Name: 生物医学应用海藻酸钠微球的一代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学习制备海藻酸钠微球的多层封装技术，用于细胞和蛋白质的双重包埋。该方法在1型糖尿病治疗中具有重要应用价值，可实现药物控释与细胞保护。

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本研究由美国退伍军人事务部（华盛顿特区）、国家科学基金会（阿灵顿，弗吉尼亚州）资助，资助编号为0852048、0731201和0854430，以及美国国立卫生研究院（贝塞斯达，马里兰州）的RO1 DK080897资助。Khanna先生获得了比尔及梅琳达·盖茨基金会（西雅图，华盛顿州）Edward Ross先生和Monica Moya博士慷慨捐赠的支持。

本方案描述了一种制备多层海藻酸盐微球的三步法（图1）。首先形成海藻酸盐微球（图2A），该步骤详见下文第1节。在此步骤中可将细胞或蛋白质加入微球，以实现递送功能。下一步是在微球表面形成一层具有选择透过性的屏障层，详见第2节。最后一步是形成额外的海藻酸盐外层，详见第3节。该外层位于微球表面外部（图2B），可用于包封和递送治疗性分子（图2C），从而在移植后调控细胞对该系统的响应。
1. 藻酸盐微珠的制备
<ol>
 <li>通过将15克LVM海藻酸盐溶解于1 mL内层海藻酸盐溶液（25 mM HEPES缓冲液、118 mM NaCl、5.6 mM KCl和2.5 mM MgCl2溶于去离子水中，调节pH至7.4）中，制备1.5% (w/v)的LVM海藻酸盐溶液。在涡旋振荡器上混合，直至海藻酸盐完全溶解，形成澄清且黏稠的溶液。注意：本方案描述了在海藻酸盐微胶囊中包封胰岛细胞的最佳条件1。可根据其他应用（如药物递送、组织工程等）的需求调整海藻酸微球的浓度与组成。注意：进行细胞包封时，可在将海藻酸盐溶液装入微胶囊装置前，将胰岛细胞加入该溶液中。</li>
 <li>通过将100 mM CaCl2和10 mM HEPES缓冲液溶解于去离子水中并调节pH至7.4，制备交联溶液（22 mM CaCl2溶于去离子水中）。注意：根据所需海藻酸凝胶的性质，可使用其他二价阳离子（如Br2+、Sr2+等）替代Ca2+。</li>
 <li>安装双通道气流套管式海藻酸盐微胶囊装置：将25号针头连接至注射器，并调节两侧阀门，确保针头位于气流套管中心位置。可根据目标海藻酸微珠的尺寸选择不同规格的针头。 
 若无微胶囊装置，也可使用注射器完成此步骤。将海藻酸盐溶液装入注射器，并根据所需微珠尺寸选择合适的针头规格。</li>
 <li>在针头正下方放置一个含有10 mL交联溶液的烧瓶，并在溶液中放入磁力搅拌子。</li>
 <li>将液滴直接注入CaCl2溶液中，使海藻酸盐交联形成微珠。将微珠置于交联溶液中孵育至少十五分钟，并持续搅拌以完成固化。</li>
 <li>将微珠转移至15 mL离心管中。去除残留溶液，并用含0.2% CaCl2的生理盐水溶液洗涤三次，每次两分钟。</li>
</ol>
2. 用多聚-L-鸟氨酸包被微珠
<ol>
 <li>在生理盐水中配制 3 mL 的 0.1% (w/v) 聚-L-鸟氨酸 (PLO) 溶液。将溶液置于涡旋振荡器上，直至完全溶解，形成澄清溶液。此步骤中可使用聚-L-赖氨酸 (PLL) 替代 PLO，所得选择透过性水平相似。</li>
 <li>将海藻酸盐微珠转移至 PLO 溶液中。置于涡旋振荡器上反应 30 分钟，使 PLO 有足够时间与海藻酸盐相互作用，形成多聚阳离子-多聚阴离子复合物。30 分钟后，海藻酸盐微珠周围应出现明显可见的白色包被层。</li>
 <li>移除 PLO 溶液，并用含 0.2% CaCl2 的生理盐水洗涤三次，每次两分钟。</li>
</ol>
3. 制备外层海藻酸盐
<ol>
 <li>制备所需浓度的海藻酸盐溶液，用于形成外层。该溶液的制备方法如上文(1.1)所述。外层的大小受所用海藻酸盐的组成和浓度影响（图3）。</li>
 <li>将海藻酸盐微珠转移至细胞过滤器中。使用Kimwipe纸吸除多余溶液，尽可能将微珠干燥。</li>
 <li>将微珠转移至Parafilm表面。可根据需要，用其他光滑表面（如玻璃或塑料培养皿）替代Parafilm。</li>
 <li>将步骤(3.1)中制备的海藻酸盐溶液涂覆于海藻酸盐微珠上。所加溶液的体积应完全覆盖微珠。让微珠在海藻酸盐溶液中静置45分钟。</li>
 <li>使用移液器移除未结合到微珠上的多余海藻酸盐溶液。</li>
 <li>将微珠转移至22 mM CaCl2溶液中。该步骤可使海藻酸盐溶液在微珠周围发生交联，从而形成明显的外层海藻酸盐结构。</li>
 <li>用22 mM CaCl2的生理盐水溶液洗涤三次，每次两分钟。在显微镜下观察微珠，应可见围绕核心微珠形成的明显外层海藻酸盐结构。</li>
</ol>
4. 典型结果
<img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig1.jpg" alt="海藻酸盐包封过程示意图；氯化钙交联，聚-L-鸟氨酸包被。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 多层海藻酸盐微珠制备流程示意图。经 Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010) 许可转载。
 <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig2.jpg" alt="显微镜图像比较了不同条件下细胞形态和荧光情况。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. （A）和（B）为海藻酸盐微珠的相差显微图像。（A）显示合成步骤（1.7）后的微珠，而（B）显示完成步骤（3.7）后出现的明显外层海藻酸盐结构。（C）为荧光标记的 BSA 蛋白在外层包封的 FITC 图像。经 Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov;95(2), 632-40 (2010) 许可转载。
<img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig3.jpg" alt="显示外层海藻酸盐组成与微米尺寸、LVM 和 LVG 在 1-1.5% 条件下的柱状图" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3. 外层海藻酸盐的尺寸可根据所用海藻酸盐的组成和浓度进行调节。我们的结果表明，对于 LVM 和 LVG 型海藻酸盐，外层尺寸均随海藻酸盐浓度的增加而增大，且在相同浓度下，LVG 型海藻酸盐产生的外层厚度大于 LVM 型。经许可转载自 Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010)。
 <img src="/files/ftp_upload/3388/3388fig4.jpg" alt="FGF-1释放动力学；图表；时间与累积释放量关系；水凝胶配方的数据分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
 图4. 血管生成生长因子蛋白FGF-1从外层海藻酸盐层的释放情况随所用LVM和LVG海藻酸盐浓度的不同而变化。(A)和(B)显示不同外层配方下FGF-1的释放百分比，(C)和(D)表示相应的FGF-1质量释放量随时间的变化。所有条件下在最初5小时内均表现出突释现象（A和C），随后可持续低剂量释放长达30天（B和D）。经许可转载自Khanna et al. J Biomed Mater Res A. Nov; 95(2), 632-40 (2010)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3388/3388fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。

<ol><li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Poly-L-+Ornithine-coated+alginate+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li>
<li>Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+alginate+composition+and+gelling+conditions+on+diffusional+and+mechanical+properties+of+calcium-alginate+gel+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Eng.+Jpn%22%5BJournal%5D)">Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads.</a> J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).</li>
<li>Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+low+levels+of+fibroblast+growth+factor-1+promote+persistent+microvascular+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation.</a> Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).</li>
<li>Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+delivery+of+FGF-1+increases+vascular+density+in+comparison+to+bolus+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration.</a> Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).</li>
<li>Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+FGF-1+loaded+alginate+microbeads+on+neovascularization+and+adipogenesis+in+a+vascular+pedicle+model+of+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering.</a> Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).</li>
<li>Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayered+Microcapsules+for+the+Sustained-Release+of+Angiogenic+Proteins+From+Encapsulated+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells.</a> Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).</li>
<li>Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multilayered+alginate+microcapsules+for+the+sustained-release+of+fibroblast+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

海藻酸盐是一种从藻类中提取的天然酸性多糖，由1,4'-β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）单元组成2,3。当二价阳离子（如Ca2+、Sr2+或Ba2+）与G-单体相互作用，在相邻的海藻酸盐链之间形成离子桥时，即可发生简单的凝胶化过程。海藻酸盐微球已被用于递送多种蛋白质，包括成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）、神经生长因子、白血病抑制因子、血管内皮生长因子（VEGF），以及包封软骨细胞、肝细胞和胰岛细胞等。使用此类微粒聚合物系统的优势包括：保护蛋白质和细胞在体内不被降解和引发反应、微小的颗粒体积便于通过注射给药，以及通过调控材料的物理性质来控制溶质的扩散。
目前，表面包被有选择性渗透聚合物层的海藻酸盐微球正在开展用于治疗1型糖尿病的临床试验。然而，移植后包封胰岛的长期存活能力在一定程度上依赖于其从血管血液供应中获取氧气和营养物质的能力。一种既能作为胰岛包封系统、又能作为促血管生成蛋白持续递送系统的生物材料体系，可能促进移植细胞周围的血管生长，从而提高移植物的存活率。持续性的新生血管...

<table><tbody><tr><td>Pronova Ultrapure LVG 藻酸盐</td><td>Nova-Matrix</td><td>4200006</td><td>提供多种藻酸盐配方。藻酸盐的选择会影响微珠的最终特性，包括尺寸、机械性能和传质性能。应针对特定应用优化所用配方的组成。</td></tr><tr><td>Pronova Ultrapure LVM 藻酸盐</td><td>Nova-Matrix</td><td>4200206</td><td>提供多种藻酸盐配方。藻酸盐的选择会影响微珠的最终特性，包括尺寸、机械性能和传质性能。应针对特定应用优化所用配方的组成。</td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2533</td><td> </td></tr></tbody></table>

用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

由于海藻酸盐类材料具有亲水性、生物相容性以及独特的物理结构，其在生物医学领域已受到广泛关注。其应用包括细胞包封、药物递送、干细胞培养以及组织工程支架。事实上，目前已有临床试验正在开展，通过将胰岛细胞包封于聚-L-鸟氨酸（PLO）包被的海藻酸盐微球中，用于治疗I型糖尿病。然而，由于移植后细胞存活率较低，需要大量胰岛细胞才能达到治疗效果。若能在包封细胞周围局部促进微血管网络的形成，则可通过改善氧气、葡萄糖及其他重要营养物质的输送，提高细胞的存活率。成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）是一种天然存在的生长因子，能够促进血管生成，并改善缺血组织中的氧含量。与单次大剂量给药相比，持续释放方式可显著增强FGF-1的疗效。若能在胰岛包封系统中实现生长因子的局部长期释放，将有望引导血管直接向移植细胞生长，从而可能改善移植物的功能效果。本文中，我们概述了用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备步骤。此外，我们还介绍了一种自主研发的多层海藻酸盐微球的制备方法：细胞可包封于内部的海藻酸盐核心中，而促血管生成蛋白则置于外部的海藻酸盐层中。该外层蛋白的释放将可刺激局部微血管网络直接向移植的胰岛细胞生长。

在以下章节中，我们概述了用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备方法。我们重点介绍一种用于制备多层海藻酸盐微球的技术，该技术可同时包封细胞和蛋白质，有望用于治疗1型糖尿病。

基于海藻酸盐的材料因其亲水性、生物相容性以及……而在生物医学应用中受到广泛关注。

我叫 Goldie Ana，是伊利诺伊理工学院 Eric Bras 博士实验室的一名本科生。在本视频中，我将介绍海藻酸微珠在生物医学工程中的应用技术，特别是在细胞与组织工程领域的应用。此处描述的所有工作均是与维克森林再生医学研究所 Emmanuel OPA 博士实验室合作完成的。我将介绍用于药物递送和细胞包封的海藻酸微球的制备技术。最后，我将演示我们实验室开发的一种新型多层海藻酸微胶囊制备方法，该方法可用于同时包封细胞和蛋白质。海藻酸由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸残基以不同的序列组成。海藻酸盐溶液在多价阳离子（如最常用的钙离子 Ca²⁺）存在下发生交联形成凝胶。研究人员已探索将海藻酸盐微珠用于细胞和蛋白质的包封。海藻酸盐水凝胶的性质可根据其合成条件进行调节，具有内在不同的特性，例如可用于调控释放动力学。海藻酸盐微珠已被广泛应用于多种领域，包括蛋白质包封、药物递送、细胞包封，以及作为食品科学中的成分（如分子美食学）。我们首先配制内层海藻酸盐溶液。将25毫摩尔的heis、118毫摩尔的氯化钠、5.6毫摩尔的氯化钾和2.5毫摩尔的氯化镁加入去离子水中，充分振荡以确保所有试剂完全溶解。调节pH至7.4，以保持与生理条件一致。称取所需量的粉末以达到目标浓度，并转移至已准备好的抗原间溶液中。将溶液置于涡旋振荡器上振荡，直至所有粉末完全溶解，形成澄清且黏稠的溶液。通过将10毫摩尔的heis缓冲液和100毫摩尔的氯化钙加入去离子水中来配制交联溶液。充分振荡溶液，并将其pH值调节至7.4。向烧杯中加入10毫升交联溶液。将海藻酸钠转移至装有合适规格针头的注射器中。将针头垂直于交联溶液表面，缓慢将液滴挤入交联溶液，以形成球形微珠。为制备大量粒径均一的微珠，可采用双通道误差微封装技术。将海藻酸盐溶液装入注射器，打开空气夹套阀，随后打开海藻酸盐夹套阀，使液滴喷入含有交联溶液的烧瓶中。让微珠在溶液中孵育15分钟。用22毫摩尔的溶液将微珠洗涤三次。氯化钙和生理盐水海藻酸微胶囊已被广泛研究用于细胞包封。例如，一种治疗1型糖尿病的 proposed 方法涉及将供体眼睑移植到患者体内，以防止对自体细胞产生排斥反应。然而，患者必须服用会削弱其免疫系统的免疫抑制药物。将艾里斯置于容器内。海藻酸等材料可能消除对免疫抑制药物的需求。在海藻酸微球周围添加多聚羟基鸟氨酸（PLO）涂层可作为半透膜。在PLO涂层周围添加一层薄薄的海藻酸盐单层，有助于限制炎症反应。带正电荷的PLO会与海藻酸盐发生相互作用，从而在微珠周围形成一层作为选择性渗透膜的涂层。随后在PLO涂层周围形成一层海藻酸盐单层，以屏蔽其正电荷并限制炎症反应。移植后，通过将PLO溶解于生理盐水中，配制0.1%的多聚左旋鸟氨酸（poly-L-ornithine）溶液。将PLO溶液加入藻酸盐微珠中，置于涡旋振荡器上作用30分钟，使藻酸盐微珠有足够时间与PLO溶液充分作用。移除周围液体，并用含22毫摩尔氯化钙的生理盐水溶液洗涤三次，每次两分钟。将海藻酸盐溶液加入经PLO包被的微珠中，并置于涡旋振荡器上振荡五分钟。使用0.9%生理盐水溶液进行三次洗涤，每次两分钟，以去除未结合的海藻酸。完成洗涤后，可将微珠置于氯化钙溶液中保存。细胞移植的一个局限性在于，许多细胞因缺乏通畅的血液供应而在移植后死亡，而血液供应能够为细胞输送氧气、葡萄糖及其他重要营养物质。血管新生（即从已有血管中生长出新血管）可通过递送促血管生成治疗性蛋白（如成纤维细胞生长因子1或FGF1，或血管内皮生长因子VEGF）来加以刺激。本实验室先前已证实，与高剂量单次给药相比，持续低水平释放FGF1可促进更稳定的血管化。我们已开发出一种新型工艺，用于制备多层海藻酸微球，其外层为较厚的海藻酸层，而非传统上所使用的薄单层结构。我们的药物递送系统具有细胞和蛋白质包封的双重功能，例如，可将细胞包封于内核，而将促血管生成蛋白（如 FGF1）包封于外层的海藻酸区域。治疗性蛋白的释放将促进新生血管向移植部位生长，从而提高胰岛细胞的存活率。多层抗原微珠具有细胞和蛋白质包封的双重功能。在PLO涂层周围会形成一个较大的外层过敏原区域，而非传统使用的单分子层，该区域可用于蛋白质包封。治疗性蛋白质从外部海藻酸区域释放后，可促进血管向移植部位生长。理论上，这将提供通畅的血液供应，向包封的细胞输送 vital 营养物质，从而提高细胞的存活率。制备多层海藻酸盐微珠的步骤与之前讨论的方法类似。首先合成含有细胞的海藻酸盐微珠，然后构建一层PLO涂层。然而，在最后一步中，外层是通过在氯化钙溶液中交联海藻酸盐形成的，而不是使用生理盐水。制备多层吉纳微珠时，首先将溶液中的PLO包被微珠转移至细胞滤筛中，以去除多余液体，然后将微珠转移至平整表面（如培菲儿或培养皿）上，将外层变应原溶液加至微珠上方，并孵育45分钟。随后用移液器去除多余的外层变应原溶液，将微珠转移至氯化钙溶液中，从而交联海藻酸盐形成外层结构。用溶液洗涤三次，每次两分钟。使用2毫摩尔氯化钙和生理盐水溶液面板。A显示了吉奈特微珠的表面，与B形成对比，后者可见明显的外层过敏原层。C显示了一张多层海藻酸盐微珠的图像，其外层包裹着荧光标记的蛋白质。外层海藻酸盐层的大小可根据所用海藻酸盐的组成和浓度进行调整，这会影响多层海藻酸盐微球中成纤维细胞生长因子1（FGF-1）的释放特性。通过改变外层合成条件，可调节海藻酸盐微球的性质。所有条件下均在最初4小时内出现突释现象，之后可持续释放FGF-1长达30天。FGF-1的长期释放具有促进持续性血管化的潜力，从而有助于提高包封细胞的存活率。这标志着我们本次报告的结束。希望您觉得本内容具有参考价值。您。

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生物医学应用海藻酸钠微球的一代

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