Name: 使用油脂全线Bicelle方法的膜蛋白的高通量结晶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学习使用脂质双分子层胶束技术进行膜蛋白高通量结晶的方法。本视频演示如何将纯化膜蛋白整合到双分子层胶束混合物中，并利用纳升级机器人进行结晶筛选，最终通过标准光学显微镜观察晶体形成。该方法可利用实验室常规设备实现高效筛选。

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我们感谢 James Bowie 博士和 Salem Faham 博士在双层磁盘法方面提供的专业技术与指导，感谢 Aviv Paz 博士富有启发性的讨论。我们感谢 Le Du 提供的实验支持。Rachna Ujwal 对 MemX Biosciences LLC 拥有财务利益，但该公司未资助本项工作。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（RO1 GM078844）的支持。

基于bicelle的结晶包含四个基本步骤（图2）：i）制备形成bicelle的脂质：两亲性分子混合物；ii）将纯化的蛋白质掺入bicelle介质中；iii）结晶试验（手动或机器人操作）；以及iv）结晶的观察、取出和冷冻。以下将详细描述这些步骤
1. 双层磁性脂质体的制备
双亲分子膜（Bicelles）可在多种脂质：两亲分子组合及广泛浓度范围内形成。因此，建议根据先前成功的实验条件确定初始配比（表1）。其中最成功的混合体系为DMPC:CHAPSO双亲分子膜配方，该配方可直接购买商用预混即用型制剂（见下文试剂表），也可按所述方法在实验室自行制备。本实验中，我们将制备1 ml 含35% DMPC:CHAPSO、摩尔比为2.8:1的混合液。
<ol>
 <li>称取 0.26 g DMPC（Mr 677.9 g/mol）和 0.09 g CHAPSO（Mr 630.9 g/mol），加入去离子水至终体积为 1.0 ml。
 <ul type="disc">
 <li>双层微粒（bicelle）的浓度可在 10%–40% 之间变化，DMPC:CHAPSO 的摩尔比范围为 2.6–3.0:1（见表 1）。</li>
 <li>注意：双层微粒浓度越高，脂质溶解越困难，导致溶液黏度升高。然而，当蛋白浓度较低时，使用高浓度的双层微粒配方可能更有利。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>获得均匀溶液需要充分溶解脂质，该步骤是双层微粒方法中最耗时的部分。请重复以下步骤，直至 DMPC 完全溶解：
 <ol>
 <li>使用水浴或培养箱将混合物加热至约 40°C，并涡旋震荡约 1 分钟。
 <ul type="disc">
 <li>注意：随着循环次数增加，加热后的混合物会呈现凝胶状，难以进行涡旋震荡。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>将混合物置于冰上冷却，并涡旋震荡数分钟。冷却有助于使溶液液化，从而更易于涡旋。
 <ul type="disc">
 <li>注意：随着操作次数增加，混合物在冷却后可能变得浑浊。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>重复上述步骤（1.2.1 和 1.2.2），直至脂质完全溶解。
 <ul type="disc">
 <li>注意：此过程可能需要数小时。双层微粒的形成可通过 DMPC:CHAPSO 配方相行为的变化来判断。完成后，混合物在室温或更高温度下呈透明凝胶状，在冰上则为黏稠液体。</li>
 </ul>
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>双层微粒混合物现已可直接使用，也可在 -20°C 下长期保存（最长可达 5 年）。由于磷脂头部基团存在水解风险，不建议将双层微粒在室温下长期储存。</li>
</ol>
2. 将蛋白质整合入bicelle
大多数通过bicelle获得的膜蛋白结构是在DMPC:CHAPSO bicelle浓度为2%至8%、蛋白浓度为8至12 mg/ml的条件下结晶的（表1）。如果可能，初步筛选应遵循这些指导原则，额外的浓度可在优化阶段进行筛选。与LCP法相比，将蛋白掺入bicelle的过程较为简单（图3），应在与结晶试验同一天完成。
<ol>
 <li>将 DMPC:CHAPSO 双层胶束混合物在室温下解冻，直至其相变成为透明凝胶。
 <ul type="disc">
 <li>注意：多次冻融不会影响双层胶束的性质。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>将混合物置于冰上使其液化，并短暂涡旋以重新形成均匀的双层胶束相。当置于冰上时，混合物可能变得浑浊。</li>
 <li>此后，始终将双层胶束混合物和纯化的蛋白质保持在冰上。这将使双层胶束维持在液态，便于移液操作。</li>
 <li>按 1:4（V/V）的比例将双层胶束混合物加入到已纯化的去污剂溶解的蛋白质中。
 <ul type="disc">
 <li>例如：通过将 80 μl 蛋白质与 20 μl 双层胶束混合，可得到 100 μl 蛋白质-双层胶束混合液。若蛋白质浓度为 15 mg/ml，双层胶束浓度为 35%，则所得的含双层胶束的蛋白质混合液中，蛋白质浓度为 12 mg/ml，双层胶束浓度为 7%。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>通过轻柔地上下吹打混合溶液，直至溶液变得澄清且均匀。
 <ul type="disc">
 <li>注意：若出现气泡，可使用台式离心机短暂离心（30–60 秒，13000 rpm，4°C）以去除气泡。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>将混合物在冰上孵育至少 30 分钟，以促进蛋白质完全嵌入双层胶束中。此时，蛋白质-双层胶束混合物已可进行结晶试验。</li>
</ol>
3. 设置结晶实验
其他脂质结晶技术（如LCP）由于介质具有高黏度，需要使用专用设备；但双分子层微盘（bicelles）独特的相行为使其几乎可在任何标准结晶模式中实施，包括机器人自动化系统（图3）。结晶实验可采用常规市售的悬滴或坐滴板进行。
<ol>
 <li>无论是手动设置板还是使用结晶机器人，均需将蛋白-双微粒混合物置于冰上。这能保持蛋白-双微粒混合物的低温状态，并确保溶液的黏度最低。</li>
 <li>手动结晶实验——使用标准移液器，可将蛋白质-双层脂质微粒混合物与储液溶液混合，操作方式与通常用于可溶性或去垢剂增溶的膜蛋白的方法相同。
 <ul type="disc">
 <li>注意： 实验过程中将蛋白质-双微粒混合物置于冰上保存。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>机器人结晶试验 - 我们已针对Mosquito结晶机器人优化了这些实验步骤，但原则上（遵循相同的预防措施），该技术应适用于所有结晶机器人。以下提示可确保蛋白-双微粒混合物保持低温，并被机器人准确移液：
 <ol>
 <li>将装有蛋白质-双微粒混合物的板置于冰上预冷。 </li>
 <li>将蛋白质-双胶束混合物用移液器加入到孔板中，并继续将孔板置于冰上。该孔板应作为最后一个物品放置到机器人上，然后开始运行。</li>
 <li>在蚊式机器人平台3和平台5上，分别设置储液槽托盘和结晶盖板。</li>
 <li>将含有蛋白质-双微粒混合物的培养板置于蚊式机器人平台4上。这可确保机器人最后吸取蛋白质-双微粒混合物，并立即释放。</li>
 <li>为防止发热和黏度增加，请勿将储存液与蛋白质-双胶束混合物混合。</li>
 <li>进行多个样品检测时，一旦完成一次运行，立即把载有bicelle-蛋白的板放回冰上冷却。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>液滴体积及蛋白与储液池的比例可参照常规结晶实验进行选择。例如，使用 Mosquito 机器人进行的初步结晶实验可按以下条件设置 0.25 μl 蛋白：双亲分子混合物加 0.25 μl 储液池</li>
 <li>在培养皿中孵育晶体实验 20°C温度是一个良好的筛选和优化参数，因为双亲脂质体的相行为具有温度依赖性。
 <ul type="disc">
 <li>较高温度诱导层状相的形成12 (图1），其优点是可将蛋白质预先组织成层状结构。温度低于 20°C 可以进行筛选，但不应低于 4°C 因为这可能导致脂质在长时间内发生沉淀。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>与传统结晶实验相同，应定期监测bicelle实验中晶体的出现和生长情况。我们建议在第1天检查托盘st 和 3rd 设置后第1天开始，随后每周检查一次。</li>
 <li>晶体优化可采用常规用于去垢剂体系晶体的方法进行，包括网格筛选、添加剂筛选、改变温度等。此外，还可调整双微粒（bicelle）的百分比以及蛋白与双微粒的比例。进一步地，可在双微粒中掺入特定脂类，这些脂类可能对蛋白的稳定性或功能具有必要性。</li>
</ol>
4. 可视化、晶体提取与冷冻
由于蛋白质-双层微粒混合物的晶体筛选体系黏度与蛋白质-去污剂液滴相似，因此晶体的观察和提取为常规操作，可按照传统实验设置进行。
<ol>
 <li>观察：与通常需要在普通光和偏振光下使用高质量照明来检测晶体的LCP培养基不同，使用bicelles不会影响观察效果。无论是有色还是无色的蛋白质晶体液滴，均可使用常规显微镜轻松分析，且无需特殊设备。</li>
 <li>与其它脂质培养基类似，bicelles往往会产生较高比例的假阳性结果。使用紫外显微镜可有效区分蛋白质晶体与盐晶体（图4）。</li>
 <li>晶体提取与冷冻：晶体的提取和冷冻过程相对简单，无需溶解周围的bicelles培养基。此外，bicelles相本身可提供一定的中等程度的冷冻保护作用。</li>
</ol>
5. 典型结果：
晶体通常需要2-3天出现，大约一周或更长时间才能生长至最大尺寸。嗜盐菌视紫红质和小鼠电压依赖性阴离子通道1（mVDAC1）晶体的情况即是如此4,8。对于其他膜蛋白，晶体生长可能需要数周时间，因此必须在最初几周之后持续监测晶体实验。
与其他脂质介质一样，bicelle 容易形成看似晶体的结构。此外还观察到，它们会导致更高比例的盐和去垢剂晶体析出。使用可检测色氨酸荧光的紫外显微镜，可显著帮助排除此类非蛋白质来源的假阳性结果。图4展示了在可见光和紫外光下观察到的脂质结构、盐晶体和蛋白质晶体，以帮助区分可能观察到的不同结果。
<img alt="DMPC 双分子层与 CHAPSO 胶束形成bicelle的自组装示意图，层状片层转变" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. bicelle 示意图。bicelle 由可形成双分子层的脂质分子（如 DMPC，蓝色）和两亲性分子（如 CHAPSO，绿色）组成，后者可保护双分子层的疏水边缘。随着温度升高，盘状的 bicelle 会发生相变，转变为带孔的层状片层12。
<img alt="bicelle 蛋白质结晶过程示意图：制备、嵌入、试验、可视化。" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. bicelle 结晶方法的流程图，概述了四个基本步骤。
<img alt="蛋白质结晶过程示意图，包含去垢剂溶解的蛋白质、bicelles；机器人筛选实验。" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 结晶实验设置示意图。纯化的去垢剂溶解膜蛋白可直接在冰上通过移液操作与bicelles混合。将蛋白质/bicelles混合物在冰上孵育约30分钟后，可采用包括机器人系统在内的任何标准方法进行结晶实验设置。
<img alt="蛋白质结晶过程；可见光与紫外显微镜图像，晶体形成分析。" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 结晶实验的可视化观察。可见光图像（上图）和紫外光图像（下图）显示：（A）仅在盐条件下观察到的针状晶体。晶体无荧光信号，提示为假阳性结果。（B）在 MPD 条件下形成的棒状晶体。该晶体呈现微弱荧光，但经 X 射线衍射分析证实其不含蛋白质成分。（C）实验设置约四周后观察到的晶体。在紫外光下显示出强烈荧光，证实其为蛋白质晶体。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>编号</td>
 <td>蛋白质</td>
 <td>来源</td>
 <td>bicelle 配方</td>
 <td>蛋白质浓度</td>
 <td>去垢剂1</td>
 <td>分辨率（Å）</td>
 <td>参考文献</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>细菌视紫红质2</td>
 <td>Halobacterium salinarum</td>
 <td>8% DMPC:CHAPSO (2.8:1)</td>
 <td>8 mg/ml</td>
 <td> </td>
 <td>2.0</td>
 <td>Faham 和 Bowie，2002</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>8% DTPC:CHAPSO (3:1)</td>
 <td>8 mg/ml</td>
 <td> </td>
 <td>1.8</td>
 <td>Faham 等，2005</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>β2-肾上腺素能受体/Fab 复合物</td>
 <td>Homo sapiens</td>
 <td>8.3% DMPC:CHAPSO (3:1)</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 <td>DDM</td>
 <td>3.4/3.7</td>
 <td>Rasmussen 等，2007</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>电压依赖性阴离子通道1</td>
 <td>Mus musculus</td>
 <td>7% DMPC:CHAPSO (2.8:1)</td>
 <td>12 mg/ml</td>
 <td>LDAO</td>
 <td>2.3</td>
 <td>Ujwal 等，2008</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>黄视紫红质</td>
 <td>Salinibacter ruber</td>
 <td>4.2% DMPC, 5% NM</td>
 <td>4 mg/ml</td>
 <td>DDM</td>
 <td>1.9</td>
 <td>Luecke 等，2009</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>菱形蛋白酶</td>
 <td>Escherichia coli</td>
 <td>2% DMPC:CHAPSO (2.6:1)</td>
 <td>9 mg/ml</td>
 <td>壬基葡萄糖苷</td>
 <td>1.7</td>
 <td>Vinothkumar，2011</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
1 用于膜蛋白纯化的去污剂 
2 紫膜中的天然脂质在纯化过程中可能被一同带出
表1. 使用bicelles求解膜蛋白结构的结晶条件汇总。

<ol><li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phases%3A+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4+Monoacylglycerols%3A+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li>
<li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+crystallization%3A+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li>
<li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li>
<li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin%2C+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li>
<li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+%C3%85+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+human+%5Bbgr%5D2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li>
<li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering%3A+a+new+model+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

双亲性微碟（bicelles）是一种独特的脂质介质，可提供类似天然双分子层的环境，同时表现出类似去垢剂溶解的性质。这一特性使双亲性微碟相较于其他基于脂质的结晶方法具有明显优势，因为该技术无需特殊学习过程或专用设备。一旦获得双亲性微碟（无论是商业购买还是实验室制备），即可将其直接与纯化的蛋白质混合，随后的结晶实验流程几乎与标准的去垢剂基方法完全相同。此外，与其它技术相比，双亲性微碟还具备多种实际优势，包括可长期储存、蛋白质掺入简便、可利用标准机器人系统实现高通量操作，以及便于常规观察和晶体提取。另一个显著优势是可向双亲性微碟中掺杂特定脂质，以进行条件优化，或在已知对目标蛋白有益的情况下使用。综上所述，脂质双亲性微碟方法兼具高度的灵活性和操作简便性，可轻松应用于所有膜蛋白结晶项目。

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Affymetrix</td><td>D514</td><td></td></tr><tr><td>CHAPSO</td><td>Affymetrix</td><td>C317</td><td></td></tr><tr><td>即用型双层微粒（Ready-to-use Bicelles）</td><td>MemX Biosciences</td><td>MX201001/MX201002</td><td></td></tr><tr><td>结晶筛选试剂盒（Crystallization Screens）</td><td>Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>可使用标准的市售试剂盒进行初步筛选</td></tr><tr><td>结晶实验设置（Crystallization Set-up）</td><td></td><td></td><td>可使用实验室现有的标准手动和/或机器人自动化设置方法</td></tr></tbody></table>

高通量膜蛋白结晶的脂质双层微碟法

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

膜蛋白（MPs）在许多生理过程中发挥着关键作用，例如将特定分子转运通过原本不可渗透的细胞和细胞器周围的膜双层结构。膜蛋白功能的改变会导致多种人类疾病和障碍；因此，深入理解其结构仍是生物学研究的关键目标。然而，膜蛋白的结构解析仍面临重大挑战，这通常源于其疏水性。
膜蛋白（MPs）具有大量嵌入双分子层的疏水区域。通常使用去垢剂将这些蛋白质从双分子层中溶解出来，形成蛋白-去垢剂胶束，随后可像可溶性蛋白一样进行操作。传统上，结晶实验采用蛋白-去垢剂混合物进行，但这类混合物常常难以结晶，或产生的晶体质量较差。这些问题主要源于去垢剂的存在。&prime;其无法充分模拟脂双层，导致稳定性差和异质性。此外，去垢剂会遮蔽膜蛋白的疏水表面，减少可用于晶体接触的表面积。为克服这些缺点，可在脂质介质中对膜蛋白进行结晶，该方法更接近其内源性环境，近年来已成为膜蛋白结晶的一种从头技术。
脂质立方相（LCP）是一种三维脂双层结构，其内部贯穿有相互连通的水通道系统1。尽管单油酸甘油酯是首选脂质，但其他相关脂质如单棕榈油酸甘油酯和单疫苗酸甘油酯也已被用于制备LCP2。膜蛋白被嵌入LCP中，在三维空间中扩散并促进晶体成核。LCP的一大优势在于蛋白能够保持更接近天然的环境；但该方法存在若干技术上的缺点，包括高黏度（需要专用设备）以及晶体观察和操作困难3,4。由于这些技术难题，我们采用了另一种脂质介质进行结晶——bicelles5,6（图1）。Bicelles是由磷脂酰胆碱脂质（DMPC）与两亲性分子（CHAPSO）或短链脂质（DHPC）混合形成的脂质/两亲体复合物。在每个bicelle盘状结构中，脂质分子形成双层结构，而两亲性分子则排列在非极性边缘，兼具脂双层和去垢剂的有利特性。重要的是，在相变温度以下，蛋白-bicelle混合物的黏度降低，其操作方式与去垢剂溶解的膜蛋白相似，因此bicelles可兼容结晶机器人系统。
双亲性微粒已成功用于结晶多种膜蛋白5,7-11 （表1）这一不断扩大的蛋白质集合展示了双层胶束（bicelles）在结晶原核和真核来源的α螺旋及β折叠跨膜蛋白方面的多功能性。鉴于这些成功案例以及其在高通量应用中的简便性，双层胶束应成为每一位膜蛋白晶体学家实验工具中的常规组成部分。&prime;其武器库。在本视频中，我们介绍双层胶束（bicelle）方法，并提供利用标准机器人系统对纯化的膜蛋白进行高通量结晶试验的逐步实验方案。

双亲分子小片（bicelles）是由脂质/两亲分子组成的混合物，可在脂质双层环境中维持膜蛋白（MPs）的稳定性，同时具有独特的相行为，便于通过结晶机器人进行高通量筛选。该技术已成功解析了多种原核和真核来源的高分辨率结构。本视频介绍了制备脂质双亲分子小片混合物、将膜蛋白嵌入该混合物、设置结晶实验（包括手动和机器人操作）以及从培养基中收获晶体的实验方案。

膜蛋白（MPs）在许多生理过程中发挥着关键作用，例如将特定分子转运通过原本不可渗透的膜……

本视频将演示一种利用脂质B细胞（Lipic B cells）建立高通量结晶实验的方法，用于纯化膜蛋白的结晶。首先制备B细胞，通过将脂质与去污剂混合，将纯化的膜蛋白掺入B细胞混合物中，然后使用纳升机器人进行结晶实验并进行视觉检测。通过标准光学显微镜观察可确认晶体的存在。蛋白晶体形成后，可将其取出并冷冻，用于数据收集和结构测定。该技术的主要优势在于，由于B细胞具有独特的相行为，可利用实验室中常见的标准设备和机器人系统进行结晶。B细胞的制备方法十分简便，能够将目标膜蛋白从去垢剂胶束中分离出来，并将其置入类脂介质中。这为您提供了全新的一组筛选条件。这种方法非常简单，已成功应用于多种膜蛋白，因此完全值得尝试。基于B细胞的结晶第一步是制备形成B细胞的脂质两亲性混合物。该过程需要耗费大量精力，且最为耗时。请注意，完成该过程可能需要数小时。B细胞可在多种脂质两亲分子组合以及较宽浓度范围内形成。有关建议的起始点，请参见随附书面方案中的表一。首先配制 1 毫升摩尔比为 2.8:1 的 35% DMPC 与 Chapso 混合液。具体操作为：在离心管中称取 0.26 克 DMPC 和 0.09 克 Chapso，用去离子水定容至 1.0 毫升，涡旋混匀该混合物。接下来，将混合物置于水浴中加热至约 40 摄氏度，直至其变为凝胶状。然后将试管放在冰上。样品应再次恢复为液态。然后再次涡旋数分钟，继续循环进行温育、冷却和涡旋操作，直至脂质完全溶解。注意随着循环次数增加，混合物在冷却完成后可能会变得浑浊。混合物在室温或更高温度下呈透明凝胶状，而在冰上则为黏稠液体。细胞可置于零下20摄氏度长期保存。接下来将纯化的蛋白质加入B细胞培养基中。该过程较为简单，应与结晶步骤在同一天进行，结晶步骤将在视频的下一章节中展示。在室温下解冻DMPC capso B细胞混合物，直至其相变形成透明凝胶状。将混合物置于冰上使其液化，然后短暂涡旋以重新形成均一的B细胞相。从此步骤开始，始终将B细胞混合物和纯化蛋白置于冰上，以保持B细胞处于液相状态，便于移液操作。接下来，将B细胞混合物按1:4的体积比加入已纯化的去垢剂溶解的蛋白质中。然后轻轻吹打混匀，直至溶液变得澄清且均一。若出现气泡，可在台式离心机中短暂离心去除。将混合物置于冰上孵育至少30分钟，以促进蛋白质被细胞完全吸收。此时，蛋白质-细胞混合物已准备好进行结晶试验。接下来将使用蚊式结晶机器人演示结晶试验过程。将96孔V型底板置于冰上冷却。用移液器将蛋白-细胞混合物加入到孔板中，以确保溶液的黏度最小。在完成最终步骤前，始终将蛋白-细胞混合物置于冰上保存。此处使用的机器人有五个平台。将含有储液槽的微孔板放在第三个平台上，将用于点加液滴的结晶盖放在第五个平台上。然后将蛋白质按细胞板放置在最靠近点加位置的第四个平台上。这可确保蛋白质-细胞混合物是机器人最后吸取的成分，并立即释放。使用软件启动运行后，机器人将先吸取储液溶液，随后吸取蛋白质-细胞混合物，并将其以液滴形式分配至盖子上，以防止在分配过程中发生加热和黏度增加。切勿在程序运行结束后立即通过蚊子（Mosquito）系统将储液溶液与蛋白质-细胞混合物混合。从仪器中取出细胞蛋白板并置于冰上。打开仪器盖子，将其倒扣在含有储存液的板上，使液滴倒置。将板在20摄氏度下孵育。请注意，也可测试其他温度以观察晶体形成并进行优化。较高温度会诱导层状相的形成，其优势在于可将蛋白质预先组织成层状结构。可在4摄氏度至20摄氏度之间的温度范围内进行筛选。低于四摄氏度的温度可能导致脂质在长时间内析出，需在第1天、第3天以及此后每周进行观察，使用标准光学显微镜评估晶体的形成与生长情况。图中显示的是在仅受攻击条件下观察到的针状晶体的明场图像和紫外图像。晶体未检测到荧光信号，表明该图像中为假阳性结果。当使用甲基丙二醇作为沉淀剂时，形成了棒状晶体。该晶体显示出微弱的荧光，提示其可能为蛋白质晶体，但经X射线衍射分析发现其并非蛋白质。图中所示晶体为实验设置约四周后观察到的结果。在紫外光下强烈的荧光表明这是蛋白质晶体。正如您在本视频中所看到的那样，一旦获得B细胞，便可将其直接与纯化的蛋白质混合，此后结晶过程几乎与标准的去垢剂法实验方案完全相同。另一个显著的优势是能够通过特定脂质对B细胞进行掺杂以实现优化。该技术具有极高的灵活性，且使用极为简便，因此应将其应用于所有膜蛋白结晶研究项目中。

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科研

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Biology

生物学

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