Name: 随后的三维颅内植入在体内 /em生物发光成像鼠脑胶质瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学习使用立体定向植入术和生物发光成像技术建立小鼠颅内胶质瘤模型。该方法利用GL261细胞和IVIS系统实时追踪肿瘤生长，为神经肿瘤学研究提供可靠的活体成像工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢 Joshua B. Rubin 博士慷慨提供慢病毒系统的质粒，同时感谢 Mahil Rao 在制备 GL261-luc 细胞过程中提出的有益建议。
我们感谢学生支持脑肿瘤研究组织（SSBTR）、巴罗神经病学基金会和华莱士基金会的慷慨支持。
动物实验严格按照圣约瑟夫医院和医疗中心机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。

1. 细胞培养
<ol>
 <li>GL26细胞系购自马里兰州弗雷德里克的美国国家癌症研究所（NCI）癌症治疗与诊断部（DCTD）。为了定量测量肿瘤生长速率，使用Lentiphos HT系统（Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA）和Lenti-X HT包装混合物（Clontech Laboratories, Inc.）以及FUW-GL质粒（由J.B. Rubin博士实验室慷慨提供）使GL261细胞具有生物发光性。细胞在含10%无四环素胎牛血清（FCS；Clontech Laboratories, Inc.）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。此外，GL261细胞还使用pGL4.51[luc2/CMV/Neo]载体（Promega Corp, Madison, WI）和FuGENE 6转染试剂（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）稳定转染了编码luc2的基因，操作按照制造商指定条件进行。luc2基因是萤火虫荧光素酶的密码子优化版本，其发光强度显著高于标准luc基因。稳定转染细胞在含有10% FCS和100 μg/ml遗传霉素（G418, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）的DMEM培养基中进行筛选和维持培养。</li>
 <li>植入前，将培养的细胞通过胰酶消化收获，用无血清DMEM洗涤一次，并以1 × 107 个细胞/ml的浓度重悬于无血清DMEM中。</li>
</ol>
2. 手术准备 2
<ol>
 <li>手术全程保持无菌环境，包括所有外科器械、耗材、手套、手术单等。</li>
 <li>十周龄的C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr（白化C57BL/6）小鼠购自美国国家癌症研究所弗雷德里克动物繁育项目（NCI，Frederick，MD），实验时平均体重为20克。</li>
 <li>动物通过腹腔注射赛拉嗪（5 mg/kg）、氯胺酮（50 mg/kg）和丁丙诺啡（0.05 mg/kg）进行麻醉。手术开始前，通过夹捏脚趾检查以确认动物是否达到充分麻醉状态。动物任何部位出现活动（即使轻微）均提示麻醉深度不足，应立即追加注射赛拉嗪3.3 mg/kg和氯胺酮26.6 mg/kg。使用照明灯及无菌敷料覆盖动物身体以维持体温。</li>
 <li>动物被适当麻醉后，将其置于立体定位仪（David Kopf Instruments 公司，Model 900 Small Animal Stereotaxic）的软垫床面上［图1］。</li>
 <li>在角膜上涂抹少量（约1/4英寸）AKWA Tears眼用润滑软膏。</li>
 <li>将动物置于立体定位仪中，用食指和拇指打开其口腔，使其上门齿滑入立体定位仪前端的凹槽内。拧紧夹具以固定动物头部，确保头部对齐且双眼居中，但需注意避免对动物头部施加过度压力。</li>
 <li>O2 导管在动物鼻孔附近用胶带固定。氧气流速为0.5 l/min。</li>
 <li>将下背部和尾巴用胶带固定在立体定位仪床面上，注意不要影响呼吸。</li>
 <li>手术切口部位剃毛。使用聚维酮碘棉签从两眼之间向后至两耳之间区域进行碘消毒，注意避免碘液滴入动物眼睛。</li>
 <li>细胞在手术前立即进行移植准备，并需定期混匀以防止沉降。</li>
 <li>A 10 μl，50 mm 世界精密仪器公司（World Precision Instrument, WPI），佛罗里达州萨拉索塔，配备26号斜面针头的注射器中装入细胞接种物。如果细胞出现聚集现象，可能需要重新装填注射器。</li>
 <li>的 10 μl 注射器随后被装入UMP3-1 UltraMicroPump微量注射器（WPI，Sarasota，FL）。</li>
</ol>
3. 颅内植入 2
<ol>
 <li>使用15号手术刀片和有齿镊进行皮肤切口。从动物两眼之间开始，沿纵轴向耳部方向做一长度为10–15 mm的切口，暴露前囟（颅骨顶部矢状缝与冠状缝的交界处）。务必准确定位前囟，因其容易与位于前囟远端的鼻窦区域混淆 [图2]。</li>
 <li>动物麻醉后，在切口内注射0.25%（2.5 mg/ml）布比卡因。</li>
 <li>在前囟后方0.1 mm、中线右侧2.3 mm处，用手缓慢旋转一支16号、1½英寸长的针头，轻柔施加压力，边旋转边钻孔，直至穿透颅骨并暴露脑组织，形成钻孔。</li>
 <li>使用微驱动立体定位注射器支架将注射针缓慢下移至目标位置，直至针尖轻触脑表面。从此位置起，将针头进一步推进至脑内深度3 mm处，并保持该位置3分钟。</li>
 <li>将针头回撤0.4 mm，使针尖最终位于脑表面下2.6 mm深处，以形成一个用于细胞注射的小腔隙。此时可选择性拍摄动物X射线图像，以确认针头位置和深度是否正确。</li>
 <li>使用微量注射泵，以667 nL/分钟的流速，在3分钟内注入2000 nL（2 μL）细胞悬液。</li>
 <li>针头保留在原位2分钟，以防止注射部位发生液体渗漏。</li>
 <li>缓慢完全撤出针头。</li>
 <li>使用Penfield剥离器将骨蜡填入钻孔中以封闭骨孔。</li>
 <li>使用4-0（1.5公制）Vicryl缝线缝合皮肤切口，确保皮肤无明显间隙。Vicryl是一种可吸收缝线材料，因此在切口愈合后无需拆除缝线。</li>
 <li>术后将动物置于笼中，并放置于加热灯下，调节灯的高度，使笼底表面温度维持在30°C。当动物完全清醒（以在笼内正常活动为判断标准）后，将其恢复群养。术后5天内，在其饮水中添加口服布洛芬。将100 mg儿童用布洛芬（100 mg/5 ml）加入标准473 ml的啮齿类动物水瓶中。每日观察动物状态，并每3天进行一次成像和称重。植入后第两周起，观察频率增加至每日两次。当动物出现健康状况恶化迹象（包括弓背姿势、活动减少及明显体重下降（≥20%））时实施安乐死。这些症状是已发表的肿瘤反应表现，通常在因肿瘤导致死亡前约1天内可重复性地出现。</li>
</ol>
4. 在体 生物发光成像 3
<ol>
 <li>启动 [Living Image] 软件。</li>
 <li>通过点击控制面板右下角的 [Initialize IVIS System] 按钮来启动 IVIS 成像系统。</li>
 <li>在控制面板左上角选择[发光]成像模式。</li>
 <li>为了确定荧光素注射后成像的最佳时间，有必要进行动力学研究［图3］。本描述针对的是萤火虫荧光素酶；
 <ol class="lalpha">
 <li>注射 10μl/g 将D-荧光素（D-luciferin，15 mg/ml，溶于PBS中；Caliper Life Sciences 目录号 XR-1001 或其他供应商的类似产品）按如下所述注入动物体内。</li>
 <li>等待3分钟，然后将小鼠放入气体麻醉室中进行麻醉（使用含2%异氟烷的气体）2).</li>
 <li>关闭腔室的气体麻醉，打开麻醉阀和IVIS多通管路的真空。立即将镇静后的动物置于温度可控的成像平台，确保小鼠鼻部正确插入气体麻醉多通管路中。首次成像应在注射荧光素后约5分钟进行。IVIS Spectrum仪器一次最多可同时成像5只动物。若成像动物少于5只，可封闭未使用的多通管路以节约异氟烷气体。</li>
 <li>继续每3分钟拍摄一次图像，创建长达一小时的序列，以生成荧光素酶表达的动力学曲线。
 <ol>
 <li>单击控制面板上的 [Sequence Setup] 按钮。</li>
 <li>序列编辑器出现。</li>
 <li>在控制面板中，设置序列中第一张生物发光图像的参数。
 <ol class="lroman">
 <li>我们建议从中等 binning 开始。</li>
 <li>我们还建议使用自动曝光功能来确定最佳曝光时间。</li>
 <li>在序列编辑器中选择[Delay]按钮，并设置每次采集之间3分钟的延迟时间。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>在序列编辑器中点击[Add]，采集参数将被添加到表格中。</li>
 <li>对序列中的每张图像重复步骤4。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>一旦曲线建立，可通过绘制信号强度（光强）随时间变化的图像来确定最佳成像时间。在信号强度最高时对动物进行成像。 体内 光子计数以获得最强且最准确的信号。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>早期实验采用腹腔内（i.p.）注射荧光素酶底物，但腹腔注射偶尔导致结果不稳定，表现为肿瘤中几乎没有或完全没有生物发光信号。我们推测，信号偶尔随机缺失的原因可能是荧光素酶底物被输送至肠道或其他内脏器官所致。因此，我们开始改用皮下（s.c.）注射荧光素酶底物，结果发现成像的可重复性显著提高［图3］。</li>
 <li>皮下注射后20分钟，将动物置于含2%异氟烷气体的麻醉舱内进行麻醉2 直到它们无反应为止。</li>
 <li>将麻醉后的动物转移至成像室。由于动力学研究的成像时间较长，应使用眼用软膏。其他成像操作因持续时间较短，无需使用。</li>
 <li>使用中等二分模式采集图像，曝光时间为5分钟。也可使用自动采集选项。</li>
 <li>如果中等 binning 条件下的信号出现饱和和/或过弱，可调整 binning 或曝光时间。</li>
 <li>程序文件及后续的图像注释将保存在用户的计算机目录中。</li>
</ol>
5. 三维成像 3
<ol>
 <li>在控制面板的 [Sequence Setup] 窗口中，点击 [Imaging Wizard] 选项卡。</li>
 <li>在成像向导的起始界面选择 [Bioluminescence] 成像模式，然后点击 [Next]。</li>
 <li>在成像向导的“Bioluminescence - DLIT”窗口中，选择 [Firefly] 报告探针。所选萤火虫光源光谱的发射/激发曲线将显示，并附带需采集的六个相应滤光片选项。</li>
 <li>最后一个界面将显示默认设置，包括自动曝光采集参数和视野 C。默认设置通常效果良好；但如有需要，可进行修改。</li>
 <li>点击 [Next]，序列编辑器窗口将自动填充六个光谱区域的序列（滤光片宽度为 20 nm，分别为 560 nm、580 nm、600 nm、620 nm、640 nm 和 660 nm）。按下 [Acquire Sequence]。第一个滤光片（560 nm）将使用激光检流计投射结构光图案，以建立表面形貌。</li>
 <li>在工具面板中选择 [Surface Topography] 选项卡。可在重建过程中应用表面平滑处理，以消除产生的尖锐角度。建议使用默认的低平滑度设置。</li>
 <li>点击 [Create]，将出现断层分析框。绘制一个包含整个动物的裁剪框，然后点击 [Next]。</li>
 <li>阈值工具将以紫色掩膜覆盖所选区域。掩膜应自动与动物照片匹配。如有必要，可调整掩膜的阈值，使其更准确地贴合动物轮廓。</li>
 <li>点击 [Finish]，重建的网格将显示。重建结果可在结果选项卡中保存。</li>
 <li>完成动物表面形貌构建后，进入工具面板中的 [DLIT 3D Reconstruction] 下拉菜单。</li>
 <li>在 [Analyze] 选项卡下，选择全部六个波长以执行重建。取消选择产生饱和像素或计数低于 600 的图像。[Parameters] 选项卡中的设置保持默认。</li>
 <li>在 [Properties] 选项卡下，“Muscle”应为组织属性的默认选项，“Firefly”应为光源光谱的默认选项。</li>
 <li>在 Analyze 选项卡下点击 [Reconstruct]，动物表面的三维重建图像及相应的信号源重建结果将显示 [图 4]。</li>
 <li>为确定信号位置和强度，请在工具面板的 3D Tools 选项卡中选择 Voxels 按钮。
 <ol>
 <li>在所有显示的体素周围绘制一个方框，总体通量测量值将显示在体积选项卡底部。</li>
 <li>点击 [Center of Mass] 以确定所选体素的信号位置。动物的冠状面、矢状面和横断面切片将显示，使用 [Measurement Cursor Display] 可测量从动物表面到体素中心的距离。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>有关器官图谱的共配准及其他高级功能的更多信息，请参阅 Living Image 软件用户手册。</li>
</ol>
6. 数据分析 3
<ol>
 <li>图像采集并保存后，点击[浏览]按钮并选择文件，以访问程序文件。</li>
 <li>可在[查看] → [图像信息]下找到图像信息。</li>
 <li>通过点击[ROI 工具]按钮选择感兴趣区域（ROI），可对信号强度进行定量分析。请确保在图像控制面板左上角的下拉列表中选择“光子”模式，以在[光子]模式下进行图像分析。</li>
 <li>从“类型”下拉列表中选择[测量 ROI]按钮。选择所需的 ROI 形状，选项包括圆形、方形或网格。确保覆盖所采集图像中所有强度区域。</li>
 <li>通过将 ROI 形状拖动至包含生物发光信号的区域，来设定 ROI 的位置。</li>
 <li>点击[测量]按钮可计算 ROI 的信号强度。ROI 标签将显示强度值。可使用 Living Image 软件对 ROI 进行管理与保存。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
在手术当天使用IVIS成像系统能够检测到移植的细胞时，表明细胞移植成功。GL261-luc和GL261-luc2细胞均可被检测到，但luc2基因可产生更高水平的生物发光信号［图5］。植入后不久拍摄的图像可能在动物的爪子和鼻部出现非特异性信号，应将其视为背景信号而忽略。位于移植部位的信号是真实的，并且信号强度会随时间逐渐增强［图6］。第6天信号强度的下降现象可重复出现，最可能的原因是部分移植细胞未能成功形成肿瘤。肿瘤负荷的定量测量结果具有可重复性，信号应持续稳定上升，直至动物最终因疾病死亡。然而，肿瘤生长曲线在很大程度上取决于移植细胞的状态以及移植操作中难以避免的微小差异。本实验室选择每三天对移植动物进行一次成像。
<img alt="立体定位手术装置示意图；装置包括注射器、暴露的颅骨和调节旋钮。" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 小鼠充分麻醉后，将其置于立体定位仪中。使用口腔夹固定小鼠头部。
<img alt="立体定位手术装置示意图，显示通过前囟、冠状缝和矢状缝确定针头位置。" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 打开皮肤后，识别主要解剖标志，包括前囟、冠状缝和矢状缝。在前囟右侧 2.3 mm 处，通过缓慢旋转一根 16 号 1½ 英寸的针头并施加轻微压力，钻出钻孔，直至穿透颅骨并暴露脑组织。
<img alt="生物发光时间进程，腹腔内与皮下光子计数图，每3分钟间隔。" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 

图3. 对皮下注射（<img src="/files/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg" alt="静态平衡，ΣF=0，梁结构示意图，展示张力与压力。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3.1">）与腹腔注射（<img src="/files/ftp_upload/3403/3403fig3_2.jpg" alt="静态平衡；ΣFx=0示意图；梁平衡装置；力分布。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3.2">）两种途径给予荧光素酶底物（luciferin）进行了动力学比较，以验证皮下注射的应用价值，并确定给药后最佳成像时间点。在注射荧光素酶底物3分钟后，将小鼠麻醉并置于IVIS Spectrum仪器中，前60分钟内每3分钟成像一次，之后每6分钟成像一次，以生成生物发光的动力学曲线。结果显示，在本实验条件下，使用GL261-luc细胞时，皮下给药途径优于腹腔注射，且动物成像的最佳时间点约为注射荧光素酶底物后25分钟。
<img alt="核成像、PET扫描、小鼠模型、颜色标尺、放射性示踪剂分布分析图。" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4. GL261-luc2细胞颅内植入后三维重建的多个视角，与小鼠骨骼和脑组织共同配准。
<img alt="显示GL261-luc体内光子计数与植入后天数关系的生物发光图。" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 来自GL261-luc细胞与GL261-luc2细胞所形成肿瘤的光子计数结果。数据为5只动物的平均值。
<img alt="体内光子计数图，植入后天数，光学成像及数据分析" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6. GL261-luc 肿瘤细胞在白化C57BL/6小鼠体内生长曲线图。每3天测量一次生物发光信号，并绘制为 体内 光子计数与植入后天数的关系。照片显示了不同时间点的生物发光情况。颜色表示生物发光强度（像素强度），其与肿瘤细胞数量成正比（右侧显示颜色标尺）。动物因疾病死亡后，取出脑组织并局部添加荧光素，以获取 离体 图中插图所示的图像。

<ol><li>Candolfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li>
<li>Stafford, P., Abdelwahab, M. G., do, K. im, Preul, Y., Rho, M. C., M, J., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ketogenic+diet+reverses+gene+expression+patterns+and+redudes+reactive+oxygen+species+levels+when+used+as+an+adjuvant+therapy+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">The ketogenic diet reverses gene expression patterns and redudes reactive oxygen species levels when used as an adjuvant therapy for glioma.</a> Nutr Metab. 7, (2010).</li>
<li>Caliper Life Sciences, Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Living+Image+Software+Version+4.0.+VivoVision+Systems%22">Living Image Software Version 4.0. VivoVision Systems</a>. , (2010).</li>
<li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 2nd Ed, Academic Press. (2001).</li>
<li>Jouanneau, E., Poujol, D., Gulia, S., Le, M. I., Blay, J. Y., Belin, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+are+essential+for+priming+but+inefficient+for+boosting+antitumour+immune+response+in+an+orthotopic+murine+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells are essential for priming but inefficient for boosting antitumour immune response in an orthotopic murine glioma model.</a> Cancer Immunol Immunother. 55, 254-267 (2006).</li>
</ol>

本文的免费访问由 Caliper Life Sciences 赞助。

在脑表面下创建一个0.4 mm的孔隙后，将细胞接种物注入脑组织深度2.6 mm处。为确保针头位置和深度准确，可使用C型臂或类似的X射线影像增强设备进行X光检查；但此步骤为可选。若动物未得到适当麻醉，则可能在细胞注射过程中发生移动，从而引发手术并发症。这可能导致细胞混合液泄漏或针道出血。细胞泄漏可导致肿瘤细胞异位生长。此外，应注意避免穿刺脑室，若钻孔位置过于偏向内侧（偏离本方案所述的2.3 mm位置），则可能发生此类情况4。通过向小鼠脑内注入2 µl亚甲蓝染料并解剖脑组织以观察染料分布，可验证针头定位及细胞扩散是否准确。
在本实验方案中，我们使用了IVIS Spectrum 体内成像系统以及专为该仪器设计的Living Image软件（版本4.0）（Caliper Life Sciences）。任何性能相当的体内成像系统和图像分析工具均可用于获得类似结果。与传统的磁共振成像（MRI）相比，这些系统在监测实验性颅内肿瘤生长方面具有一些优势。最明显的是两种仪器的相对成本——动物用MRI设备昂贵得多，通常还需要专业MRI技术人员的操作。而本文所述的体内成像可由最终使用者自行完成。生物发光数据具有定量性，而MRI数据的定量分析则耗时且不够精确。此外，MRI图像不仅显示肿瘤细胞，还显示水肿和炎症，因此很难区分肿瘤本身与治疗效应。由于这些原因，准确获取生长中肿瘤的体积测量数据可能具有挑战性。生物发光依赖于ATP，因此只有存活的肿瘤细胞才会对肿瘤大小的数据有贡献。尽管如此，若具备条件，MRI仍具有一些优势。细胞无需标记生物发光探针即可通过MRI可视化。能够观察肿瘤周围水肿可能对某些实验方案具有优势。这两种技术的一个共同优点是，使用其中一种并不排除同时使用另一种，因此当研究人员可同时获得这两种技术时，可从同一只动物身上获取肿瘤生长数据以及肿瘤周围水肿和炎症的信息。

<table><tbody><tr><td>GL261-luc2 Bioware Ultra</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>GL261-luc2</td><td> </td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Invitrogen</td><td>10313039</td><td> </td></tr><tr><td>遗传霉素（G418）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11811-023</td><td> </td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td> </td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td> </td></tr><tr><td>C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr 小鼠</td><td>美国国家癌症研究所</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>AKWA Tears 润眼膏</td><td>Akorn 公司</td><td>17478-062-35</td><td> </td></tr><tr><td>氯胺酮盐酸盐（Ketaset）</td><td>惠氏动物保健</td><td>11570775</td><td> </td></tr><tr><td>赛拉嗪（盐酸赛拉嗪）</td><td>惠氏动物健康</td><td>10031894</td><td> </td></tr><tr><td>小型动物立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>900</td><td> </td></tr><tr><td>UltraMicroPump 配 SYS-Micro4 控制器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>若无法获得，则可进行手动输注</td></tr><tr><td>10&amp;mu;l 带26号斜面针头的注射器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SGE010RNS</td><td> </td></tr><tr><td>阿迪森持针钳</td><td>世界精密仪器公司</td><td>500092</td><td> </td></tr><tr><td>佩恩菲尔德分离器</td><td>Codman</td><td>65-1015</td><td> </td></tr><tr><td>16g 1&amp;frac12; 精密滑动针</td><td>BD 生物科学</td><td>305198</td><td> </td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>BD Biosciences</td><td>371030</td><td> </td></tr><tr><td>15号刀片</td><td>BD 生物科学</td><td>371315</td><td> </td></tr><tr><td>4-0薇乔缝合线</td><td>Ethicon 公司</td><td>VCP496G</td><td> </td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>Medline Industries</td><td>DYNJBW25</td><td> </td></tr><tr><td>聚维酮碘棉签棒</td><td>Medline Industries</td><td>MD93901</td><td> </td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>122796</td><td> </td></tr><tr><td>异氟烷（异氟醚）</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>1001936060</td><td> </td></tr><tr><td>OPMI Pentero 显微镜</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td>任何外科显微镜均可满足要求</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS Spectrum，可选配麻醉系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

颅内植入及后续三维成像 体内 小鼠胶质瘤的生物发光成像

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

小鼠胶质瘤261（GL261）被公认为一种 体内 一种能够重现人类多形性胶质母细胞瘤（GBM）多种特征的模型系统。该细胞系最初是通过将3-甲基胆蒽注入C57BL/6同系小鼠品系的颅内而诱导产生的。 1因此可使用免疫功能健全的C57BL/6小鼠。尽管本研究采用GL261细胞系，但以下实验方案适用于任何颅内小鼠肿瘤模型的植入与监测。GL261细胞经基因工程改造，可稳定表达萤火虫荧光素酶（GL261-luc）。我们还通过将CMV启动子驱动的luc2基因稳定转染，构建了发光更强的GL261-luc2细胞系。为消除黑色皮肤和毛发对光信号的衰减，实验中使用了来自马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所的C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr小鼠（C57BL/6的白化变体）。采用白化C57BL/6小鼠后； 体内 使用 IVIS Spectrum 进行成像 体内 成像系统可从植入当天开始进行成像（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA）。GL261-luc 与 GL261-luc2 细胞系表现出相同 体内 行为与亲本GL261细胞一致。该小鼠模型与人类胶质母细胞瘤（GBM）共有的组织学特征包括：肿瘤坏死、假栅栏样结构、新生血管形成、浸润性生长、细胞密度增高以及炎症反应。 1.
植入前，动物通过腹腔注射给予氯胺酮（50 mg/kg）、赛拉嗪（5 mg/kg）和丁丙诺啡（0.05 mg/kg）进行麻醉，随后置于立体定位仪中，并在颅骨中线处用手术刀做一切口。在前囟后方0.1 mm、中线右侧2.3 mm处钻孔，将针头插入至深度3 mm后回撤0.4 mm，最终深度为2.6 mm。在3分钟内注入2 μl GL261-luc或GL261-luc2细胞（107 细胞/ml）。用骨蜡封闭钻孔，缝合切口。
立体定向移植后，自移植当天即可检测到生物发光细胞，并可利用IVIS Spectrum仪器的3D图像重建功能对肿瘤进行分析。成像前20分钟，动物皮下注射150μg luciferin/kg体重。通过随时间变化的平均肿瘤生物发光强度来定量肿瘤负荷。携带肿瘤的小鼠每日观察其发病情况，当出现以下一种或多种症状时实施安乐死：精神萎靡、无法自主活动、蜷缩姿势、无法自我理毛、厌食导致体重下降&gt;10%。所有动物在尸检时均可见明显肿瘤。

将GL261细胞颅内植入C57BL/6小鼠可诱导生成恶性胶质瘤，其特征与人类多形性胶质母细胞瘤的多种典型特征相似。我们采用稳定表达荧光素酶的GL261细胞，以便通过体内成像技术监测肿瘤进展过程。本文展示了手术操作及三维体内成像方法。

小鼠胶质瘤261（GL261）被公认为一种体内模型系统，能够重现人类多形性胶质母细胞瘤（GBM）的多种特征。

本实验的总体目标是建立一种可定量追踪的胶质瘤颅内模型，通过活体成像技术对肿瘤进展进行长期监测。首先，获取并培养具有生物发光特性的胶质瘤细胞，制备浓度为每毫升1×10⁷至2×10⁷个细胞的单细胞悬液。实验的第二步是将收获的细胞通过立体定位技术植入小鼠脑部的右侧额叶。随后向动物体内注射荧光素（Luciferian），并生成荧光素表达的动力学曲线。利用IVUS光谱活体成像系统，该实验的最后一步是对动物进行连续成像，以追踪肿瘤的生长情况。最终可获得结果显示肿瘤细胞的生长情况，以及通过IVUS光谱活体成像系统可检测到的生物发光信号实现肿瘤的三维定位。与现有方法（如磁共振成像）相比，该技术的主要优势在于生物发光成像仅能识别活的肿瘤细胞，且无需专门培训的磁共振技术人员。此外，该方法可在较短时间内同时对多只动物进行成像。此方法有助于回答神经肿瘤学领域的一些关键问题，例如新型脑肿瘤疗法的有效性如何。在体内，尽管该方法可为脑肿瘤的研究提供见解，但也适用于其他器官系统，如肺、前列腺和肝癌。为准备该操作，将至少三微升胶质瘤细胞接种液装入一支10微升、50毫米长的注射器中，配26号斜面针头。确保细胞没有聚集在一起，否则可能需要重新装填注射器。将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中，并使用口腔夹固定小鼠头部，如图所示。将装有细胞的注射器插入微注射装置中。开始手术操作时，使用15号刀片和有齿镊进行皮肤切口。在动物两眼之间向耳部方向做一道10至15毫米的切口，暴露bgma。务必准确定位bgma。此处容易与位于bma远端的窦区相混淆。使用16号、1.5英寸的针头，在冠状缝后0.1毫米、中线右侧2.3毫米处钻孔，钻孔时一边施加轻微压力一边旋转针头，直至穿透颅骨并暴露脑组织。随后，使用微量注射器移动注射针，直至针尖刚好接触脑表面。从此位置开始，将针头继续推进至深度达3毫米处。将针头保持原位三分钟。接着，将针头回撤0.4毫米，使其在脑表面下方的总深度达到2.6毫米。这样可形成一个小的空腔，用于细胞灌注，以确保细胞放置位置和深度的准确性。可使用C形臂获取针头深度的X射线图像，使用微量注射器以每分钟667纳升的输注速率，在3分钟内注入2000纳升的细胞悬液。输注完成后，将针头留置原位2分钟，以防止输注部位发生渗漏。随后缓慢完全撤出针头。拔出针头后，使用 Penfield 剥离器将骨蜡覆盖在骨孔上。最后，用 4-0 Vicryl 缝线缝合切口，确保皮肤无较大缝隙。体内实验。使用 IVIS Spectrum 成像系统进行生物发光成像。启动 Living Image 软件，并通过点击控制面板右下角的“初始化 IVIS 系统”按钮来初始化 IVIS Spectrum 成像系统。在控制面板左上角选择发光成像模式，以确定生物发光成像的最佳时间。动物注射荧光素后，需先在成像舱内对麻醉状态下的动物进行动力学研究。在注射荧光素约五分钟后采集第一张图像，以生成荧光素酶表达的动力学曲线。设置成像序列，每三分钟采集一次图像，持续一小时。单击控制面板中的序列设置按钮。在控制面板中，为序列中的第一张生物发光图像指定设置，从中等亮度和自动曝光开始。建议通过测定最佳曝光时间来确定最优曝光条件。在序列编辑器中选择延迟按钮，并设定每次采集之间的延迟时间为三分钟。单击“添加”后，序列编辑器中的采集参数将被添加到表格中。在建立曲线后，对序列中的每张图像重复此步骤。通过绘制信号强度随时间变化的曲线，可确定最佳成像时间，以获得最强且最准确的信号。应在体内光子数达到最高时对动物进行成像，根据该曲线显示，此时间约为注射荧光素酶底物后25分钟。为获取实验动物的图像，使用采集时间下的自动选项。该功能允许软件确定采集图像所需的分帧模式及最佳时长。将程序文件及后续的图像注释保存至用户计算机的目录中。开始进行3D成像时，使用成像向导选择萤火虫荧光报告探针。在生物发光成像窗口中，选择“下一步”，屏幕上将显示六个待采集的光谱选项，选择“采集序列”，图像将根据表面拓扑选项卡下的相应设置进行采集。在工具面板中，将照片遮罩调整为与动物轮廓相匹配。为了创建动物表面拓扑结构的重建网格，请转至工具面板上的 DLI 3D 重建选项卡，并选择适当的图像采集数据以进行信号重建。确保在组织属性中列出肌肉，光源光谱中列出萤火虫。单击分析选项卡下的“重建”按钮，即可显示动物表面的三维重建图像以及相应的信号源重建图像。在获取并保存图像后，即可开始数据分析。通过点击“浏览”按钮并选择文件，访问程序文件。图像信息可在“查看图像信息”中找到。通过选择感兴趣区域（ROI）工具按钮，对信号强度进行定量分析。通过选择“光子”模式，确保图像在光子模式下进行分析。在图像控制面板左上角的下拉列表中，从类型下拉列表中选择测量ROI按钮，并选择所需的ROI形状。可选形状包括圆形、方形和网格。通过拖动感兴趣区域（ROI）形状选择工具，将其置于包含生物发光信号的区域。确保覆盖所获取图像上的所有强度区域。最后，点击测量按钮以计算该感兴趣区域的信号强度。ROI 标签会显示。无论细胞是否转染了 luc 或 luc2 基因，只要在手术当天通过生物发光成像能够检测到植入的细胞，即表明细胞成功植入。该图追踪了在白化 C57BL/6 小鼠体内 GL261-luc 肿瘤细胞的生长情况，每三天测量一次生物发光信号，并以体内光子计数对植入后天数作图。照片显示了在不同时间点的生物发光情况。颜色变化指示生物发光强度，其强弱与肿瘤细胞数量相关。当动物出现疾病或健康状况不佳时，将实施安乐死。尽管这不是这些分析的标准步骤，但仍可将脑组织解剖取出，并在表面直接添加荧光素酶底物，以获得离体成像结果。此操作必须在动物处死后立即进行，因为生物发光反应需要三磷酸腺苷（ATP）。该图比较了由GL261-lux细胞和GL261-L2细胞形成的肿瘤所获得的光子计数。来自五只动物的平均结果显示，L2基因可提供更高水平的生物发光信号。下图展示了GL261-L2细胞颅内移植的三维重建图像的多个视角，该图像与小鼠的骨骼和脑部结构共同进行了图像配准。此外，还对皮下注射与腹腔注射进行了动力学比较：在注射荧光素酶底物（Lucifer）3分钟后，对小鼠进行麻醉，并每3分钟成像一次，持续至1小时，之后每6分钟成像一次，以生成生物发光的动力学曲线。如图所示，皮下注射荧光素酶底物（以红色表示）的效果优于腹腔注射（以黑色表示），动物成像的最佳时间点约为注射荧光素酶底物后25分钟。一旦掌握，该手术技术若操作得当，可在一小时内完成。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如 MRI 或荧光成像）以回答更多问题。例如，肿瘤周围是否存在水肿，或肿瘤内部及周边正在发生哪些其他分子或生化改变。观看本视频后，您应能充分掌握如何进行颅内植入及小鼠胶质瘤细胞的三维活体成像。

intracranial-implantation-with-subsequent-3d-vivo-bioluminescent

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

随后的三维颅内植入在体内</em生物发光成像鼠脑胶质瘤

可通过颅内接种在裸鼠体内建立表达荧光素酶的人脑肿瘤异种移植模型，并利用生物发光成像技术对肿瘤生长及治疗反应进行后续监测。结合生存分析，生物发光监测是针对脑肿瘤治疗方案开展临床前研究的重要工具。...

建立颅内脑肿瘤异种移植模型并利用生物发光成像分析肿瘤生长及治疗反应

在乳腺癌脑转移小鼠模型中，利用生物发光成像技术监测缺氧诱导因子-1α活性，以观察颅内肿瘤缺氧的发展过程。...

in vivo 生物发光成像技术在小鼠模型中对乳腺癌脑转移瘤缺氧动态的观察

我们介绍一种集成方法，用于将人多形性胶质母细胞瘤细胞精确、立体定向地植入裸鼠脑内，并进行后续系列 体内...

立体定向颅内植入与 体内 多形性胶质母细胞瘤小鼠模型系统中肿瘤异种移植的生物发光成像

来源：Clark, A.J., 等. 胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像。J. Vis. Exp.

免疫活性小鼠胶质母细胞瘤模型的生物发光成像

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

GL261 胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤提供了一种有用的免疫活性动物模型。本方案旨在演示利用颅内肿瘤生长监测的正确技术 体内...

胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像

肿瘤细胞的原位颅内注射已广泛应用于癌症研究，以探讨脑肿瘤的生物学特性、进展过程、演化规律及治疗反应。本文介绍了肿瘤异种移植模型的荧光分子断层成像技术，该技术可实现临床前胶质母细胞瘤模型中肿瘤组织的实时活体成像与定量分析。...

荧光分子断层成像技术 在体 内 胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

我们描述了将经携带双报告基因载体（表达荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP））转导的人类神经前体细胞移植至小鼠脑实质内的方法。移植后，利用活体成像系统反复检测荧光素酶信号。 体内 利用荧光显微镜在脑组织切片中鉴定表达生物发光和GFP的移植细胞。...

颅内移植与 体内 小鼠大脑中人神经前体细胞的生物发光示踪

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。...

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

本实验方案的目的是为研究人员提供一种高度可重复的颅内植入技术。...

小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

学习使用立体定向植入术和生物发光成像技术建立小鼠颅内胶质瘤模型。该方法利用GL261细胞和IVIS系统实时追踪肿瘤生长，为神经肿瘤学研究提供可靠的活体成像工具。

颅内植入及后续三维成像体内小鼠胶质瘤的生物发光成像

探索更多视频

颅内植入及后续三维成像 体内 小鼠胶质瘤的生物发光成像

探索更多视频

颅内植入及后续三维成像体内小鼠胶质瘤的生物发光成像