一种简单的成像方法 拟南芥 使用全氟十氢萘作为浸润性成像介质的叶片成像

本实验的总体目标是尽量减少植物叶片中空气间隙对生物图像造成的降解，从而获得叶片内活细胞更清晰的图像。如果将叶片置于水性封片介质中，并用激光激发荧光染料，则组织内部未被填充的大量空气间隙以及折射率的变化（图中橙色部分所示）会限制组织深层信号在最终图像中的强度。而若将叶片置于全氟化萘烷（perfluoro-decalin, PFD）中进行封片，激光对荧光染料的激发作用衰减较小，能够实现发射信号更佳的透射效果。

最终，使用扫描激光共聚焦显微镜结合PFD封片介质，可获得植物叶片内部活细胞的清晰图像，其成像深度超过使用水性封片介质时的两倍以上。与现有的固定或使用水性介质封片等方法相比，该技术的主要优势在于减少了叶肉组织内部的光折射，从而能够更准确地对叶片深层的活细胞进行成像，而这一问题此前一直存在困难。该方法有助于回答植物科学中的关键问题，例如叶肉细胞生物学及体内信号传导、病原体对叶片的定植及其与叶肉组织的相互作用，同时该技术可为植物基础生物学研究提供重要见解。

该方法也可应用于其他富含气腔且折射率较高的组织，例如昆虫的螺旋气管或脊椎动物的肺。本实验操作将由我实验室的 Dr. George Littlejohn 演示。在 PFD 中制备样品时，首先准备带有透气垫圈的显微镜载玻片，垫圈材料为聚二甲基硅氧烷（poly dimethyl siloxane），即 PDMS。PDMS 是一种粘弹性聚合物，可塑造成符合特定实验需求的腔室结构。

通过将少量PFD在充满空气的瓶中振荡，使PFD与空气达到平衡。也可通过向PFD中通入空气实现此步骤，随后将PFD倒入敞口的培养皿中，并将整株幼苗或切下的叶片漂浮于液体表面5分钟。组织应变得半透明，类似于玻璃化组织。

叶片在暴露于PFD后可能比之前颜色更深或更浅，这取决于光照条件以及所用组织的年龄。最后，用与空气平衡的PFD填充PDMS腔室，并小心地将组织样本从培养用培养皿转移至PDMS腔室中。用盖玻片密封载玻片并进行成像。

根据实验要求，将叶片在重组绿色荧光蛋白（GFP）悬浮液中孵育五分钟。通过PFD显微镜检查经PFD孵育的叶片样品显示，大多数气腔均被悬浮在PFD中的重组GFP充满。GFP呈绿色，红色代表叶绿素、自发荧光以及叶肉细胞的细节。

显然，在PFD中孵育后叶片被完全浸透，但偶尔仍会残留一些气泡。在这些条件下，水不会浸透叶片。此处，表达Venus（一种YFP变体）的opsys叶片被孵育并分别置于空气、水或PFD中进行激光扫描共聚焦显微观察，Venus定位于细胞质。样品的共聚焦显微成像结果显示，与空气和水相比，使用PFD成像深度大约提高了两倍。

在比较PFD和水时，一旦掌握，若操作得当，该技术可在5到10分钟内完成。进行此操作时，需注意外围的氟化液（perfluorodecalin, PFD）会溶解指甲油和聚四氟乙烯（Teflon），但与硅脂兼容。观看本视频后，您应能充分理解如何使用氟化十氢萘作为封片介质，以改善植物叶片细胞的成像效果。

请勿忘记，尽管全氟代脱脂剂无毒，我们仍建议在进行此操作时采用标准的安全防护措施。