Name: 利用反向遗传学操作的裂谷热病毒MP - 12菌株，以提高疫苗的安全性和有效性的NSS基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 了解利用反向遗传学技术构建裂谷热病毒MP-12株NSs基因突变体的实验方法，通过BHK-T7-9细胞转染和Vero E6细胞扩增，筛选干扰素抑制功能缺失的突变株，为开发更安全有效的减毒活疫苗提供候选毒株。

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本工作由西部卓越区域中心（WRCE）资助项目编号5 U54 AI057156-07、美国国家过敏与传染病研究所资助项目编号1 R01 AI08764301-A1，以及德克萨斯大学医学分部Sealy疫苗开发中心的内部资助共同支持。

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

我们无可披露内容。

多个研究团队通过利用T7启动子，已开发出针对裂谷热病毒（RVFV）的反向遗传学系统2,4,5 或小鼠3 或人类4 pol-I 启动子。在本文中，我们描述了一种利用 BHK/T7-9 细胞生成重组 RVFV MP-12 毒株的实验方案15 稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞。病毒拯救效率因BHK/T7-9细胞状态、质粒用量、转染细胞数量等因素而异。我们始终在Vero E6细胞中扩增P0代病毒，以获得高滴度的病毒储备液用于实验。对于I型干扰素应答功能完整的细胞（如人肺二倍体MRC-5细胞），只有当NSs蛋白能够通过抑制包括I型干扰素和PKR在内的抗病毒反应从而支持高效病毒复制时，才可用于病毒扩增。 
空斑试验是滴定MP-12及其NSs突变株的一种非常有用的方法。进行空斑试验时的一般注意事项是：在去除病毒接种液后，应立即在适当温度下加入覆盖物。结晶紫染色不适用于检测C13type病毒的空斑，因为C13type病毒不会破坏Vero E6细胞的单层结构2。另一方面，中性红染色能够成功检...

<table><tbody><tr><td>最低必需培养基（MEM）-alpha </td><td>Invitrogen</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 修饰的最低必需培养基 </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>改良Eagle培养基（MEM 2x） </td><td>Invitrogen</td><td>11935046</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 </td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B </td><td>Cellgro</td><td>30-240-CR</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨磷酸盐肉汤 </td><td>MP Biomedicals</td><td>1682149</td><td></td></tr><tr><td>贵族琼脂 </td><td>VWR international</td><td>101170-362</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1 </td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM </td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>防气溶胶密封盖 </td><td>Eppendorf</td><td>C-2223-25</td><td></td></tr><tr><td>0.33% 中性红溶液 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N2889-100ML</td><td></td></tr><tr><td>C57/WT MEF 细胞</td><td>Invitrogen</td><td>mef-c57wt</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素S</td><td>Invitrogen</td><td>Ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>Invitrogen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>BHK/T7-9 细胞&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt; </td><td>Gifu university, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vero E6 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

利用反向遗传学改造裂谷热病毒mp-12株的nss基因以提高疫苗的安全性和有效性

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）可导致人类出现出血热、神经系统疾病或失明，并在反刍动物中引发高流产率和胎儿畸形1，已被列为美国卫生与公共服务部（HHS）/美国农业部（USDA）重叠指定的管制病原体（select agent）以及生物安全三级（risk group 3）病原体。该病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）中的斐波病毒属（Phlebovirus），是该科中致病性最强的成员之一。自2006年以来，已陆续建立了针对RVFV MP-12疫苗株2,3以及包括ZH548和ZH501在内的野生型RVFV毒株4-6的多种反向遗传学系统。MP-12毒株属于生物安全二级病原体（risk group 2 pathogen），且不属于管制病原体（non-select agent），其M片段和L片段存在多个突变，因而毒力显著减弱，但仍携带具有致病性的S片段RNA3，该片段编码一种功能性毒力因子NSs。携带NSs开放阅读框（ORF）框内缺失69%的重组病毒rMP12-C13type（C13type）丧失了所有已知的NSs功能，但在缺乏I型干扰素（IFN）的VeroE6细胞中，其复制效率与MP-12相当。NSs可导致宿主转录全面关闭，包括干扰素（IFN）-β mRNA的转录抑制7,8，并在翻译后水平促进双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的降解9,10。IFN-β的转录上调依赖于干扰素调节因子3（IRF-3）、NF-κB和激活蛋白-1（AP-1）；IFN-β与IFN-α/β受体（IFNAR）结合后，可激活IFN-α基因或其他干扰素刺激基因（ISGs）的转录11，从而诱导宿主抗病毒反应；然而，尽管RVFV感染可激活IRF-3、NF-κB和激活蛋白-1（AP-1），NSs介导的宿主转录抑制（包括IFN-β基因）会阻断这些ISGs在病毒复制过程中的表达上调。因此，NSs是进一步减弱MP-12毒力、并通过消除IFN-β抑制功能来增强宿主先天免疫反应的理想靶点。本文描述了一种构建表达突变型NSs的重组MP-12病毒的实验方案，并提供了一种筛选无法抑制IFN-β mRNA合成的NSs突变体的方法示例。除了在先天免疫中的关键作用外，I型IFN还对树突状细胞的成熟及适应性免疫应答的启动具有重要作用12-14。因此，能够诱导I型IFN产生的NSs突变体不仅毒力进一步减弱，同时比野生型MP-12更能有效激发宿主免疫应答，使其成为疫苗开发的理想候选株。

用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs 突变株的实验方案。

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

裂谷热病毒（RVFV）可导致人类出现出血热、神经系统疾病或失明，以及家畜高比例的流产和胎儿...

该实验通过反向遗传学方法构建表达突变型 NSS 的裂谷热病毒 MP-12 株重组病毒，旨在对突变病毒的表型进行鉴定，以用于疫苗开发。首先，在稳定表达 T7 RNA 聚合酶的 BHK-T7 细胞中利用转染系统拯救重组 MP-12 株突变体，随后在 Vero E6 细胞中扩增所获得的重组 MP-12 突变病毒，并通过空斑实验测定扩增后 MP-12 突变体的滴度。该实验的最后一步是筛选不能抑制干扰素 α 或 β 产生的 NS 蛋白突变体。最终，该结果可促进利用反向遗传学系统制备裂谷热候选减毒活疫苗。与现有方法（如通过化学诱变剂或连续传代在病毒基因组中随机引入突变）相比，该技术的主要优势在于能够利用基因系统在病毒基因组中引入特定突变。该方法有助于解答裂谷热疫苗领域中的关键问题，例如主要毒力因子NSS在疫苗候选株免疫原性中的作用。通常情况下，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为裂谷热病毒的成块化及成块过程的可视化需要经过优化的技术。该方法的可视化演示至关重要，因为病毒回收和水化步骤较难掌握，且目前尚未见报道该方法的分步操作流程。使用六厘米培养皿，接种稳定表达T7 RNA聚合酶的T79细胞（婴儿仓鼠肾细胞），并在细胞融合度达到70%至80%时，将培养箱中的培养基更换为不含潮霉素B的完全MEMα培养基。一小时内开始转染操作，以回收裂谷热病毒。构建两组质粒，一组编码全长病毒基因组RNA，用于全长病毒RNA的表达；另一组编码病毒基因的开放阅读框，用于病毒蛋白的表达。现在，在1.5毫升离心管中加入30微升TransIT-LT1和385微升Opti-MEM。短暂涡旋混匀，室温孵育5分钟。在室温下，将所得脂质体逐滴缓慢加入经轻柔吹打混合的10微克质粒中，室温孵育15分钟。将转染混合物加入BHK T7 9细胞中，孵育24小时。弃去原培养上清，更换为完全MEM α培养基，继续培养4天。将培养上清液收集至50毫升离心管中，通过离心去除细胞碎片。现在将上清液转移至带螺旋盖的5毫升冻存管中，并将此P0代病毒储备液于-80摄氏度保存，以方便后续实验。在缺乏干扰素α和β基因的细胞中扩增P0代病毒：将Vero E6细胞培养至80%汇合度，使用完全DMEM培养基，弃去原培养基后加入稀释后的P0代病毒液，37℃孵育1小时。移除接种物，并在10毫升完全DMEM培养基中培养三至四天，直至Vero E6细胞出现明显的细胞病变效应。按前述方法收集上清液，并将样品命名为E6P1。使用六孔板，在完全DMEM培养基中将Vero E6细胞培养至80%汇合度。吸除Vero E6细胞的培养基，加入400微升十倍系列稀释的E6P1病毒悬液，孵育1小时。同时，为琼脂覆盖层准备两个15毫升试管。A管中加入7毫升含1.2%高贵琼脂的水溶液，B管中加入7毫升含2×完全MEM和10%三倍剂量磷酸盐肉汤的溶液。在水浴中放置15分钟后，将B管中的溶液倒入A管中，并用移液器将其充分混合。用A管和B管混合液（1:1）每孔2毫升替换病毒接种物。继续培养细胞3至4天。通过向A管和B管中加入1.2%的高贵琼脂（noble agar）和两倍完全MEM培养基以及中性红，制备螺杆覆盖层；另取第三根标记为中性红的试管。将A管放入42摄氏度水浴中，其余两管放入37摄氏度水浴中，孵育15分钟。随后将7毫升A管溶液、7毫升B管溶液和0.5毫升中性红混合，取2毫升混合液加入6孔板的每个孔中，并将该板过夜培养。现在确定每毫升中形成集落的单位数量。C57野生型小鼠胚胎成纤维细胞编码一种可被NF-κB以及IRF3或IRF7诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶基因。在此实验中，通过检测由天然免疫反应诱导的分泌活性，将亚汇合细胞接种于12孔板中，分别用编码NS突变的重组MP 12病毒或MP 12对照病毒感染细胞，37°C孵育1小时。弃去接种液，每孔加入1毫升完全DMEM培养基，继续培养14小时。收集培养上清用于分泌活性检测：向96孔板每孔加入200微升Quantum Blue底物溶液，再加入50微升各样品，密封后于37°C孵育1小时。使用酶标仪在650纳米处测量光密度（OD）。裂谷热病毒具有三片段的负链RNA基因组，其片段命名为S、M和L，与MP-12株的NSS相对应。C13型的开放读码框被截短了69%。通常，反向遗传系统可产生具有感染性的重组MP-12病毒，其滴度高于每毫升1 × 10⁶ PFU，即C13型病毒。缺乏 N' 蛋白功能的病毒会形成较大的混浊斑块，而 MP 12 则形成大小不一的清晰斑块，与感染后 14 小时的模拟感染细胞相比差异明显。MP 12 感染 C57 野生型甲细胞后，培养物中 seep 的水平未见升高。相比之下，C 13 型感染在感染后 14 小时诱导渗出水平升高。使用特异性针对小鼠 ISG 56 mRNA 的 RNA 探针进行的 Northern 印迹分析证实，在无 N'S 表达的情况下，ISG 56 mRNA 表达上调。采用该方法后续可进行小鼠免疫及中和抗体检测，以探究 NSS 突变体的免疫原性等问题。该技术为研究山谷热领域的研究人员探索感染细胞及动物体内非结构基因功能奠定了基础。请务必注意，操作感染性病毒可能极其危险，因此必须始终采取预防措施以避免吸入气溶胶。观看本视频后，您应能够充分理解如何回收和滴定重组 MP 12 毒株，以及如何筛选缺失干扰素 α/β 抑制功能的 NSS 突变体。

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利用反向遗传学操作的裂谷热病毒MP - 12菌株，以提高疫苗的安全性和有效性的NSS基因

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重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

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一种简化的反向遗传学方法用于拯救表达报告蛋白的重组轮状病毒

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利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

了解利用反向遗传学技术构建裂谷热病毒MP-12株NSs基因突变体的实验方法，通过BHK-T7-9细胞转染和Vero E6细胞扩增，筛选干扰素抑制功能缺失的突变株，为开发更安全有效的减毒活疫苗提供候选毒株。

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