Name: 利用反向遗传学操作的裂谷热病毒MP - 12菌株，以提高疫苗的安全性和有效性的NSS基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 了解利用反向遗传学技术构建裂谷热病毒MP-12株NSs基因突变体的实验方法，通过BHK-T7-9细胞转染和Vero E6细胞扩增，筛选干扰素抑制功能缺失的突变株，为开发更安全有效的减毒活疫苗提供候选毒株。

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本工作由西部卓越区域中心（WRCE）资助项目编号5 U54 AI057156-07、美国国家过敏与传染病研究所资助项目编号1 R01 AI08764301-A1，以及德克萨斯大学医学分部Sealy疫苗开发中心的内部资助共同支持。

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

我们无可披露内容。

多个研究团队通过利用T7启动子，已开发出针对裂谷热病毒（RVFV）的反向遗传学系统2,4,5 或小鼠3 或人类4 pol-I 启动子。在本文中，我们描述了一种利用 BHK/T7-9 细胞生成重组 RVFV MP-12 毒株的实验方案15 稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞。病毒拯救效率因BHK/T7-9细胞状态、质粒用量、转染细胞数量等因素而异。我们始终在Vero E6细胞中扩增P0代病毒，以获得高滴度的病毒储备液用于实验。对于I型干扰素应答功能完整的细胞（如人肺二倍体MRC-5细胞），只有当NSs蛋白能够通过抑制包括I型干扰素和PKR在内的抗病毒反应从而支持高效病毒复制时，才可用于病毒扩增。 
空斑试验是滴定MP-12及其NSs突变株的一种非常有用的方法。进行空斑试验时的一般注意事项是：在去除病毒接种液后，应立即在适当温度下加入覆盖物。结晶紫染色不适用于检测C13type病毒的空斑，因为C13type病毒不会破坏Vero E6细胞的单层结构2。另一方面，中性红染色能够成功检...

<table><tbody><tr><td>最低必需培养基（MEM）-alpha </td><td>Invitrogen</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 修饰的最低必需培养基 </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>改良Eagle培养基（MEM 2x） </td><td>Invitrogen</td><td>11935046</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 </td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B </td><td>Cellgro</td><td>30-240-CR</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨磷酸盐肉汤 </td><td>MP Biomedicals</td><td>1682149</td><td></td></tr><tr><td>贵族琼脂 </td><td>VWR international</td><td>101170-362</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1 </td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM </td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>防气溶胶密封盖 </td><td>Eppendorf</td><td>C-2223-25</td><td></td></tr><tr><td>0.33% 中性红溶液 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N2889-100ML</td><td></td></tr><tr><td>C57/WT MEF 细胞</td><td>Invitrogen</td><td>mef-c57wt</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素S</td><td>Invitrogen</td><td>Ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>Invitrogen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>BHK/T7-9 细胞&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt; </td><td>Gifu university, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vero E6 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

利用反向遗传学改造裂谷热病毒mp-12株的nss基因以提高疫苗的安全性和有效性

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）可导致人类出现出血热、神经系统疾病或失明，并在反刍动物中引发高流产率和胎儿畸形1，已被列为美国卫生与公共服务部（HHS）/美国农业部（USDA）重叠指定的管制病原体（select agent）以及生物安全三级（risk group 3）病原体。该病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）中的斐波病毒属（Phlebovirus），是该科中致病性最强的成员之一。自2006年以来，已陆续建立了针对RVFV MP-12疫苗株2,3以及包括ZH548和ZH501在内的野生型RVFV毒株4-6的多种反向遗传学系统。MP-12毒株属于生物安全二级病原体（risk group 2 pathogen），且不属于管制病原体（non-select agent），其M片段和L片段存在多个突变，因而毒力显著减弱，但仍携带具有致病性的S片段RNA3，该片段编码一种功能性毒力因子NSs。携带NSs开放阅读框（ORF）框内缺失69%的重组病毒rMP12-C13type（C13type）丧失了所有已知的NSs功能，但在缺乏I型干扰素（IFN）的VeroE6细胞中，其复制效率与MP-12相当。NSs可导致宿主转录全面关闭，包括干扰素（IFN）-β mRNA的转录抑制7,8，并在翻译后水平促进双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的降解9,10。IFN-β的转录上调依赖于干扰素调节因子3（IRF-3）、NF-κB和激活蛋白-1（AP-1）；IFN-β与IFN-α/β受体（IFNAR）结合后，可激活IFN-α基因或其他干扰素刺激基因（ISGs）的转录11，从而诱导宿主抗病毒反应；然而，尽管RVFV感染可激活IRF-3、NF-κB和激活蛋白-1（AP-1），NSs介导的宿主转录抑制（包括IFN-β基因）会阻断这些ISGs在病毒复制过程中的表达上调。因此，NSs是进一步减弱MP-12毒力、并通过消除IFN-β抑制功能来增强宿主先天免疫反应的理想靶点。本文描述了一种构建表达突变型NSs的重组MP-12病毒的实验方案，并提供了一种筛选无法抑制IFN-β mRNA合成的NSs突变体的方法示例。除了在先天免疫中的关键作用外，I型IFN还对树突状细胞的成熟及适应性免疫应答的启动具有重要作用12-14。因此，能够诱导I型IFN产生的NSs突变体不仅毒力进一步减弱，同时比野生型MP-12更能有效激发宿主免疫应答，使其成为疫苗开发的理想候选株。

用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs 突变株的实验方案。

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

裂谷热病毒（RVFV）可导致人类出现出血热、神经系统疾病或失明，以及家畜高比例的流产和胎儿...

该实验通过反向遗传学方法构建表达突变型 NSS 的裂谷热病毒 MP-12 株重组病毒，旨在对突变病毒的表型进行鉴定，以用于疫苗开发。首先，在稳定表达 T7 RNA 聚合酶的 BHK-T7 细胞中利用转染系统拯救重组 MP-12 株突变体，随后在 Vero E6 细胞中扩增所获得的重组 MP-12 突变病毒，并通过空斑实验测定扩增后 MP-12 突变体的滴度。该实验的最后一步是筛选不能抑制干扰素 α 或 β 产生的 NS 蛋白突变体。最终，该结果可促进利用反向遗传学系统制备裂谷热候选减毒活疫苗。与现有方法（如通过化学诱变剂或连续传代在病毒基因组中随机引入突变）相比，该技术的主要优势在于能够利用基因系统在病毒基因组中引入特定突变。该方法有助于解答裂谷热疫苗领域中的关键问题，例如主要毒力因子NSS在疫苗候选株免疫原性中的作用。通常情况下，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为裂谷热病毒的成块化及成块过程的可视化需要经过优化的技术。该方法的可视化演示至关重要，因为病毒回收和水化步骤较难掌握，且目前尚未见报道该方法的分步操作流程。使用六厘米培养皿，接种稳定表达T7 RNA聚合酶的T79细胞（婴儿仓鼠肾细胞），并在细胞融合度达到70%至80%时，将培养箱中的培养基更换为不含潮霉素B的完全MEMα培养基。一小时内开始转染操作，以回收裂谷热病毒。构建两组质粒，一组编码全长病毒基因组RNA，用于全长病毒RNA的表达；另一组编码病毒基因的开放阅读框，用于病毒蛋白的表达。现在，在1.5毫升离心管中加入30微升TransIT-LT1和385微升Opti-MEM。短暂涡旋混匀，室温孵育5分钟。在室温下，将所得脂质体逐滴缓慢加入经轻柔吹打混合的10微克质粒中，室温孵育15分钟。将转染混合物加入BHK T7 9细胞中，孵育24小时。弃去原培养上清，更换为完全MEM α培养基，继续培养4天。将培养上清液收集至50毫升离心管中，通过离心去除细胞碎片。现在将上清液转移至带螺旋盖的5毫升冻存管中，并将此P0代病毒储备液于-80摄氏度保存，以方便后续实验。在缺乏干扰素α和β基因的细胞中扩增P0代病毒：将Vero E6细胞培养至80%汇合度，使用完全DMEM培养基，弃去原培养基后加入稀释后的P0代病毒液，37℃孵育1小时。移除接种物，并在10毫升完全DMEM培养基中培养三至四天，直至Vero E6细胞出现明显的细胞病变效应。按前述方法收集上清液，并将样品命名为E6P1。使用六孔板，在完全DMEM培养基中将Vero E6细胞培养至80%汇合度。吸除Vero E6细胞的培养基，加入400微升十倍系列稀释的E6P1病毒悬液，孵育1小时。同时，为琼脂覆盖层准备两个15毫升试管。A管中加入7毫升含1.2%高贵琼脂的水溶液，B管中加入7毫升含2×完全MEM和10%三倍剂量磷酸盐肉汤的溶液。在水浴中放置15分钟

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用反向遗传学操作的裂谷热病毒MP - 12菌株，以提高疫苗的安全性和有效性的NSS基因

诺如病毒是胃肠炎的主要病因之一，但针对其进行表征的分子技术仍相对较新。本文报道了两种不同的反向遗传学方法，可高效拯救小鼠诺如病毒（MNV），该病毒是此类病毒中唯一可在细胞培养中增殖的成员。...

反向遗传学介导的小鼠诺如病毒的感染性恢复

从克隆的cDNA中拯救重组沙粒病毒，这一方法被称为反向遗传学，可使研究人员探究特定病毒基因产物及其不同结构域和残基在沙粒病毒生物学多个方面所起的作用。同样，将反向遗传学技术应用于经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于疫苗开发的细胞系（Vero）中，为研制有效且安全的疫苗以对抗人类致病性沙粒病毒提供了新的可能性。...

在 FDA 批准的 Vero 细胞中生成用于疫苗开发的重组沙粒病毒

近年来，为了开发新的疫苗和治疗载体等应用，人们对新城疫病毒（NDV）进行了广泛研究。这些研究得以实现，得益于从cDNA中拯救重组病毒的技术，例如本文所描述的方法。...

从cDNA拯救重组新城疫病毒

本文介绍了一种构建感染性细菌人工染色体的实验方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组RNA的全长cDNA。该方案可用于构建其他正链RNA病毒的功能性cDNA，因此是研究病毒生物学的有力基因组学工具。...

细菌人工染色体：正链RNA病毒功能基因组学研究的工具

痘苗病毒（VV）已广泛应用于生物医学研究及人类健康改善。本文介绍一种利用CRISPR-Cas9系统对VV基因组进行编辑的简单且高效的方法。...

一种构建突变型痘苗病毒载体的简单高效方法

我们报告采用一种人工内含子小RNA表达策略来开发非缺陷型重组病毒 埃及伊蚊 浓核病毒（AaeDV） 体内 递送系统。本文详细描述了rAaeDV载体的构建、包装和定量分析以及幼虫感染的完整实验流程。...

利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析

火鸡疱疹病毒（HVT）被广泛用作重组疫苗的载体平台，以预防多种禽类疾病。本文介绍了一种简单且快速的重组HVT载体疫苗制备方法，该方法结合了NHEJ-CRISPR/Cas9与Cre-Lox系统。...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组禽疱疹病毒载体

我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）的方法，以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案，这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。...

重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

通过质粒DNA拯救重组轮状病毒，为研究轮状病毒的复制机制、致病过程以及开发轮状病毒表达载体和疫苗提供了重要工具。本文介绍一种简化的反向遗传学方法，用于生成重组轮状病毒，包括表达荧光报告蛋白的病毒株。...

一种简化的反向遗传学方法用于拯救表达报告蛋白的重组轮状病毒

本方法利用宿主范围选择及重组病毒的可视化鉴定，实现“无痕”重组痘苗病毒的构建。...

利用宿主范围与可视化筛选快速无缝构建重组痘病毒

本方案描述了一种通过结合使用易错PCR合成全长突变RNA和反向遗传学技术，在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法提供了一个表型筛选模型，可用于长达10...

利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

了解利用反向遗传学技术构建裂谷热病毒MP-12株NSs基因突变体的实验方法，通过BHK-T7-9细胞转染和Vero E6细胞扩增，筛选干扰素抑制功能缺失的突变株，为开发更安全有效的减毒活疫苗提供候选毒株。

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

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