一个影像的简单方法拟南芥叶浸润成像介质中使用全氟萘烷

该程序的总体目标是最大限度地减少由植物叶子中的空隙引起的生物图像退化，以获得叶内活细胞的更清晰图像。如果叶子被安装在水性封片剂中，并且荧光团被激光激发，则橙色显示的组织内许多未填充的空气空间和折射率的变化会限制结果图像中组织深处的信号强度。如果叶子被安装在每个荧光标记或 PFD 中，则荧光团的激光激发衰减较小，并允许发射信号的更好传输。

最终，将扫描激光共聚焦显微镜与 PFD 封片剂结合使用，可提供植物叶片内活细胞的清晰图像，其深度是使用水性封片剂时的两倍多。与固定或安装叶子和水性介质等现有方法相比，该技术的主要优点是它减少了中层填充内的折射，并能够对叶子更深处的活细胞进行更准确的成像，这一直存在问题。这种方法可以帮助回答植物科学中的关键问题，例如解决中观填充、细胞生物学和体内信号传导、病原体在叶子上的定植和病原体填充相互作用，尽管这种方法可以提供对基础植物生物学的见解。

它也可以应用于其他富含气域的高折射组织，例如内窥螺旋或脊椎动物肺。演示此程序的是我的实验室 To Mount Leaf 的 George Littlejohn 博士。PFD 样品首先使用聚二甲基 Sloane 或 P-D-M-S-P-D-M-S 的透气垫圈制备显微镜载玻片，这是一种粘弹性聚合物，可以模制以提供根据实验要求定制的腔室。

通过在充气瓶中摇动少量 PFD 来平衡 PFD 与空气。这也可以通过以下方法实现：接下来，将 PFD 倒入打开的培养皿中，然后将整个幼苗或切除叶子漂浮在液体上 5 分钟。组织应变为半透明，让人联想到玻璃化组织。

叶子可能看起来比暴露于 PFD 之前更暗或更亮，具体取决于照明条件和所用组织的年龄。最后，用 aero 等同 PFD 填充 PDMS 室，并小心地将组织样品从孵育培养皿转移到 PDMS 室。用盖子、衬条和图像密封载玻片。

根据实验要求，将月叶在重组绿色荧光蛋白或 GFP 的悬浮液中孵育 5 分钟。在 PFD 中，对 PFD 孵育的叶子样品的显微镜检查表明，大多数空气空间都被悬浮在 PFD 中的重组 GFP 淹没。GFP 为绿色，红色代表叶绿素、乐透荧光和 delits meso fill 细胞。

很明显，在与 PFD 一起孵育时，叶子被淹没，但偶尔可能会残留空气。在这些条件下，水不会淹没叶子。在这里，表达 Venus（YFP 的一种变体）的 opsys 叶子被孵育并安装在空气、水或 PFD 激光扫描中。样品的共聚焦显微镜显示 PFD 优于空气和水，成像深度大约增加了两倍。

比较 PFD 和水时 一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 5 到 10 分钟内完成。在执行此程序时，重要的是要记住 Peripheral delin 会溶解指甲油和特氟龙，但它与硅脂兼容。观看此视频后，您应该对如何使用 per fluro delin 作为封片剂以改善植物叶片细胞中的成像有一个很好的了解。

不要忘记，虽然 per fluoro delin 是无毒的，但我们建议在执行此程序时采用标准安全措施。