请注意避免损伤主要的静脉和动脉，同时将细胞置于冰上或 4°C 环境中以维持细胞活性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用小鼠阴道念珠菌病实验模型，可重复地定量阴道真菌负荷，并切除阴道或淋巴组织，用于特定的免疫学或组织学检测。