Name: 在原位小鼠脑肿瘤模型结合放疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习原位胶质母细胞瘤小鼠模型的建立与放疗技术，掌握颅内细胞植入及疗效评估方法。该模型为脑肿瘤治疗研究提供可靠的活体实验平台，助力新疗法开发。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）院内研究计划资助。

一、细胞准备
<ol>
	<li>细胞在含10% FBS的DMEM中培养至约80%汇合度，使用一个225 cm²培养瓶3 每植入5只小鼠使用一个培养瓶。</li>
	<li>吸弃细胞培养液，加入 10 ml 不含钙和镁的 PBS 洗涤细胞，吸弃 PBS。</li>
	<li>用3 ml胰蛋白酶消化细胞，孵育10–15分钟，然后加入15 ml培养基中和胰蛋白酶。</li>
	<li>将所有细胞和培养基用移液器转移至一个50 ml离心管中。两个大培养瓶的细胞和培养基可放入同一个50 ml离心管。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1600 rpm 离心 7 分钟。彻底吸除上清液。用 10 ml 冷 PBS 重悬细胞，轻轻吹打混匀以洗涤细胞。确保细胞沉淀与 PBS 均匀混合。悬液应呈浑浊状。</li>
	<li>此时使用库尔特计数仪进行细胞计数。将细胞在4 °C条件下以1600 rpm离心7分钟。</li>
	<li>2分钟后nd 离心细胞，吸除所有PBS，再用1 ml PBS重悬。</li>
	<li>细胞在4 °C、3000 rpm条件下，以1 ml PBS重悬后离心10分钟。吸除PBS，再加入PBS调节终浓度至1×10⁶个细胞/ml。6 每5 μl含U87细胞的数量，其他细胞系可能需要不同的细胞数量和浓度以获得最佳的肿瘤生长效果。</li>
	<li>最终体积和浓度确定后，将细胞置于冰上，保存在离心管中。</li>
</ol>
II. 异种移植
<ol class="ualpha">
	<li>准备小鼠
	<ol>
		<li>使用氯胺酮/赛拉嗪/生理盐水混合物对小鼠进行腹腔注射麻醉。混合物包含每千克体重120 mg氯胺酮、16 mg隆朋（Rompun）及生理盐水。根据小鼠个体体重，每10 g体重注射0.1 ml。使用连接1 ml注射器的26G针头进行腹腔注射。小鼠约需15分钟进入无痛反应的睡眠状态。可通过轻捏足垫检查小鼠的疼痛反应。</li>
		<li>小鼠完全麻醉后，向其眼部涂抹眼膏，以防止角膜干燥。</li>
		<li>将小鼠置于立体定位仪的床板上，使其上门齿嵌入嘴部固定杆的凹槽中，然后将床板放入立体定位仪内。</li>
		<li>将鼻部固定器置于小鼠鼻部上方，以限制头部移动，同时将耳杆轻轻插入小鼠耳道。注意鼻部固定器和耳杆的固定力度不可过紧，以免导致颅骨骨折和/或影响小鼠呼吸。</li>
		<li>在此过程中，可借助立体定位仪上的刻度标记，确保小鼠头部保持水平。</li>
		<li>术前准备时，交替使用酒精和聚维酮碘对小鼠头部进行充分消毒，共重复3次酒精和3次碘处理。最后使用70%酒精棉片对头部进行一次最终擦拭。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>所有手术器械应在操作开始前通过高压灭菌或在70%乙醇中浸泡进行消毒。</li>
		<li>在颅骨顶部从右眼后方向左后方做一条斜行切口，切口长度约为10 mm至15 mm。</li>
		<li>使用棉签缓慢分离切口组织，暴露颅骨，并擦除覆盖在颅骨与皮肤之间的膜状组织。用棉签吸除出血，并密切观察是否有过度出血。</li>
		<li>充分暴露颅骨顶部以辨识前囟（bregma）。使用Hamilton注射器针尖定位前囟位置。钻孔的准确位置为前囟右侧2 mm、前方1 mm处（图2）。使用无菌购买的外科记号笔在颅骨上标记钻孔位置。请注意，该钻孔位置靠近前部缝合线。</li>
		<li>随后，使用固定在针插板上或穿过18G针头的22G针尖，在已标记的位置钻出颅骨小孔。</li>
		<li>用10 μl玻璃Hamilton注射器吸取5 μl细胞悬液。该Hamilton注射器容量为10 μl，配有固定的钝头30G至33G针头。在装样前务必充分混匀细胞，可通过移液器吹打或使用带25G针头的1 ml注射器反复抽吸实现。装样完成后，将注射器重新安装至定位臂，使其对准颅骨钻孔位置。</li>
		<li>将针头钝端缓慢下降至颅骨表面，待针头与颅骨表面齐平后，继续下放至颅骨表面下方3 mm深度。</li>
		<li>针头到达目标深度后，需停留2分钟，以避免针头对脑组织造成显著损伤。细胞植入速率为每分钟1 μl，总时长为6至8分钟，注意防止回流。细胞完全注入后，针头需继续留置2分钟，以确保所有细胞充分沉降。</li>
		<li>将针头从脑组织中缓慢拔出，并用棉签清洁钻孔部位。随后依次使用50%丙酮、100%乙醇和PBS对针头及注射器进行清洗，每种溶液清洗3次，顺序不可颠倒。</li>
		<li>此时可对颅骨部位的皮肤进行缝合。使用5-0 PBS缝线进行约3针缝合以关闭切口。</li>
		<li>将小鼠置于加热垫上使其苏醒，必要时再次涂抹眼膏。待小鼠自主活动（如抬头或肩部移动）后，可将其放回饲养笼中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
三、通过辐射和药物治疗IC植入物
<ol class="ualpha">
	<li>放射治疗
	<ol>
		<li>根据细胞系的不同，小鼠的治疗可在移植后5至7天进行。我科室使用深部X射线放射治疗仪进行放射治疗。</li>
		<li>可在随机分组前使用生物发光成像（BLI）、磁共振成像（MRI）或计算机断层扫描（CT）等影像技术对肿瘤进行可视化观察（图3A）。</li>
		<li>小鼠采用先前所述的氯胺酮/赛拉嗪/生理盐水混合物进行麻醉，并在眼睛上涂抹眼膏。</li>
		<li>将小鼠置于定制的放射定位装置中，该装置呈轮辐状排列，小鼠头部朝向中心。小鼠身体部分用铅板屏蔽以避免辐射。</li>
		<li>药物治疗可通过不同给药途径（如皮下、腹腔内或静脉注射）在放射治疗前或放射治疗期间给予。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
四、结果
小鼠应在麻醉注射后45-60分钟内从手术过程中苏醒。如果小鼠在手术后难以苏醒，且手术时间已超过1½小时，则小鼠可能无法恢复，此时安乐死可能是一种有效的替代方案。如果在手术过程中出现大量出血或颅骨发生破裂，建议实施安乐死。如果一切顺利，根据所使用的细胞系不同，肿瘤通常会在手术后2-4周内开始形成。在使用颅内异种移植模型时，治疗效果通常以植入后的生存期作为衡量指标5。然而，由于这是颅内模型，临床症状和体征将在死亡前出现。小鼠可能出现的一些身体体征包括弓背姿势、体重下降和活动减少。可能出现的一些神经学体征包括癫痫发作、头部倾斜和平衡能力丧失。图3B显示了濒死时肿瘤的苏木精-伊红（HE）染色结果。数据通过Kaplan-Meier生存曲线进行评估（图4）。计算并比较各组50%存活天数与对照组的差异。如果联合治疗组的生存时间长于单独放疗组与药物组生存时间的相加值，则表明联合治疗是成功的。
<img alt="用于神经科学实验中精确定位脑区的立体定位手术装置。" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 1"> 
图 1. Stoelting 立体定位仪。
<img alt="显示颅骨解剖结构的示意图，标注了前囟位置的测量数据，突出颅骨结构。" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠颅骨上钻孔位置的示意图。
<img alt="生物发光成像，动物受试者，第10天，强度标尺，研究分析。" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3A.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 3A"> 
图3A. GBM移植后生物发光成像（BLI）。
<img alt="组织学切片、脑组织横截面、显微镜图像、细胞结构分析。" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3B.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3B"> 
图3B. 小鼠死亡时GBM肿瘤的苏木精和伊红染色。
<img alt="含PARP抑制剂的IC植入物生存曲线；显示随时间变化治疗效果的折线图。" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图4"> 
图4. 术后7天注射PARP抑制剂的U87 IC植入物实验结果。

<ol><li>Bleau, A. M., Holland, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+the+mouse+genome+to+hunt+human+alternations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trapping the mouse genome to hunt human alternations.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7737-7738 (2007).</li>
<li>McGrady, B. J., McCormick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+intracranial+invasion%3A+morphological+observations+on+central+nervous+system+invasion+by+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A murine model of intracranial invasion: morphological observations on central nervous system invasion by melanoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 10, 387-393 (1992).</li>
<li>Fei, X., Zhang, Q., Dong, J., Diao, y, Wang, Z., Li, R., Wu, Z., Wang, A., Lan, Q., Zhang, S., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+clinically+relevant+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+metastatic+lung+cancer+and+glioblastoma+through+surgical+tumor+tissues+injection+with+trocar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of clinically relevant orthotopic xenograft mouse model of metastatic lung cancer and glioblastoma through surgical tumor tissues injection with trocar.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 29, 84-84 (2010).</li>
<li>Fujita, M., Zhu, X., Sasaki, K., Ueda, R., Low, K., Pollack, I., Okada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+STAT3+Promotes+the+Efficacy+of+Adoptive+Transfer+Therapy+Using+Type-1+CTLs+by+Modulation+of+the+Immunological+Microenvironment+in+a+Murine+Intracranial+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of STAT3 Promotes the Efficacy of Adoptive Transfer Therapy Using Type-1 CTLs by Modulation of the Immunological Microenvironment in a Murine Intracranial Glioma.</a> J. Immunol. 180, 2089-2098 (2008).</li>
<li>Candolfi, M., Curtin, J. F., Nichols, W. S., Muhammad, A. K. M. . G., King, G., Pluhar, G. D., McNiel, G. E., Ohlfest, E. A., Freese, J. R., Moore, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathlogical+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathlogical characterization and tumor progression.</a> J. Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li>
<li>Kaye, A., Morstyn, G., Gardner, I., Pyke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+xenograft+glioma+model+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a xenograft glioma model in mouse brain.</a> Cancer Research. 46, 1367-1373 (1986).</li>
<li>Zhao, Y., Xiao, A., diPierro, C., Carpenter, J., Abdel-Fattah, R., Redpath, G., Lopez, M., Hussaini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Extensive+Invasive+Intracranial+Human+Glioblastoma+Xenograft+Model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">An Extensive Invasive Intracranial Human Glioblastoma Xenograft Model.</a> American Journal of Pathology. 176, 3032-3049 (2010).</li>
<li>Learn, C., Grossi, P., Schmittling, R., Xie, W., Mitchell, D., Karikari, I., Wei, Z., Dressman, H., Sampson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+of+Intracranial+Tumors+in+a+Murine+Model+of+Glioma+Demonstrate+a+Shift+in+Gene+Expression+in+Response+to+Host+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis of Intracranial Tumors in a Murine Model of Glioma Demonstrate a Shift in Gene Expression in Response to Host Immunity.</a> J. Neuroimmunol. 182, 63-72 (2007).</li>
<li>Martens, T., Laabs, Y., Günther, H., Kemming, D., Zhu, Z., Witte, L., Hagel, C., Westphal, M., Lamszus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Glioblastoma+Growth+in+a+Highly+Invasive+Nude+Mouse+Model+Can+Be+Achieved+by+Targeting+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+but+not+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Glioblastoma Growth in a Highly Invasive Nude Mouse Model Can Be Achieved by Targeting Epidermal Growth Factor Receptor but not Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2.</a> Clin. Cancer Res. 14, 5447-5458 (2008).</li>
<li>Purow, B., Schiff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+glioblastoma%3A+are+we+reaching+critical+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of glioblastoma: are we reaching critical mass.</a> Nat. Rev. Neurol. 5, 419-426 (2009).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

恶性胶质瘤（如多形性胶质母细胞瘤）是最常见的原发性脑肿瘤，预后极差4。尽管在外科手术、放疗和化疗方面取得了进展，过去十年中胶质母细胞瘤（GBM）患者的生存期几乎未有改善（即诊断后约9-12个月）5。用于研究胶质瘤治疗的合适模型应具备以下特征：肿瘤位置可重复，细胞生长形成相对独立的肿瘤；细胞在组织学特征上应尽可能接近人类胶质瘤；肿瘤生长速率可预测，能够在组织培养中生长，且模型应采用小型动物以降低实验成本6。有效的治疗依赖于能够高度模拟人类GBM特征的实验模型，以用于测试新疗法，并准确理解胶质瘤广泛侵袭的分子基础7。对脑肿瘤生物学的研究也常规使用在体外（in vitro）培养或维持的细胞系来获取相关信息8。抑制肿瘤侵袭和血管生成是开发针对恶性胶质瘤新型治疗策略的主要目标之一9。由于胶质母细胞瘤治疗手段有限，科研人员正大力探索该致命癌症背后的遗传损伤，旨在开发出更具针对性和更有效的治疗方法10。

原位小鼠脑肿瘤模型中的联合放射治疗

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且最具侵袭性的成人原发性脑肿瘤1。近年来，在理解肿瘤侵袭机制方面已取得显著进展，而将肿瘤直接接种至脑内可提供在生理上适宜的环境中观察侵袭过程的机会2。就人类脑肿瘤而言，目前可用的原位模型通常通过立体定向注射细胞悬液，或通过复杂的开颅手术植入实体肿瘤组织来建立3。在我们的技术中，从组织培养中收获细胞，制备成细胞悬液后直接植入脑内。手术时间约为30分钟，由于小鼠需维持在持续的手术麻醉状态，因此使用注射型麻醉剂。将小鼠置于Stoetling公司制造的立体定位仪（图1）中。手术区域清洁准备后，进行切口，并定位前囟以确定开颅位置。开颅位置位于前囟右侧2 mm、头侧1 mm处。注射深度为颅骨表面下3 mm，细胞以每2分钟2 μl的速率注入。皮肤使用5-0 PDS缝线缝合，术后小鼠置于加热垫上苏醒。根据我们的经验，依据细胞系的不同，治疗可在术后7至10天开始。药物给药方式取决于药物的组成。对于放射治疗，需对小鼠进行麻醉并固定于定制的固定装置中。用铅板覆盖小鼠身体，仅暴露其脑部。对肿瘤发生机制的研究以及对GBM新疗法的评估，需要准确且可重复的脑肿瘤动物模型。因此，我们利用该原位脑模型研究脑微环境与肿瘤之间的相互作用，并评估不同治疗药物在单独使用或联合放疗时的疗效。

本文旨在介绍一种用于化疗放疗研究的原位胶质母细胞瘤模型。文章将详细阐述利用颅内模型进行小鼠细胞处理、移植及放射治疗的步骤。

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且最具侵袭性的成人原发性脑肿瘤1。近年来，在该疾病的……

本实验的总体目标是描述、展示并治疗植入小鼠脑内的胶质母细胞瘤细胞。首先制备细胞，然后将细胞植入小鼠脑内以实现该目标。手术完成后，脑内会形成肿瘤，可针对该肿瘤采用多种治疗方法进行实验研究。最终，生存曲线可以显示治疗是否有效。该技术的应用意义在于胶质母细胞瘤的治疗，因为它可能是一种比组织培养更有效的测试新疗法（如药物和放射治疗）的方法。首先将目标细胞（例如U 87细胞）培养至80%融合度。在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，一个225 cm³的培养瓶可提供足够接种五只小鼠的细胞数量。吸除细胞培养液后，用10 mL不含钙和镁的PBS轻轻洗涤细胞，并通过手动摇晃完成清洗。吸出洗涤液后，胰蛋白酶作用细胞 10 至 15 分钟，加入 15 毫升培养基以中和胰蛋白酶。随后将所有细胞和培养基转移至一个 50 毫升的锥形管中。两个培养瓶的细胞可放入同一根管中。以1600 RPM离心7分钟，通过抽吸完全去除上清液。将沉淀重悬于10毫升冷PBS中，轻轻吹打溶液使细胞均匀分散，形成均一的浑浊悬液。使用细胞计数仪测定细胞浓度后，为获得最佳肿瘤生长效果，重复PBS洗涤步骤。将U 87细胞的终浓度调整为每微升200,000个细胞。其他细胞系可能需要不同的浓度以获得最佳的肿瘤生长效果。细胞准备注射后，应置于冰上，并立即进行动物准备工作。开始准备小鼠，对宿主小鼠施加麻醉剂。约15分钟后，通过脚趾夹捏检测小鼠是否对疼痛无反应。确认麻醉成功后，在小鼠眼睛上涂抹眼膏，以防止眼睛干涩。然后将小鼠放置于立体定位仪的床板上，将其门齿钩入嘴部固定杆的凹槽中，再将床板置于立体定位仪框架内。现在，为了固定头部，先为小鼠戴上鼻夹，然后轻轻将耳棒插入耳道。注意不要将鼻夹或耳棒固定过紧，以免导致颅骨骨折或小鼠窒息。此时应检查头部是否保持水平。最后的准备工作是用酒精和碘液交替擦拭头部，每种溶液各擦拭三次，最后再用酒精进行第四次擦拭。开始植入手术时，从右眼后方起始，向左后方斜向切开颅骨。切口长度应约为10至15毫米。使用棉签缓慢分离切口，暴露颅骨，擦去颅骨与皮肤之间的膜状物，并吸干血液或过多的出血。现在观察脑内腹内侧杏仁核（bgma），并在其上方使用记号笔定位一支10微升玻璃Hamilton注射器。在bgma右侧2毫米、前侧1毫米处靠近前缝线的位置做一标记。现在移除注射器，并在标记的位置处用钻头在颅骨上钻一个小孔。钻头的尺寸与22号针头相同。让钻头自行缓慢钻入颅骨。无需施加额外压力。使用30至33号针头的注射器，吸取5 µL充分混匀的细胞悬液，然后将其重新连接至固定架。将针头对准颅骨上的孔，从颅骨表面垂直下降至颅骨表面。将针头降低三毫米，等待两分钟。此暂停可减少创伤风险。缓慢按压推杆，以每分钟约一微升的速度植入细胞。在所有细胞植入后，务必小心避免任何回流。将针头留在原位再持续两分钟，以使所有细胞充分沉降。称重后，缓慢

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医学

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脑肿瘤患者通常需要接受颅脑放射治疗，这种治疗虽然有益，但常常导致严重的认知功能障碍。这一尚未解决的严重问题目前在临床上尚无应对措施，因此推动了我们致力于开发基于干细胞的疗法，以恢复放射治疗引起认知功能下降。...

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颅内脑转移瘤建模因缺乏精确且及时监测肿瘤大小及治疗反应的方法而变得复杂。本研究所展示的方法将颅内肿瘤注射与磁共振成像分析相结合，从而实现精确且一致的注射操作、增强的动物监测以及准确的肿瘤体积测量。...

通过颅内注射与磁共振成像建立脑转移模型

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基于正电子发射断层扫描的剂量雕刻放射治疗在胶质母细胞瘤大鼠模型中的应用——使用小型动物放射研究平台

在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学...

多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

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使用立体定位仪建立脑肿瘤患者来源异种移植原位模型

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