随后的三维颅内植入在体内

该程序的总体目标是创建一个神经胶质瘤的颅内模型，该模型可以随着时间的推移进行体内成像的定量跟踪。这是通过首先收获，通过发光镜像神经胶质瘤细胞培养并制备每毫升 10 至 7 个细胞的 1 到 2 倍的细胞悬液来实现的。该程序的第二步是将收获的细胞立体定向植入小鼠大脑的右额叶。

随后将 Luciferian 皮下注射到动物中并生成 Luciferian 表达的动力学曲线。使用 IVUS 光谱活体成像系统，该程序的最后一步是连续对动物进行成像并跟踪肿瘤生长。最终，可以通过使用 IVUS 光谱体内成像系统检测的生物发光信号获得显示肿瘤细胞生长和肿瘤 3D 定位的结果。

与 MRI 等现有方法相比，该技术的主要优点是生物发光成像仅识别活的肿瘤细胞，不需要经过专门培训的 MRI 技术人员。它还允许在更短的时间内同时对动物进行成像。这种方法可以帮助回答神经肿瘤学领域的关键问题，例如脑肿瘤的新疗法的疗效如何。

在体内，虽然这种方法可以提供对脑肿瘤的了解。它也可以应用于其他器官系统，例如肺癌、前列腺癌和肝癌。为了准备此程序，将至少 3 微升神经胶质瘤细胞接种物装入带有 10 号斜面针头的 50 微升、50 毫米注射器中。

确保细胞没有聚集在一起，或者可能需要重新加载注射器。将麻醉的鼠标放置在立体定向框架中，并使用嘴夹固定鼠标头，如图所示。将加载的注射器放入微型注射器中。

要开始外科手术，请使用 15 号刀片和齿钳做一个皮肤切口。在动物的眼睛之间做一个 10 到 15 毫米的切口，向动物的耳朵移动，露出 bgma。请务必正确识别 bgma。

它很容易与 BMA 远端的窦区混淆。用 16 号一英寸半的针头，在冠状缝线后 0.1 毫米处制作针孔，在中线右侧 2.3 毫米处，同时扭转直到穿透头骨并暴露大脑，使用微型注射器移动注射针头，直到它刚好接触大脑表面。从这个位置，将针推进到 3 毫米的深度。

将针头保持在原位 3 分钟。接下来，将针头抽出 0.4 毫米至大脑表面以下 2.6 毫米的总深度。这会创建一个小口袋，将细胞注入其中，以确保正确的位置和深度。

可以使用 C 型臂拍摄针头深度的 X 射线图像，使用设置为 2000 纳升体积的微量注射器在三分钟内注入细胞悬液，输注速率为每分钟 667 纳升。输注后，将针头引导到位两分钟，以防止输注部位渗漏。然后慢慢地完全抽出针头。

拔出针头后，使用 Penfield 解剖器用骨蜡覆盖钻孔。最后，使用 4 oh Vicryl 缝合线缝合切口，确保皮肤上没有留下大缝隙。体内。

使用 IVIS Spectrum 成像系统进行生物发光成像。启动活体影像软件，然后单击控制面板右下角的初始化 IVIS 系统按钮来初始化 IVIS 光谱成像系统。选择控制面板左上角的发光成像模式，以确定生物发光成像的最佳时间。

注射动物路西法后，有必要首先在成像室中对镇静动物进行动力学研究。在 Lucifer 注射后大约 5 分钟拍摄第一张图像，以生成 Luciferian 表达的动力学曲线。创建一个序列以每 3 分钟拍摄一次图像，最长持续一小时。

单击控制面板中的 sequence setup 按钮。在控制面板中。指定序列中第一个生物发光图像的设置，从中等弯曲和自动曝光开始。

要确定最佳曝光，建议留出时间。在序列编辑器中选择延迟按钮，并指定每次采集之间的延迟时间为 3 分钟。单击序列编辑器中的 add，然后将采集参数添加到表中。

建立曲线后，对序列中的每个图像重复此步骤。最佳成像时间可以通过绘制信号强度与时间的关系来确定，以获得最强和最准确的信号。应在体内光子计数最高时对动物进行成像，即路西法注射后约 25 分钟，如该曲线所示。

要获取实验动物的图像，请使用 acquisition time （采集时间） 下的 auto 选项。这允许软件确定 bin 和获取图像的最佳时间长度。将程序文件和后续图像注释保存在用户的计算机目录中。

要开始 3D 成像，请使用成像向导选择 firefly reporter 探针。在生物发光 delit 窗口下，选择下一步，要采集的六个光谱选择将出现在屏幕上，选择采集序列，并使用表面形貌选项卡下的相应设置拍摄图像。在工具调色板中，遮罩照片以适合动物的轮廓。

要创建动物表面形貌的重建网格，请继续使用工具调色板上的 DLI 3D 重建选项卡，然后选择适当的图像采集以进行信号重建。确保 muscle 列在 tissue properties 下，firefly 列在 source spectrum 下。单击分析选项卡下的重建，动物表面的 3D 重建和信号源的相应重建应该会出现。

数据采集后，可以通过单击浏览按钮并选择文件来获取和保存图像、访问程序文件。图像信息可以在 View image information （查看图像信息） 下找到。通过选择感兴趣区域或 ROI 工具按钮来量化信号的强度。

通过选择 photon，确保在 photon 模式下分析图像。在图像控制面板左上角的下拉列表中，从类型下拉列表中选择测量 ROI 按钮，然后选择感兴趣的 ROI 形状。选项包括 circle、square 和 / 或 grid。

通过将 ROI 形状选择拖动到包含生物发光信号的区域来设置 ROI 位置。确保覆盖采集图像上的所有强度区域。最后，单击 measure 按钮以计算 ROI 的信号强度。

此时将显示 ROI 标签。当植入的细胞在手术当天通过生物发光成像可以检测到时，无论细胞是否转染了 luck 或 luck two 基因，成功细胞植入的强度都是显而易见的。该图跟踪了 GL 2 6 1 幸运肿瘤细胞的生长情况，在白化病患者 C 57 黑六小鼠生物发光中，每三天测量一次，并绘制为体内光子计数与植入后天数的关系。

照片显示了不同时间点的生物发光。着色是生物发光的指标，它与肿瘤细胞数量有关。动物在生病或福利不佳时被安乐死。

虽然不是这些分析的标准部分，但可以解剖大脑，并且可以局部添加路西法以获得性活体图像。这必须在动物被处死后立即进行，因为生物发光反应需要 TP。该图比较了从 GL 2 6 1 lux 细胞与 GL 2 6 1 L 两个细胞产生的肿瘤中获得的光子计数。平均 5 只动物的结果表明，L 2 基因提供了更高水平的生物发光。

下图显示了 GL 2 6 1 L 两个细胞颅内植入的三维重建的多个视图，与小鼠、骨骼和大脑共配准。注射路西法后 3 分钟还进行了皮下注射和腹膜内注射的动力学比较，小鼠镇静并每三分钟成像一次，最多持续一小时，之后每 6 分钟一次，以产生生物发光的动力学曲线。如此处所示，红色所示的 Lucifer 给药皮下根部优于黑色所示的腹膜内注射，并且对动物进行成像的最佳时间是 Luciferian 注射后约 25 分钟。

一旦掌握，如果作得当，手术技术可以在一小时内完成。在此程序之后，可以执行其他方法，例如 MRI 或荧光成像，以回答其他问题。例如，肿瘤周围是否存在水肿，或者肿瘤内部和周围发生了哪些其他分子或生化变化。

看完这个视频，你应该对如何进行颅内植入和泥沼胶质瘤细胞的 3D 体内成像有了很好的了解。