Name: 通过细胞周期激酶和磷酸酶活性成比例的FRET监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 学习使用FRET技术实时监测细胞周期中激酶和磷酸酶活性变化的方法。该技术利用CFP和YFP荧光蛋白探针在U2 OS细胞中实现活细胞成像，为研究细胞周期调控机制提供可视化工具。

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作者们得到了瑞典研究理事会、瑞典战略研究基金会、瑞典癌症协会、瑞典儿童癌症协会、Åke Wiberg基金会和Jeanssons基金会的支持。

1. 将探针引入细胞
<ol>
 <li>使用基于FRET的探针和赋予抗性的质粒共转染细胞。选择一种在目标细胞类型中高效的转染方法。对于U2OS细胞，标准的磷酸钙转染方法可获得足够理想的结果15。</li>
 <li>使用适当的抗生素对细胞进行至少七天的筛选。此步骤可富集表达探针的细胞，并减少表达水平具有毒性或严重影响细胞周期的细胞数量。</li>
 <li>（可选）筛选稳定克隆。</li>
 <li>利用固定细胞或活细胞，验证所有细胞中CFP和YFP均以大致相同的比例存在。</li>
 <li>若部分细胞仅含有CFP或YFP，则可能发生重组。重组可能发生在细菌扩增期间，也可能在探针转染后发生，后者可能与质粒质量有关。若问题持续存在，请重复质粒制备过程，并在转染前将质粒线性化。</li>
</ol>
2. 监测比率型FRET
<ol>
 <li>将细胞接种于玻璃底培养皿或用于腔室固定的盖玻片上，确保培养皿或盖玻片为1.5号（厚度为170 μm）。</li>
 <li>将细胞置于含无酚红培养基的腔室中，固定于带有温度控制的电动倒置荧光显微镜上，温度设定为37 °C。通过CO2或使用不含CO2的培养基（如Liebowitz-15培养基）确保培养基的pH稳定。</li>
 <li>使用透射光对细胞进行聚焦。切勿使用荧光光路观察细胞。</li>
 <li>首先使用YFP激发（YFPex）和YFP发射（YFPem）滤光片以及合适的二向色镜，采集12位或16位图像。选择尽可能高的像素合并（binning）模式，同时仍能保证所需的亚细胞分辨率。采用高像素合并以缩短曝光时间或降低光照强度，对避免光毒性至关重要。</li>
 <li>通过测量无细胞区域的像素值，估算背景强度及大致噪声水平，包括粗略的平均值、最小值和最大值。调整曝光时间及中性密度滤光片，使细胞内的平均信号强度约为背景强度加上5至10倍的背景最大值与最小值之差。</li>
 <li>确认图像未接近饱和状态。图像中的最大强度应低于动态范围的一半（例如，在12位图像中最大值不超过2000），以便在细胞进入有丝分裂时仍能分辨强度变化。</li>
 <li>重复步骤2.4至2.6，改用CFP激发和YFP发射滤光片以及合适的二向色镜。</li>
 <li>选择多个转染细胞区域（排除步骤2.4至2.7中使用的区域），并确保所有细胞中的最大强度均低于动态范围的一半。</li>
 <li>开始延时成像实验，每45分钟使用YFPex-YFPem和CFPex-YFPem滤光片组合各采集两幅图像。</li>
</ol>
3. 验证并优化条件
<ol>
 <li>打开获取的图像，监测表达转染探针的细胞从一次有丝分裂到下一次有丝分裂的细胞周期时间。</li>
 <li>将测得的细胞周期时间与所用细胞类型的已发表数据进行比较。或者，通过每小时仅采集一次透射光图像（例如微分干涉差（DIC）或相差图像），对未转染的细胞进行成像，以获得参考的细胞周期时间。</li>
 <li>如果从一次有丝分裂到下一次有丝分裂的时间与参考细胞周期时间相符，则进入步骤4。否则，使用更强的曝光条件、增加时间点数量或多个z平面进行重新成像，并重复步骤3。</li>
 <li>如果从一次有丝分裂到下一次有丝分裂的时间与参考细胞周期时间不符，则通过每小时仅采集一次透射光图像（例如DIC或相差图像），并在实验结束时再采集一幅图像以识别转染细胞，对转染细胞进行成像。</li>
 <li>如果转染细胞仍表现出较长的细胞周期时间，则重复步骤1，但减少探针的转染量，或筛选仅含极低探针表达量的稳定克隆。</li>
 <li>如果转染细胞在无荧光光照条件下表现出正常的细胞周期时间，则重复步骤2，但通过调整像素合并（binning）、中性密度滤光片、曝光时间以及图像间的时间间隔来降低曝光强度。</li>
</ol>
4. 分析FRET
<ol>
 <li>该分析可由大多数专用于显微镜的软件完成。此处我们介绍如何使用免费软件 ImageJ 进行分析（<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a>) 利用插件 Ratio Plus (<a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html</a>).</li>
 <li>在 ImageJ 中打开图像。如果您的图像是多色堆叠格式（例如 Deltavision），请先将其转换为超堆叠，然后分离各个通道： 图像超堆栈到超堆栈 随后使用以下方法将它们拆分为单通道图像序列： 图像-超堆栈-降低维度</li>
 <li>使用以下方法将YFPex - YFPem图像堆栈乘以3： 过程-数学-乘法 此步骤为可选，仅用于提高图像的视觉清晰度，通过确保比值不在 0 到 1 的范围内来实现。</li>
 <li>在YFPex - YFPem图像叠加图中，于无细胞但靠近待测细胞的区域绘制感兴趣区域（ROI）。同一图像中的不同细胞可能需要不同的区域，因为背景和信号强度通常在图像中心最强。</li>
 <li>将 ROI 添加到 ROI 管理器： 分析工具-ROI管理器.</li>
 <li>测量YFPex - YFPem和CFPex - YFPem图像堆栈中ROI的平均强度： 分析-测量.</li>
 <li>在多个时间点重复操作，并验证靠近目标细胞的背景强度在整个胶片中保持一致。</li>
 <li>设置测量参数以包含最小强度： 分析-设置测量-最小和最大灰度值</li>
 <li>绘制一个覆盖细胞大部分区域的兴趣区域，测量YFPex - YFPem和CFPex - YFPem图像堆栈中的最小强度。将测得的最小强度与步骤4.6中获得的背景强度之差除以二，由此得到一个剪切值的初始估计。</li>
 <li>开放比率增强功能。选择YFPex - YFPem和CFPex - YFPem图像序列。进行FRET比率分析时，将CFPex - YFPem设为序列1；对于磷酸化后FRET效率降低的探针，进行反向FRET比率成像时，将YFPex - YFPem设为序列1。</li>
 <li>插入测得的背景强度值和裁剪值。</li>
 <li>设置所得比率图像的缩放比例，并应用适当的查找表（LUT）以可视化比率变化。</li>
</ol>
5. 代表性结果
Plk1 的活性最早在 G2 期的细胞核中可见，并在有丝分裂期间达到峰值。图 3 展示了一项使用如第 2 节所述的最低光毒性条件进行的实验。请注意，此结果为典型的初步数据，可通过调整曝光条件或图像间的时间间隔来提高信噪比或时间分辨率。图 3D 显示，大多数表达探针的细胞增殖时细胞周期时间为 20 至 25 小时，表明成像条件和探针表达水平并未影响细胞周期时程。尽管存在明显的背景噪声，Plk1 活性在 G2 期上升并在有丝分裂期达到峰值的趋势仍清晰可见14（图 3A）。对原始数据进行处理，例如通过均值滤波以显影图形式呈现（图 3B），或对平均倒置比值进行定量分析（图 3C），可增强结果的清晰度。
<img alt="激酶-磷酸酶循环示意图，蛋白质调控，酶作用，磷酸化过程。" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 基于FRET的探针监测激酶和磷酸酶活性的原理。两个荧光团（通常为CFP（蓝色）和YFP（绿色））通过一个磷酸结合结构域（橙色）和一个可磷酸化序列（黄色）连接。磷酸化（红色）介导与磷酸结合结构域的结合，从而诱导探针发生构象变化。该构象变化导致两个荧光团之间的距离或取向发生变化，进而影响CFP与YFP之间的FRET效率。FRET可通过激发CFP并监测YFP的发射（虚线）来可视化。
<img alt="质粒转染过程示意图、落射荧光显微镜、FRET比率分析步骤。" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 实验流程示意图。
<img alt="延时成像以及蛋白质表达和有丝分裂进入的图表，荧光数据分析。" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3. Plk1 活性在 G2 期首先于细胞核中可见，并在有丝分裂期间达到峰值。表达基于 FRET 的 Plk1 活性探针9,14的 U2OS 细胞使用配备 20x NA 0.7 空气物镜和汞灯的 Deltavision Spectris 成像系统进行为期 60 小时的拍摄。成像条件的选择旨在造成最小的光毒性，如第 2 节所述，采用 4x 二乘二合并（binning）以及可阻挡 99% 入射光的中性密度滤光片。A，经过四次分裂的一个细胞的倒置 FRET 比值的伪彩色表示。B，对 A 中所示细胞应用均值滤波后的时空图（kymograph）。C，A 中所示细胞倒置 FRET 比值的定量分析。D，50 个表达 FRET 探针细胞的累计有丝分裂进入情况，包括子代细胞的分裂事件。

<ol><li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+microscopy+in+2010%3A+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li>
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<li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li>
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<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

在整个细胞周期中监测FRET时，需要考虑一些因素，而这些因素在评估对外部刺激的短期反应时则不那么重要。首先，细胞周期进程容易受到应激信号通路的干扰，因此必须将光毒性降至最低。其次，所有报告分子都可能通过结合并消耗激酶、磷酸酶或相互作用结构域而影响细胞内的正常过程。评估实验条件是否合适的最直接方法，可能是测量从一次有丝分裂到下一次有丝分裂的细胞周期时长，并将其与不依赖荧光成像和探针表达的实验结果进行比较。
在整个细胞周期中监测FRET比率时，一个关键因素是抵制获取高分辨率精美图像的诱惑。尽管具体设置取决于显微镜系统的灵敏度以及特定探针的表达水平和性质，但重要的是使用刚好足以观察所需的最低 binning 水平。虽然 CFP激发–YFP发射 与 YFP激发–YFP发射 图像之间的时间应尽可能短，以避免细胞形态发生变化，但在实际操作中，最好将曝光时间保持在0.1秒以上，并通过中性密度滤光片降低荧光光源的强度。
光毒性对细胞周期的影响在很大程度上取决于探针的表达水平及其在细胞内的定位。例如，与组蛋白融合而定位于染色质的探针会使细胞对荧...

<table><tbody><tr><td>Leibovitz L-15，不含酚红</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>DMEM+Glutamax-I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 EDTA</td><td>Hyclone</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr></tbody></table>

通过比率型fret监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

基于荧光共振能量转移（FRET）的报告分子1可用于评估活细胞内源性激酶和磷酸酶的活性。这类探针通常由CFP和YFP的变体构成，中间插入一个可磷酸化的序列和一个磷酸结合结构域。当发生磷酸化时，探针构象发生变化，导致CFP与YFP之间的距离或相对取向改变，从而引起FRET效率的变化（图1）。过去十年中已有多篇文献报道了此类探针，用于监测多种激酶与磷酸酶的活性平衡，包括PKA2、PKB3、PKC4、PKD5、ERK6、JNK7、Cdk18、Aurora B9和Plk19的报告探针。鉴于其模块化设计，预计在不久的将来还将出现更多类似的探针10。
细胞周期的进程受到应激信号通路的影响11。值得注意的是，细胞在正常生长状态下与在应激后恢复过程中，其细胞周期的调控机制存在差异12。因此，对细胞周期全过程进行延时成像时需格外谨慎。这一问题在进行比率成像时尤为突出，因为正确解读结果需要获得两个具有高信噪比的图像。目前，利用比率荧光共振能量转移（FRET）成像技术研究激酶和磷酸酶活性在细胞周期依赖性变化的应用，主要局限于细胞周期的某些特定阶段8,9,13,14。
本文介绍了一种利用比率成像技术在整个人类细胞周期中监测基于荧光共振能量转移（FRET）探针的方法。该方法依赖于生命科学领域许多研究人员可获得的常规设备，且无需显微镜或图像处理方面的专业知识。

基于FRET的报告分子正越来越多地用于监测活细胞中激酶和磷酸酶的活性。本文介绍了一种利用基于FRET的报告分子评估细胞周期依赖性靶蛋白磷酸化变化的方法。

通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

基于 Förster 共振能量转移（FRET）的报告系统1可用于评估活细胞内源性激酶和磷酸酶的活性。此类……

在本视频中，通过荧光共振能量转移（FRET）技术监测整个细胞周期中的激酶和磷酸酶活性。此处使用的类似Polo激酶1（PLK1）活性探针，其一端带有青色荧光蛋白（CFP），另一端带有黄色荧光蛋白（YFP）。该探针被转染至U2 OS细胞中。接着，为了检测LK在G2/M期转换过程中作用靶点的磷酸化状态，对转染的U2 OS细胞进行延时荧光成像。当CFP与YFP彼此靠近且CFP被激发时，能量会转移至YFP，从而可检测到YFP的发射信号。然而，当探针发生磷酸化后，蛋白质构象发生变化，导致CFP与YFP相互分离。现在当CFP被激发时，可检测到强烈的CFP发射信号，而YFP发射信号仅很微弱。通过定量分析在CFP和YFP激发后YFP发射信号的比值，结果表明PLK1的活性在G2期增加，并在有丝分裂期间达到峰值。因此，与现有的标准延时成像等方法相比，该技术的主要优势在于特别关注确保细胞周期不会因成像条件或探针表达而受到干扰。该方法有助于回答细胞周期研究领域中的关键问题，例如特定激酶或磷酸酶在何时何地被激活。尽管该方法可用于研究细胞周期调控的酶，但也适用于其他需要未标记条件的系统，例如细胞增殖检测。为了监测人类细胞周期，使用基于FRET的PKA活性探针转染U2 OS细胞。采用标准的磷酸钙转染方法，并用嘌呤霉素对细胞进行至少七天的筛选。这可以富集表达探针的细胞群体，并减少表达水平具有毒性或严重干扰细胞周期的细胞数量。随后通过有限稀释法筛选稳定克隆，再检测CFP和YFP的表达，以确认它们在所有细胞中均以大致相同的比例存在。如果部分细胞仅含有CFP或YFP，则很可能发生了重组；此时应使用同源重组倾向较低的菌株（如Sure2细胞）重复质粒制备，然后将质粒线性化并重复转染实验。待细胞稳定表达探针后，将其接种于1.5号玻璃底培养皿中，待细胞贴壁且融合度达到30%至50%时进行实验。更换为不含酚红且不依赖CO2的培养基，将培养皿置于带有温度控制（设定为37摄氏度）的电动倒置荧光显微镜上。显微镜需配备CFP和YFP的激发与发射滤光片。选择适用于监测CFP和YFP的ROIC物镜，以及满足所需分辨率的物镜。此处使用20倍、数值孔径（NA）0.75的空气物镜。利用透射光将细胞调至焦点。此时请勿使用荧光光源，因为它会诱导产生应激反应，可能干扰细胞周期。为避免光毒性，应将光强调节至可实现所需亚细胞分辨率的最高允许值。在本实验中，应能够区分细胞核与细胞质。设置较短的曝光时间并插入高密度中性滤光片。然后使用YFP激发和发射条件采集12位或16位测试图像，调整曝光时间及中性密度滤光片，使细胞内的平均强度约等于背景强度加上五倍的最小与最大背景强度之差。为验证图像未发生饱和，请检查样品图像的荧光强度。图像中的最大强度应小于动态范围的一半，以便在细胞进入有丝分裂时能够分辨强度差异。接下来，使用CFP激发和YFP发射滤光片重复此过程。选择多个转染细胞区域，但需排除用于对焦和优化曝光条件的区域。由于这些操作可能引发应激反应，需确保所有细胞中的信号最大强度低于动态范围的一半。设置软件每45分钟采集两次图像，使用YFP激发、YFP发射和CFP激发滤光片进行YFP发射检测。同时将实验的总时长设置为超过细胞周期的持续时间。一切设置完成后，开始采集图像。采集完成后，打开所获得的图像，并监测从一次有丝分裂到下一次有丝分裂的细胞周期时间。对于此处表达转染探针的细胞，细胞周期时间大约为20至25小时。将此结果与所用细胞类型的对照数据进行比较。如果细胞周期时间与参考时间相符，则可对FRET进行分析。确认时间参数无误后，即可对图像进行分析。该分析可由大多数专用于显微镜的软件完成。此处使用 ImageJ 免费软件配合 Ratio Plus 插件进行分析。首先在 ImageJ 中打开图像以开始分析。如果图像是多色堆栈格式，可通过选择“图像”并将其转换为超堆栈来分离各个通道。然后选择超堆栈，再将堆栈转换为超堆栈。此时会打开“转换为超堆栈”窗口，显示相关设置，单击“确定”。图像下方将显示两个滑动条。接下来，将图像拆分为单通道图像栈，点击图像并选择“hyper stack reduce dimensionality”（超维图像栈降维）。这将打开降维窗口，请确保已选中“frames”（帧）和“keep source”（保留源）选项，然后点击“Okay”（确定）。将出现一个仅包含单个通道的新图像。重复此过程以调出包含第二个通道的新图像。接下来，为了提高最终图像的视觉清晰度，选择YFP激发YFP发射图像栈。单击“process”，然后单击“math”。接着选择乘法操作，当乘法窗口打开后，输入数值三，将YFP激发-YFP发射图像栈乘以三。此步骤为可选，目的是确保比值结果不在零到一之间。接下来，在图像 J 工具栏上选择自由手绘工具。然后在 YFP 激发、YFP 发射图像栈中，选择一个无细胞但靠近待测细胞的区域绘制感兴趣区域（ROI）。要将该 ROI 添加到 ROI 管理器，请点击分析工具，然后选择 ROI 管理器。ROI 管理器窗口将出现。单击“添加”以保存 ROI 坐标，用于测量 YFP 激发-YFP 发射图像堆栈中 ROI 的平均强度。单击“分析”，然后选择“测量”。结果窗口将打开。选择CFP激发、YFP发射的图像序列，然后在ROI管理器中双击该ROI，并重复测量。测量结果将添加到结果窗口中。滚动至堆栈中的其他位置，以在多个时间点重复此过程。通过比较结果窗口中的测量值，确认在整个影片中靠近目标细胞的背景强度相似。若要设置包含最小强度的测量参数，请点击“analyze”，然后点击“set measurements”并指定最小和最大灰度值。随后将显示一个包含测量选项的窗口。根据需要调整亮度和对比度后，绘制一个覆盖大部分细胞的感兴趣区域（ROI），并在两个图像栈中测量最小强度。然后使用样品池代替背景进行与之前相同的测量。根据结果部分的数值，计算测得的最小强度与背景强度之间的差值，并将该差值除以二。由此可得到一个初始的剪切值，用于设定开启动作比及选择插件。然后计算比率值。对于FRET比率，选择CFP激发、YFP发射的S堆栈一；或对于在磷酸化后FRET效率降低的探针，选择YFP激发、YFP发射的S堆栈一，并输入测得的背景强度和裁剪值。使用结果窗口中的数值，将其粘贴到比率加窗口中。设置生成的比率图像堆栈的缩放比例，并应用合适的查找表以可视化比率变化。表达基于FRET的探针监测PLK1活性的U2 OS细胞，按照本视频所述方法进行了60小时的拍摄。该图像显示了50个表达FRET探针的细胞的累积有丝分裂进入情况，包括子细胞的分裂。大多数表达该探针的细胞增殖周期时间为20至25小时，表明成像条件和探针表达水平不影响细胞周期时程。通过一个细胞连续四次分裂过程的倒置FRET比率的伪彩图显示，尽管存在较大噪声，但仍可观察到PKC1活性在G2期上升，并在有丝分裂期间达到峰值的趋势。当原始数据经过均值滤波并以图形形式呈现时，活动峰之间的时间易于估算。该图显示了从上一幅图像中的细胞所绘制的倒置FRET比率的量化结果。可以估算出激活的时间，如图所示，探针的磷酸化在有丝分裂中磷酸化达到峰值前约四小时即已开始显现。在进行该实验操作时，重要的是要使细胞保持在无应激状态，因此需尽量减少光照暴露，并避免温度或pH值的变化。还需注意，该方法用于监测细胞内激酶与磷酸酶活性之间的平衡。该实验流程可与RNA干扰或抑制剂筛选相结合，以鉴定这些激酶和磷酸酶的上游调控因子。

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