High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

本视频将演示一种使用 Lipic B 细胞对纯化的膜蛋白进行高通量结晶试验的方法。首先，通过混合脂质制备 B 细胞，并将洗涤剂纯化的膜蛋白掺入 B 细胞混合物中，并使用纳升机器人目视检查进行结晶试验。使用标准光学显微镜可以揭示晶体的存在。

形成后，可以提取和冷冻蛋白质晶体，以进行数据收集和结构化测定。该技术的主要优点是，由于 B 细胞独特的相行为，可以使用实验室中的标准设备和机器人技术进行结晶。设置 B 细胞是一种非常简单的技术，允许您将靶膜蛋白从去污剂 my cell 中取出，并将其放入脂质培养基中。

这为您提供了一组全新的筛选条件。这是一种非常简单的方法，已成功用于许多膜蛋白，因此没有理由不尝试。基于 B 细胞的结晶的第一步是制备形成脂质两栖混合物的 B 细胞。

此过程需要大量的精力，并且是最耗时的。请注意，这可能需要几个小时才能完成。B 细胞可以以多种脂质两栖组合和广泛的浓度形成。

有关建议的起点，请参见随附书面方案中的表 1，首先以 2.8：1 的摩尔比制备一毫升 35% DMPC capso 混合物。为此，在试管中称取 0.26 克 DMPC 和 0.09 克 Chapo。使用去离子水涡旋混合物，使体积达到 1.0 毫升。

接下来，在水浴中将混合物加热至约 40 摄氏度，直到之后变成凝胶状。将试管放在冰上。样品应该再次变成液体。

然后再次涡旋几分钟，继续循环加热、冷却和涡旋步骤，直到脂质完全溶解。请注意，随着循环次数的增加，混合物在完成后冷却时可能会变得浑浊。混合物在室温或室温以上将是透明凝胶，细胞在冰上的粘性液体可以放置在零下 20 摄氏度下进行长期储存。

接下来，将纯化的蛋白质掺入 B 细胞培养基中。这是一个简单的过程，应该在结晶的同一天进行，如视频的下一部分所示。在室温下解冻 DMPC capso B 细胞混合物，直到相变为透明凝胶。

将混合物放在冰上使其液化，然后短暂涡旋以重新建立均匀的 B 细胞相。从这一点开始，将 B 细胞混合物和纯化的蛋白质保存在冰上。这将使 B 细胞保持液相状态，使其适合移液。

接下来，将 B 细胞混合物以 1 比 4、体积对体积的比例添加到纯化的去污剂溶解蛋白中。然后轻轻上下移液，直到溶液变得透明和均匀。如果出现气泡，请在台式离心机中短暂地将它们旋转。

将混合物在冰上孵育至少 30 分钟，以促进蛋白质完全掺入细胞。蛋白细胞混合物现在已准备好进行结晶试验。将使用蚊子结晶机器人演示结晶试验。

将 96 孔 V 底板置于冰上冷却。通过细胞混合物将蛋白质移液到板中，以确保溶液的粘度最小。将蛋白质通过细胞混合物保存在冰上，直到最后一步。

这里使用的机器人有五个平台。将包含储液槽的微孔板放在平台 3 上，将液滴分配到结晶盖上平台五。然后，将蛋白质通过细胞板放在最靠近分配位置的平台 4 上。

这确保了蛋白质通过细胞混合物是机器人最后拾取的，并立即被释放。使用软件启动运行，机器人将拾取储液槽溶液，然后是细胞混合物中的蛋白质，并将它们以滴剂形式分配到盖子上，以防止在分配过程中加热和粘度增加。运行完成后，不要对蚊子进行编程，使其通过细胞混合物将储液罐与蛋白质混合。

从仪器中取出 buy cell protein plate 并将其置于冰上。从仪器上取下盖子，将其放在装有储液槽溶液的板上，使液滴倒置。在 20 摄氏度下孵育板。

请注意，也可以测试其他温度以进行晶体形成和优化。较高的温度会诱导层状相，其优点是可以将蛋白质分层组织。可以筛选 4 摄氏度到 20 摄氏度之间的温度。

低于 4 摄氏度的温度可能会导致脂质在第一天、第三天和此后每周长时间沉淀，使用标准光学显微镜评估晶体外观和生长。这里显示的是仅在攻击条件下观察到的针状晶体的明场图像和紫外线图像。未从晶体中检测到荧光，表明该图像中存在假阳性。

以甲基丙烷二醇为沉淀剂时形成棒状晶体。晶体每周发出荧光，表明它可能是一种蛋白质晶体，但使用 X 射线衍射发现它是不顽强的。这里显示的是试验后约 4 周观察到的晶体。

紫外光下的强烈荧光证实它是蛋白质晶体。正如您在此视频中观看的那样。一旦 B 细胞可用，它们就可以直接与纯化的蛋白质混合，从那时起，结晶几乎与基于标准去污剂的方案完全相同。

另一个明显的优势是能够用特定脂质掺杂 B 细胞以进行优化。该技术确实有很多用途，而且使用起来非常简单，应该尝试用于所有膜蛋白结晶项目。