基于荧光测定活细胞中的钙进入商店经营:从培养的肿瘤细胞，骨骼肌纤维

店经营CA的程度

该实验方法用于使用基于荧光的方法揭示癌症和骨骼肌细胞中储存作的钙进入或 SOCE 的特性。这是通过记录活细胞中 URA 2 的荧光来实现的，该荧光对细胞内钙浓度敏感。此外，还测量了在钙浓度不敏感波长下添加锰的荧光猝灭率，这直接反映了 SOCE 对研究 SOCE 的激活。

在结构特化的骨骼肌细胞中，肌肉被解剖和剥皮。准备肌肉纤维。然后用低亲和力钙指示剂处理纤维，并监测其内部荧光。

这些方法表明，SOCE 存在于非兴奋细胞和骨骼肌中，具有分级激活并与细胞内钙储存内容紧密耦合。与电生理学、贴片家族等其他方法相比，这种基于荧光素的技术的主要优点是使用方便，可应用于细胞群研究或高通量筛选。使用合适的美容师 S 进行仪式公制环境和磁锥测定非常重要。

因此，单个仪器的校准至关重要，因为每个仪器都是不同的。这种方法的视觉演示至关重要，因为单根肌肉纤维的机械皮肤过程很难学习，因为它需要特殊的实践培训，深入了解和学习显微解剖技术，仔细观察，以及真正良好的患者剂量开始之前，校准显微镜设置以测量 URA 两种荧光。尽管钙结合和钙 3 URA 2 的激发波长分别为 3 个 40 纳米和 3 个 80 纳米，但在特定显微镜系统中，用于钙测量的 URA 2 的最佳比率动态范围可能出现在其他波长处。

波长的这种变化是由于光路的变化以及额外的各种光学元件。同样，每个系统的 ISO 痉挛点也不同。因此，通过光谱扫描确定此波长非常重要。

或者，可以通过任意两个波长的荧光来记录 Ming 筛选，以使最终值与钙浓度无关。首先，用表达 RFP 的质粒横切培养的 K Ys SE one 50 个细胞，并含有特异性对抗 HRNA 或 I one 或加扰序列的 HRNA 48 小时。在玻璃底培养皿上培养转染的细胞。

然后去除培养基并用平衡盐溶液或 BSS 冲洗细胞。冲洗后，上午 2：00 加入 1 毫升含有 2 微摩尔 RA 的 BSS，并将培养皿在 37 摄氏度下放置 40 分钟。将细胞在室温下放置 15 分钟，让细胞内 URA 2：00 AM 形式转化为 URA 2。

然后在显微镜下用 BSS 洗涤板两次。在可视化模式下，选择表达 RFP 的单元格。选择激发比模式，发射波长设置为 510 纳米，激发波长设置为 350 和 390 纳米。

该比率显示在第三个窗口中。接下来，记录。选定的细胞在预定波长处发出荧光，同时用四种不同的溶液灌注细胞。

同样，KYSE one 50 电池加载了 ferra two 并进行记录。在激发比模式下，与前面的程序不同，选择 ISO 痉挛点 360 纳米作为激发波长。然后同时记录 360 和 390 纳米的荧光，同时用五种不同的 BSS 溶液对细胞进行喷香。

对于该方案，C 两个 C 12 细胞，小鼠肌原细胞系必须在玻璃底培养皿上培养以汇合，然后在含有 2.5% 马血清的分化培养基中分化成肌管。上午 2：00 在 BSS 溶液中加载 C 两个终浓度为 5 微摩尔 RA 的 C 12 myo 管，并孵育 40 分钟。然后添加终浓度为 20 微磨牙和苯并对甲苯 smide 或 BTS 以抑制肌肉收缩和由它们引起的运动伪影。

在室温下孵育细胞 15 分钟，并在所有溶液中保持 BTS。接下来加载四个。将盐溶液平衡到灌注系统中。

如前所述。在每次富集期间，在 360 和 390 纳米处记录选定细胞的荧光。在本系列中，镁和 thap argen 一起用于监测镁离子淬灭。

而内质网钙储存正在耗尽。要解剖趾长伸肌或 EDL 肌肉，将安乐死小鼠的腿横向放置，并去除从脚踝区域到膝盖的皮肤。切开浅层肌肉组织以暴露 EDL 并切断上下肌腱以释放完整的 EDL 肌肉。

尽可能保持肌腱的长度很重要。现在为防止任何收缩，在立体显微镜下将 EDL 转移到含有 0.1 毫摩尔 EGTA 且不含钙的 T 路溶液中。将膝关节插入肌腱分成两半，并将 EDL 肌肉分成两束。

重复该过程，直到获得 8 个束。如果任何肌腱束丢失，请丢弃该束。接下来，握住 EDL 束带的两条肌腱，小心地拉伸条带，直到三到四根分离的单肌纤维完好无损，两侧都有肌腱组织。

将一滴不含钙的 tyro 缓冲液放入玻璃底培养皿中。将 EDL 条带笔直放在培养皿上，并快速去除尽可能多的溶液。接下来，使用防水透明胶带将两条肌腱紧紧地粘住。

先用无钙溶液清洗纤维，然后用 2.5 毫摩尔钙溶液清洗纤维两次。如果发现纤维过度收缩和损坏，请丢弃纤维，用 1 号洗涤液清洗选定的健康肌肉纤维 3 次，然后将它们浸泡在改性的细胞内类似去皮的溶液中 5 分钟。使用连接到针架的钨针在立体显微镜下对纤维进行机械蒙皮，纤维将重新密封并捕获横管中与钙结合的 5 n 路。

在我看来，获得健康的单根完整肌肉纤维或至少这些类型的纤维束仍然连接着一些肌腱是最具挑战性的步骤之一，其次是将这些纤维转移到最终实验室总是非常困难的。在此过程中，纤维可能会过度收缩，甚至在此过程中可能会断裂。因此，如果您有健康的纤维，机械是皮肤本身将更容易加载 SR。将纤维和去皮溶液与 20 微摩尔流孵育 5 N。

后，进行大量洗涤和 2 号洗涤液，并额外孵育 30 分钟，以使染料完全脱酯。然后，可以使用具有 60 倍物镜的共聚焦显微镜从感兴趣区域观察纤维。同时记录每种染料的荧光，同时用 SR 负载 SR 去除溶液灌注纤维。

使用细胞内钙测量检查 KYS、SE one 50 细胞中的 SOCE 活性。用 RFP 和短发夹对细胞进行编码横切，RNA 针对编码 A-S-O-C-E 通道的 OR I one 基因，与黑色轨迹敲低或 I 1 表达导致 SOCE 活性降低的对照相比，SOCE 和 KYC one 50 细胞也用锰淬灭试验证实。在 TG 完全耗尽 ER 钙储存后，锰的大量导致荧光显着降低。

URA 2 信号丢失的斜率越陡峭，表明 SOCE 更活跃。因此，两个 A PB 处理的细胞中的缓慢荧光降低表明 SOCE 活性被该化合物阻断。锰淬灭速率从最初的 10 秒开始确定，其中淬灭仍处于线性范围内而没有饱和，在培养的肌肉细胞中进行类似的锰淬灭测定。

在这种情况下，锰与 tg 一起施用。当 TG 耗尽 SR 钙储存时，荧光猝灭斜率逐渐变化，直到达到最大速率。S 形曲线表示在这些实验条件下 SOCE 的分级激活。

在共聚焦成像下，TT 隔室中 5 号路和模具的结皮纤维捕获显示出特征性的哺乳动物双峰模式，如红色通道所示。用流速 5 NM 加载 SR 后，在 TTSR 负载溶液中，在 TTSR 负载溶液荧光强度增加时，在绿色通道中可见典型的点状 SR 模式，SR 隔室中 SR 耗尽溶液荧光水平丰富时，道路 5 N 和流速 5 n 的荧光强度均增加，TT 隔室开始降低。这表明 SR 钙储存消耗和 SOCE 激活之间分别存在耦合。

看完这个视频后，你应该对如何获得第一个可行的真正健康、完整的肌肉纤维有一个非常好的了解。他们，他们的末端需要有足够的肌腱才能让您进行有效的皮肤过程，这最终将使实验者拥有具有令人难以置信的优势的生理相关准备。不要忘记，本研究中使用的所有荧光样式通常是对光敏感的，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在暗盘中加载和在暗室中洗涤。

O 掌握了这个技术可以在几个小时内完成。我们建议的是，首先获得几根完整的纤维，以便在机械瘦步骤中获得更高的成功率，并且如果您想在发育后将这些纤维培养过夜。这项技术为钙信号领域的研究人员铺平了道路，以探索储存作的钙进入在癌细胞生长和死亡中的作用。

肌肉的生理和病理功能。