Name: 基于荧光测定活细胞中的钙进入商店经营:从培养的肿瘤细胞，骨骼肌纤维 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 学习使用荧光指示剂检测肿瘤细胞和骨骼肌纤维中钙库操纵性钙内流的方法。该技术通过共聚焦成像实现高时空分辨率，为高通量筛选和钙信号研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢诺亚·韦斯莱德博士（Dr. Noah Weisleder）对本文稿的审阅与编辑。本研究由新泽西医科大学基金会研究资助项目（UMDNJ Foundation 62-09）资助，项目负责人：ZP；美国心脏协会学者发展奖（SDG2630086）资助，项目负责人：XZ；美国心脏协会资助项目（0535555N）资助，项目负责人：MB；以及美国国立卫生研究院（National Institutes of Health RC2AR058962-01）资助，项目负责人：MB。

1. 单个细胞内 Ca2+ 浓度的测定
<ol>
	<li>KYSE-150 是一种人食管鳞状细胞癌（ECSS）细胞系，在 37°C、5% CO2 条件下，使用含 5% 胎牛血清的 RPMI 1640/Ham's F-12 混合培养基（1:1）进行培养。</li>
	<li>将含有特异性靶向 Orai1 的 shRNA 或随机序列的质粒转染至 KYSE-150 细胞中。这些质粒还包含一个编码红色荧光蛋白（RFP）的基因作为报告基因，该基因由独立的启动子驱动表达。</li>
	<li>将细胞在玻璃底培养皿（No. 1.5 盖玻片，MatTek，MA）中培养 48 小时。</li>
	<li>移除培养基，并用平衡盐溶液（BSS）（140 mM NaCl，2.8 mM KCl，2 mM CaCl2，2 mM MgCl2，10 mM HEPES，pH 7.2）清洗细胞。</li>
	<li>向培养皿中加入 1 ml 含 2 μM Fura-2 乙酰甲酯（Molecular Probes）的 BSS 溶液，并用铝箔包裹整个培养皿以避光。</li>
	<li>在 37°C 下孵育 40 分钟，随后在室温下继续放置 15 分钟，以完成酯键的水解反应。用 BSS 溶液清洗细胞两次。</li>
	<li>将培养皿置于 Nikon TE200 倒置显微镜载物台上，该显微镜连接 PTI 荧光分光光度计，激发波长分别为 350 和 390 nm，发射波长为 510 nm。实际使用的激发波长可能因不同系统的光学特性而略有差异。通过扫描含有 0 至 39.8 μM（或更高至 Fura-2 荧光饱和浓度）Ca2+ 溶液中 Fura-2 盐的激发光谱，确定具有最佳比率动态响应的两个激发波长。</li>
	<li>建立重力灌流系统，使用四种不同的 BSS 溶液：含 Ca2+（2 mM）、EGTA（0.5 mM）、EGTA-TG（毒胡萝卜素，5 μM）和 Ca2+-2-APB（一种 SOCE 抑制剂，75 μM）。也可使用计算机控制的自动灌流系统。</li>
	<li>在可视化模式下选择表达 RFP 的细胞。</li>
	<li>在 10 倍物镜放大下调整灌流系统出口端的位置，使管口以 45 度角正对目标区域上方。</li>
	<li>同时记录荧光信号 F350nm 和 F390nm。比值（F350nm/F390nm）在第三个窗口中显示。按以下顺序切换灌流溶液：Ca2+；EGTA；Ca2+；EGTA-TG；Ca2+；Ca2+-2-APB。</li>
</ol>
上述方案可进行修改，用于测定细胞悬液系统中的细胞内 Ca2+。
<ol start="12">
	<li>在T25培养瓶中，以与上述相同的培养条件培养KYSE-150细胞。</li>
	<li>当细胞达到 90% 汇合度时，移除培养基，并用 BSS 溶液冲洗细胞。</li>
	<li>加入含有2.5 ml BSS溶液 2 μM Fura-2 AM 并将细胞在 37 °C 下孵育 40 分钟 37°C 随后进行去酯化。</li>
	<li>移除BSS，向培养瓶中加入2.5 ml胰蛋白酶，并于37℃孵育 37°C 待细胞脱落，加入2.5 ml培养基终止消化，800 rpm离心5 min收集细胞。</li>
	<li>用培养基再通过离心洗涤细胞一次，然后将细胞沉淀重悬于BSS溶液中（不添加2 mM CaCl₂）。2，含有 μM 钙离子浓度范围2+）并使用血球计数板对细胞数量进行计数。</li>
	<li>加入约106 将细胞加入石英比色皿（10 mm，Starna Cells）中，并用BSS定容至2 ml。</li>
	<li>将比色皿（内置磁力搅拌子）放入荧光分光光度计中。</li>
	<li>同时记录荧光信号 F340 nm 和 F380 nm 发射波长为510 nm。运行程序为：BSS，添加 0.5 μl EGTA（0.25 M 储存液），添加 1 μl 毒胡萝卜素（thapsigargin，TG，10 mM 储存液），添加 4 μl Ca2+（1 M 储存液）</li>
</ol>
2. 培养细胞中的锰淬灭实验
<ol>
	<li>对含不同 Ca 浓度的溶液中的 Fura-2 进行激发波长扫描2+ 浓度范围从 0 到 39.8 μM 以确定与钙离子浓度无关的波长作为等吸收点。通常，等吸收点位于或接近360 nm。</li>
	<li>KYSE-150 细胞在玻璃底培养皿中培养，并负载 Fura-2 AM。</li>
	<li>设置灌注系统，使用5种不同的BSS溶液：Ca2+ （2 mM）、EGTA/TG（0.5 mM 和 5 μM，分别），Mn2+ （0.5 mM，不添加 EGTA 或 Ca2+，含有游离 Ca2+ 在 μM 范围），Mn2+2-APB75 μM)，EGTA/Triton X-100（0.1%）</li>
	<li>将培养皿置于显微镜载物台上，选择激发波长为360 nm和390 nm、发射波长为510 nm的“激发比值”模式。</li>
	<li>同时记录荧光信号 F360 nm 和 F390 nm 比率（F360 nm/390 nm）显示在第三个窗口中。正在运行的方案为：Ca2+ 1 分钟以稳定荧光，Mn2+ 30 秒，EGTA/TG 作用 10 分钟，Mn2+ 2分钟，EGTA-Triton X-100（0.1%）1分钟，以获得背景读数。Mn2+/2-APB 溶液可替代 Mn 使用2+ 以检测荧光猝灭的消失，这表明 Mn2+ 通过SOCE途径进入。</li>
</ol>
3. 肌肉细胞中的锰淬灭实验
<ol>
	<li>C2C12 是一种小鼠成肌细胞系，在含有 10% 胎牛血清和 10% 马血清的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO2 的环境下，在玻璃底培养皿中进行培养。</li>
	<li>当细胞达到融合状态后，更换为分化培养基（去除胎牛血清，并将马血清浓度降至 2.5%）。C2C12 成肌细胞将在 4 天后分化为肌管。</li>
	<li>按照 1.4–1.6 步骤所述，用终浓度为 5 μM 的 Fura-2 AM 对 C2C12 肌管进行负载。</li>
	<li>加入终浓度为 20 μM 的 N-苄基-对甲苯磺酰胺（BTS），以抑制肌肉收缩及其引起的运动伪影，并在开始实验前孵育 15 分钟。</li>
	<li>将培养皿置于连接 PTI 设备的显微镜载物台上，并向灌流系统中加入以下 BSS 溶液：含 2 mM Ca2+ 的溶液、无 Ca2+ 溶液、含 0.5 mM Mn2+ 的溶液；以及分别含 0.5 mM Mn2+ 和 20 μM TG 的溶液。</li>
	<li>按照上述方法设置灌流系统。</li>
	<li>同时记录荧光信号 F360nm 和 F390nm，并在第三个窗口中显示比值（F360nm/F390nm）。运行程序如下：先用含 2 mM Ca2+ 的溶液灌流 1 分钟，接着用无 Ca2+ 溶液灌流 1 分钟以清除 Ca2+，然后用含 Mn2+ 溶液灌流 0.5 分钟，再用含 Mn2+/TG 溶液灌流 10 分钟，最后使用含 0.1% Mn2+/EGTA-Triton X-100 的溶液。</li>
</ol>
4. 去膜肌纤维中时空分辨的SOCE
<ol>
	<li>配制以下溶液。 
	等渗Tyrode缓冲液： 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, pH 7.2, 290 mosm 
	培养基： DMEM，含2%马血清和1%青霉素-链霉素 
	洗涤液#1： 109.6 mM K-谷氨酸盐, 2 mM EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM 磷酸肌酸（CP）, 20 mM N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸（BES）-KOH, pH 7.0 
	洗涤液#2： 140 mM K-谷氨酸盐, 5 mM EGTA-KOH, 6.5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7.0 
	去膜溶液： 140 mM K-谷氨酸盐, 6.5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7.0 
	横管（TT）加载溶液： 90.6 mM K-谷氨酸盐, 18 mM Na-谷氨酸盐, 0.55 mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl2, 5.4 mM ATP, 15 mM CP, 0.0025 mg/ml 肌酸激酶（CK）, 20 mM BES-KOH, 5 μM 羰基氰化对三氟甲氧基苯腙（FCCP）, pH 7.0, pCa 7.0 
	肌浆网（SR）加载溶液： 107.8 mM K-谷氨酸盐, 0.98 mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6.6 mM MgCl2, 5.4 mM ATP, 15 mM CP, 0.0025 mg/ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 μM FCCP, pH 7.0, pCa 6.6 
	肌浆网（SR）耗竭溶液： 100 mM K-谷氨酸盐, 40 mM Na-谷氨酸盐, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸（BAPTA）, 0.35 mM MgCl2, 0.5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 μM FCCP, pH 7.0。实验前加入25 mM 咖啡因/20 μM 毒胡萝卜素（TG）。</li>
	<li>为分离趾长伸肌（Extensor digitorum longus, EDL），先将小鼠仰卧固定，腿部置于侧位，从踝部至膝部去除皮肤，切开浅层肌肉组织以暴露EDL，切断其上下两端的肌腱以完整取出EDL肌肉；操作中应尽可能保留较长的肌腱。将EDL转移至含0 Ca2+ 和0.1 mM EGTA的Tyrode溶液中，以防止任何收缩发生。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用两把镊子夹住下端止点肌腱，将EDL肌肉分成两个肌束。重复此过程，获得4个，然后8个肌束。关键是在整个操作结束时，每个8个肌束均需保留肌腱。若部分肌束丢失肌腱，则应弃用。</li>
	<li>在体视显微镜下，将每个EDL肌束的两端肌腱夹住并小心拉伸，直至形成3~4根完整保留两端肌腱的单根肌纤维。</li>
	<li>在玻璃底培养皿中央滴加一滴无Ca2+ Tyrode缓冲液，将EDL肌条平直放置于皿中，迅速尽可能吸除多余液体，然后使用防水胶带固定两端肌腱，并确保胶带绷紧。先用无Ca2+溶液洗涤一次，再用含2.5 mM Ca2+的溶液洗涤两次。若肌纤维出现过度收缩或损伤迹象，应弃用。</li>
	<li>如需进行遗传操作，肌纤维可培养长达96小时。用完全培养基洗涤肌纤维三次，加入2 ml培养基，置于5% CO2、37°C培养箱中。每次实验前，检查肌纤维状态，弃用无清晰横纹、有污染迹象或出现损伤（如肌膜收缩）的纤维。良好的肌纤维应对KCl、电刺激和咖啡因刺激产生反应。</li>
	<li>单根肌纤维用洗涤液#1洗涤三次，然后浸入含500 μM Rhod-5N和0.5 mM Ca2+的类细胞内去膜溶液中，孵育5分钟。</li>
	<li>使用连接于针夹持器的钨针，在体视显微镜下对肌纤维进行机械去膜，使横管（TT）自动重新封闭，从而将与Ca2+结合的Rhod-5N封入横管内。去膜后，用洗涤液#2洗涤两次。机械去膜过程中，去除的细胞宽度应小于25%，以达到最佳效果。</li>
	<li>为加载肌浆网（SR），将去膜肌纤维在室温下用含20 μM Fluo-5N AM的去膜溶液孵育1小时，随后用洗涤液#2充分洗涤，并继续孵育30分钟，以确保染料完全去酯化。</li>
	<li>30分钟后，在共聚焦显微镜下使用60倍物镜观察去膜肌纤维。采集相应染料的荧光图像（Rhod-5N：激发波长543 nm，发射波长>570 nm；Fluo-5N：激发波长488 nm，发射波长530–560 nm）。为每种染料标记的区域选择感兴趣区域（ROIs）。</li>
	<li>实验流程如下：先用TT加载溶液孵育120秒，再用SR加载溶液孵育120秒，最后用SR耗竭溶液孵育400–750秒以耗尽肌浆网Ca2+储存。在此过程中，记录Rhod-5N荧光强度变化（反映横管Ca2+）和Fluo-5N荧光强度变化（反映肌浆网Ca2+），从而获得横管和肌浆网相对荧光强度随时间变化的曲线。对多根肌纤维的平均荧光强度进行进一步分析，并将TT/SR加载结束时的最大荧光强度归一化为100%。</li>
</ol>
5. 典型结果
我们通过细胞内 Ca2+ 测定检测了 KYSE-150 细胞中的 SOCE 活性（图 2）。利用 RFP 作为报告基因，我们可以筛选出转染了含有针对 orai1 基因的特异性 shRNA 质粒的单个细胞，该基因编码 SOCE 通道。与转染了含乱序 shRNA 质粒的细胞（黑色轨迹）相比，Orai1 蛋白的敲低导致 SOCE 活性降低（红色轨迹）。
使用Mn2+淬灭实验也证实了KYSE-150细胞中的SOCE（图3）。360 nm的激发波长对应Fura-2的等吸收点，在该波长下荧光强度不受Ca2+浓度影响。在TG完全耗竭内质网Ca2+储存后，灌注Mn2+导致荧光显著下降。SOCE的整体活性可通过Fura-2荧光强度下降速率来衡量，斜率越陡表明SOCE活性越高，而斜率越平缓则表明SOCE活性越低。经2-APB处理的细胞中，荧光下降的斜率明显更为平缓，表明该化合物抑制了SOCE活性。Mn2+淬灭速率由前10秒的记录数据确定，此时淬灭过程仍处于线性范围，尚未达到饱和。
在肌肉组织中也进行了类似的Mn2+淬灭实验（图4）。在此实验中，Mn2+与TG同时施加。当TG耗竭肌浆网（SR）中的Ca2+储存时，荧光淬灭的斜率逐渐变化，直至达到最大速率。该S形曲线表明在此实验条件下，SOCE呈梯度激活。
培养条件下健康的完整单根肌纤维显示出清晰且均匀的横纹，无污染迹象，也无收缩诱导的损伤迹象。这些纤维能够对电刺激或去极化溶液产生收缩反应。在共聚焦成像下，去膜纤维中Rhod-5N染料在横管（TT）区室的滞留呈现出典型的哺乳动物双峰模式（在红色通道中可见）。在用Fluo-5N AM负载肌浆网（SR）后，典型的点状SR分布模式可见（在绿色通道中）。当用TT/SR负载溶液灌流去膜纤维时，Rhod-5N和Fluo-5N的荧光强度均增加；当用SR耗竭溶液灌流时，SR区室和TT区室的荧光水平开始下降，分别表明SR Ca2+ 储存库耗竭与SOCE激活之间存在紧密偶联（图5）。
<img src="/files/ftp_upload/3415/3415fig1.jpg" alt="钙库调控的Ca²⁺内流示意图；内质网/肌浆网机制；STIM1、Orai1、IP₃R；钙信号传导过程" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 钙库操纵性Ca2+ 进入（SOCE）。 Orai1 是一种位于质膜（PM）上的通道孔形成亚基，而 STIM1 是一种 Ca2+ 传感器位于内质网或肌浆网（ER/SR）膜上。当ER/SR中的Ca2+ 由于内质网/肌浆网钙离子通道被阻断，导致钙库减少2+ 泵（SERCA）或Ca2+ 通过免疫沉淀释放3 受体或兰尼碱受体激活后，STIM1被激活。活化的STIM1分子形成簇状结构，诱导Orai1聚集，进而导致SOCE的激活。
<img src="/files/ftp_upload/3415/3415fig2.jpg" alt="钙流分析，F&lt;sub&gt;350&lt;/sub&gt;/F&lt;sub&gt;390&lt;/sub&gt; 随时间变化图，评估抗 Orai1 shRNA 的作用。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. KYSE-150 细胞内 Ca2+ 的测定。 将细胞外溶液从无 Ca2+（含 0.5 mM EGTA）更换为含 2 mM Ca2+ 的溶液，未引起细胞内 Ca2+ 的任何变化。在无 Ca2+ 灌流液中加入 5 μM TG 可诱导内质网被动释放 Ca2+。当内质网 Ca2+ 储存耗竭（>10 分钟）后，加入细胞外 Ca2+（2 mM）通过 SOCE 途径引发持续性的细胞内 Ca2+ 升高，该过程可被 SOCE 抑制剂（如 skf-96365 和 2-APB）阻断（数据未显示）。转染含有针对 orai1 的特异性 shRNA 质粒的细胞（红色曲线）表现出显著低于转染随机序列（黑色曲线）细胞的 SOCE 水平。
<img src="/files/ftp_upload/3415/3415fig3.jpg" alt="Mn²⁺淬灭图；荧光强度 vs. 时间；+2-APB，无；化学分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. KYSE-150细胞中SOCE的Mn2+淬灭实验。 在Fura-2的Ca2+非依赖性激发波长（360 nm）下检测Mn2+（0.5 mM）对Fura-2荧光的淬灭作用。细胞经5 μM TG处理10分钟，以完全耗尽内质网Ca2+储存。加入Mn2+后Fura-2荧光衰减速率（虚线，前10秒内）代表SOCE的激活程度，以单位时间内荧光强度的百分比下降表示（初始值设为100%）。实验结束时通过添加0.1% Triton X-100裂解细胞，获得荧光信号的最小值（定义为0%）。经2-APB（75 μM）处理的细胞显示出更平缓的衰减斜率，表明该化合物可阻断KYSE-150细胞中的SOCE。
<img src="/files/ftp_upload/3415/3415fig4.jpg" alt="Mn2+ 淬灭动力学曲线图，时间与荧光关系，Triton 和 2-APB 的影响，TG 加入效果。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4. 通过 Mn2+ 淬灭实验揭示肌细胞中 SOCE 的梯度激活。 在 TG 耗竭肌浆网（SR）Ca2+ 储存的同时，可记录到 SOCE 的激活。同时加入 Mn2+（0.5 mM）和 TG（20 μM）后，细胞内 Fura-2 荧光呈梯度且呈S形下降（青色虚线表示最快淬灭点），与初始 Mn2+ 淬灭速率（蓝色虚线）明显不同。在经 2-APB（75 μM）处理的细胞中，Mn2+ 淬灭斜率几乎与基础水平相同，表明 SOCE 被抑制。
<img src="/files/ftp_upload/3415/3415fig5.jpg" alt="显微镜荧光强度分析，Fluo-5N，Rhod-5N，钙成像，时间依赖性曲线。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5. 剥离肌纤维中时空分辨的钙库操纵性钙内流（SOCE）。(A) 将 Rhod-5N 盐负载至横管（TT），将 Fluo-5N AM 负载至肌浆网（SR）。(B) 施加 Ca2+ 耗竭溶液后，TT 和 SR 区室中的荧光均下降。Fluo-5N 荧光的减弱表明肌浆网 Ca2+ 含量快速释放，而 Rhod-5N 荧光的减弱提示 SOCE 的激活。

<ol><li>Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice%3A+roles+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+the+immune+system+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li>
<li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li>
<li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li>
<li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+Ca2%2B+by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li>
<li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+store-operated+Ca2%2B+entry+and+altered+Ca2%2B+release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

尽管Fura-2在结合Ca2+和游离Ca2+状态下的激发波长分别为340 nm和380 nm，但在特定显微镜系统中，Fura-2用于Ca2+浓度测定的最佳比率动态范围可能出现在其他波长处。这种波长的偏移通常是由于添加各种光学元件后光路发生变化所致。在本研究中，通过进行Fura-2荧光的光谱分析，确定其激发波长为350 nm和390 nm。
细胞质内 Ca2+ 浓度水平由多种来源共同调节，包括细胞内 Ca2+ 释放、细胞外 Ca2+ 内流，以及内质网和质膜上的 Ca2+ 排除机制。为了将 SOC 介导的单向 Ca2+ 内流与细胞内 Ca2+ 释放及 Ca2+ 外排过程区分开来，可采用 Mn2+ 淬灭实验。已知 Mn2+ 可通过 SOCE 途径进入细胞，但不会被质膜上的外排机制或内质网 Ca2+ 泵摄取。因此，荧光淬灭程度可反映 Mn2+ 单向流入细胞的情况，从而估算 SOCE 的激活程度。Mn2+ 淬灭实验应在等吸收点（isosbestic point）波长下进行，在该波长下，Fura-2 的荧光强度不受 Ca2+ 浓度影响。每个系统的等吸收点应通过光谱扫描确定。或者，也可通过调节任意两个波长下的荧光信号，使最终计算值不受 Ca2+ 浓度影响，从而记录 Mn2+ 淬灭过程13。
为了获取骨骼肌中SOCE活性的空间和时间信息，我们采用了一种双染料方法，可在剥离的成年哺乳动物EDL肌纤维中同时测量SOCE活性和肌浆网（SR）Ca2+含量。通过绘制SR Ca2+含量变化与SOCE活性之间的相关性，可以揭示SOCE对SR Ca2+储存耗竭的激活阈值和敏感性。T管加载液经过优化，可将Ca2+额外加载至横管系统（T-tubules），并用于横管系统的预处理；而SR加载液则设计用于促进SR最大程度地加载Ca2+，并同时将约500 μM的Ca2+额外加载至横管系统。在T管/SR加载液及SR耗竭液中均添加了FCCP，以消除线粒体带来的影响。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV</td><td> </td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td> </td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td> </td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td> </td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>英吉特（Molecular Probes）</td><td>F1221</td><td>-20 &amp;deg;C，密封，避光，溶于DMSO</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen（Molecular Probes）</td><td>F14204</td><td>-20 &amp;deg;C，密封，避光保存</td></tr><tr><td>Rhod-5N</td><td>英杰公司（分子探针）</td><td>R14207</td><td>-20 &amp;deg;C，密封，避光保存</td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Starna 细胞</td><td>3-Q-10</td><td> </td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Tocris</td><td>1138</td><td> </td></tr><tr><td>2-氨基&amp;#8211;2-氨基苯基硼酸（2-APB）</td><td>Tocris</td><td>1224</td><td> </td></tr><tr><td>N-苄基对甲苯磺酰胺（BTS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435600</td><td> </td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;设备：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; 光谱荧光仪（Photon Technology International，新泽西州）：氙弧灯，计算机控制的高速随机存取单色器，基于比色皿的发射单色器，尼康TE-200倒置荧光显微镜，S Fluor 40x/1.30油镜物镜，光电倍增管检测器。&lt;/li&gt; &lt;李&gt; 激光扫描共聚焦显微镜（BioRad Radiance2100）：氩离子激光器（453/477/488/514），氦氖激光器（543 nm），Nikon TE2000 倒置显微镜，60倍物镜（数值孔径 1.4，油镜）。&lt;/li&gt; &lt;李&gt; 体视显微镜，具备放大功能 &amp;gt; 100（蔡司 Stemi SV11 Apo）&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

储存操纵性Ca2+内流（SOCE），早期称为电容性Ca2+内流，是一种严格调控的机制，介导细胞外Ca2+进入细胞内，以补充耗竭的内质网（ER）或肌浆网（SR）Ca2+储存1,2。由于Ca2+是一种普遍存在的第二信使，SOCE在多种细胞过程中发挥重要作用也就不足为奇，这些过程包括增殖、凋亡、基因转录和细胞运动。由于该通路几乎存在于所有细胞类型中，包括上皮细胞和骨骼肌细胞，因此受到广泛关注3,4。然而，不同细胞类型中SOCE特性的异质性及其生理功能仍不明确5-7。
通过膜片钳研究可以揭示SOCE的功能性通道特性，但由于基于荧光的细胞内Ca2+检测方法操作简便且适用于高通量筛选，目前关于该通路的大量知识均由此类方法获得。本报告的目的是总结几种基于荧光的方法，用于检测单层细胞、悬浮细胞和肌纤维中SOCE的激活5,8-10。其中最常用的方法是利用比率型Ca2+荧光探针Fura-2，在发射波长510 nm条件下，通过F340nm与F380nm的荧光强度比值直接监测细胞内Ca2+的动态变化。为了将单向SOCE活动与细胞内Ca2+释放及Ca2+外排过程区分开来，常采用Mn2+淬灭实验。已知Mn2+可通过SOCE进入细胞，但由于其与Fura-2具有极高的亲和力，无法被质膜上的外排机制排出，也不能被内质网上的Ca2+泵摄取。因此，细胞外Mn2+进入细胞后引起的Fura-2荧光淬灭可作为SOCE活性的测量指标9。比率荧光测定和Mn2+淬灭实验既可在基于比色皿的分光荧光仪上以细胞群体模式进行，也可在基于显微镜的系统中实现单细胞水平的可视化检测。单细胞检测的优势在于，可通过GFP或RFP报告基因筛选出经过基因操作的单个细胞，从而实现对基因修饰或突变细胞的研究。在结构特化的骨骼肌中，SOCE的时间-空间特性可通过去膜肌纤维实验获得，方法是同时监测两种低亲和力Ca2+指示剂在肌纤维特定区室中的荧光信号，例如将Fluo-5N靶向至肌浆网（SR），Rhod-5N靶向至横管系统9,11,12。

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。

储存操纵性Ca2+内流（SOCE），早期称为电容性Ca2+内流，是一种严格调控的机制，介导细胞外Ca2+进入细胞内……

本实验方法利用基于荧光的技术，研究癌细胞和骨骼肌细胞中由储存库调控的钙离子内流（SOCE）的特性。通过记录活细胞中URA2的荧光信号（该信号对细胞内钙离子浓度敏感），实现对SOCE的检测。此外，通过在对钙离子浓度不敏感的波长下加入锰离子并测定其荧光淬灭速率，可直接反映SOCE的激活状态，从而用于SOCE的研究。在结构特化的骨骼肌细胞中，分离并剥离肌肉，制备肌纤维。随后用低亲和力钙指示剂处理肌纤维，并监测其内部荧光。这些方法表明，SOCE 存在于非兴奋性细胞和骨骼肌中，其激活呈梯度性，并与细胞内钙库含量紧密偶联。与电生理学、膜片钳等其他方法相比，这种基于荧光素的技术主要优势在于使用方便，可应用于细胞群体研究或高通量筛选。在进行酯酶测定、代谢环境检测及镁离子螯合实验时，选择合适的实验条件至关重要。因此，对每台仪器进行校准至关重要，因为每台仪器都存在差异。该方法的可视化演示非常关键，因为单根肌纤维的机械剥离操作难以掌握，需要特殊的动手训练，深入理解并学习显微解剖技术，仔细观察，以及极大的耐心。在开始之前，需校准显微镜系统，以实现对URA-2荧光的测量。尽管钙结合与钙-URA-2的激发波长分别为340纳米和380纳米，但在特定显微镜系统中，URA-2用于钙测量的最佳比率动态范围可能出现在其他波长下。这些波长的变化是由于添加了不同的光学元件，导致光路发生变化所致。同样，每个系统的ISO痉挛点也各不相同。因此，通过光谱扫描来确定这些波长非常重要。或者，可以通过在任意两个波长下仅使用荧光记录明筛过程，使得最终数值与钙离子浓度无关。首先，将表达RFP并含有针对I one的特异性HRNA或随机序列的质粒转染至培养的K Ys SE约50个细胞中，转染时间为48小时。将转染后的细胞培养在玻璃底培养皿中。然后移除培养基，并用平衡盐溶液（BSS）冲洗细胞。冲洗后，加入含有 2 µM RA 2:00 AM 的 1 毫升 BSS，将培养皿置于 37°C 下孵育 40 分钟。将细胞在室温下放置 15 分钟，使细胞内的 URA 2:00 AM 转化为 URA two。然后在显微镜下用BSS洗涤培养板两次。在可视化模式下，选择表达RFP的细胞。选择激发比模式，发射波长设为510纳米，激发波长设为350和390纳米。该比值显示在第三个窗口中。接下来，记录细胞在灌注四种不同溶液时，在预设波长下的荧光信号。同样，将KYSE150细胞加载fura-2后进行记录。在激发比值模式下，与先前步骤不同，选择360纳米作为激发波长。随后，在用五种不同的BSS溶液灌注细胞的同时，同步记录360纳米和390纳米处的荧光信号。本实验方案中，需将 C2C12 细胞（一种小鼠成肌细胞系）培养于玻璃底培养皿中至融合状态，然后在含 2.5% 马血清的分化培养基中诱导其分化为成肌管细胞。用终浓度为 5 µM 的 RA-2000 AM 溶于 BSS 溶液中对 C2C12 成肌管细胞进行负载，并孵育 40 分钟。随后加入终浓度为 20 µM 的苯甲基磺酰胺（benzothiazole sulfonamide，BTS）以抑制肌肉收缩及其引起的运动伪影。将细胞在室温下孵育15分钟，并在所有溶液中保持BTS。接下来加载四个。将平衡盐溶液注入灌注系统。如前所述，在每次灌注过程中记录选定细胞在360和390纳米处的荧光。在本实验系列中，同时施加镁离子和硫代苯酯以监测镁离子猝灭效应。当内质网钙库逐渐耗竭时，为分离趾长伸肌（extensor digitorum longus，EDL），将已处死小鼠的后肢侧向放置，从踝关节至膝关节处去除皮肤。切开表层肌肉组织以暴露EDL肌，并切断其上下两端的肌腱，从而游离出完整的EDL肌。保持肌腱尽可能长非常重要。现在，为防止任何收缩，将 EDL 肌肉转移至含有 0.1 毫摩尔 EGTA 且无钙的 T road 溶液中，在体视显微镜下操作。将膝关节插入端的肌腱强制分为两半，并将 EDL 肌肉分成两个肌束。重复该过程，直至获得八束肌腱。若任何一束中丢失了肌腱，则弃用该束。接着，夹住趾长伸肌（EDL）肌束条的两端肌腱，小心拉伸条带，直至剩下三到四根分离的单肌纤维，且每根纤维两端均保留完整的肌腱组织。在玻璃底培养皿中加入一滴无钙台氏液缓冲液。将EDL肌条平铺于培养皿中，并迅速尽可能吸除多余液体。随后，使用防水透明胶带将两端肌腱牢固固定。先用无钙溶液洗涤纤维，再用2.5毫摩尔钙溶液洗涤两次。若发现纤维发生过度收缩或损伤，则弃去该纤维；选取健康的肌纤维，用一号洗涤溶液清洗三次，然后将其浸入改良的类细胞内去膜溶液中孵育五分钟。在体视显微镜下，使用固定在针 holder 上的钨针机械去膜，纤维将重新封闭，并在横管系统中截留与钙结合的罗丹明5N。获取健康的单根完整肌纤维，或至少仍附着部分肌腱的此类纤维束，在我看来是整个实验过程中最具挑战性的步骤之一，紧随其后的是将这些纤维转移到最终实验腔室的始终非常困难的操作。在此过程中，纤维可能发生过度收缩，甚至可能断裂。因此，如果你获得了健康的纤维，后续的机械去膜操作本身就会容易得多。将纤维与含 20 µM Fluo-5N AM 的去膜溶液共同孵育。孵育后，用洗涤液二进行充分洗涤，并继续孵育30分钟，以确保染料完全去酯化。随后，可使用共聚焦显微镜结合60倍物镜观察感兴趣区域的纤维。在纤维灌注SR加载及SR耗竭溶液的同时，同步记录每种染料的荧光信号。采用细胞内钙离子检测方法检测了KYS、SE one 50细胞中的SOCE活性。细胞共转染了RFP以及针对编码A-S-O-C-E通道的OR I one基因的短发夹RNA，与对照组（黑色迹线）相比，敲低OR I one的表达导致SOCE活性降低。此外，还通过锰离子淬灭实验验证了KYC one 50细胞中的SOCE。在TG完全耗尽内质网钙库后，灌注锰离子引起显著的荧光下降。URA 信号丢失更陡的斜率表明 SOCE 活性更高。因此，经 A PB 处理的细胞中荧光缓慢下降，表明该化合物阻断了 SOCE 活性。锰离子淬灭速率取初始 10 秒内淬灭仍处于线性范围且未达饱和时的数据计算得出，类似的锰离子淬灭实验也在培养的肌肉细胞中进行。在此情况下，锰与tg同时施加。当TG耗尽SR钙库时，荧光淬灭斜率逐渐改变，直至达到最大速率。该S形曲线表明在此实验条件下SOCE呈梯度激活。在共聚焦成像下，对去膜纤维进行染料Road 5和TT区室染色，显示出如红色通道所示的典型哺乳动物双峰模式。在用Fluo 5 NM溶液灌注加载肌浆网（SR）后，绿色通道中可见典型的点状SR分布模式。当去膜纤维灌注SR耗竭溶液后，Road 5 N和Fluo 5 N的荧光强度均增加，SR区室和TT区室的荧光信号开始下降，表明肌浆网钙库耗竭与SOCE激活之间存在耦联关系。观看本视频后，您应能充分掌握如何获取首批可存活、健康且完整的肌纤维。这些肌纤维的两端需保留足够的肌腱，以便有效进行皮肤剥离操作，最终使实验者获得具有生理相关性的实验样本，从而带来显著优势。请务必注意，本研究中使用的所有荧光染料通常对光敏感，因此在操作过程中应始终采取避光措施，例如在避光培养皿中进行染料加载，并在暗室中完成洗涤步骤。掌握该技术后，可在数小时内完成操作。我们建议首先获取数条完整纤维，以提高机械剥离步骤的成功率；此外，若需在发育后对这些纤维进行过夜培养，也应如此操作。该技术为钙信号传导领域的研究人员探索钙库耗竭型钙离子内流在癌细胞生长与死亡中的作用奠定了基础。肌肉的生理与病理功能。

fluorescence-based-measurement-store-operated-calcium-entry-live

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于荧光测定活细胞中的钙进入商店经营：从培养的肿瘤细胞，骨骼肌纤维

我们介绍了一种利用激光扫描共聚焦显微镜从活细胞中分离快速（微秒级）钙信号与较慢钙流的方法。该方法通过记录细胞内数百像素的线扫描，检测钙离子指示剂的荧光强度波动。利用直方图分析，可分离出不同时间尺度的钙流信号。...

测量心肌细胞中的快速钙离子流

来源： Heredia, D. J., et. al. 小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号的离体成像。J. Vis. Exp. (2018)...

转基因小鼠膈肌神经肌肉接头处钙动力学的荧光成像

本文介绍了一种直接测量完整骨骼肌纤维中钙火花的方法，钙火花是肌浆网 中钙离子（Ca2+）释放的基本单位。该方法利用渗透压应激诱导分离的肌纤维中兰尼碱受体介导的Ca2+释放。通过分析细胞内Ca2+信号的动力学特征及其稳态调控能力，可用于评估生理和病理状态下肌肉的功能。...

完整骨骼肌纤维中钙火花的评估

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。...

使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（ΔΨm）来摄取钙离子（Ca2+），从而调控细胞质内的Ca2+信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca2+摄取和ΔΨm的方法。...

活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+...

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

该方法提供了一种将光遗传学与基因编码的钙离子传感器相结合的技术，用于成像模式生物 C. elegans...

在体钙成像技术在 C. elegans 体壁肌肉中的应用

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本文介绍了一种活体成像方法，用于观察嵌入性骨细胞在机械刺激下诱导的钙信号传导 体内...

一种用于研究小鼠骨细胞中负荷诱导的钙信号动态变化的荧光活体成像方法

功能位点定向荧光法是一种实时研究蛋白质结构域运动的方法。对该技术进行改良并应用于天然细胞后， now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+...

利用功能性定点荧光测定法在原代细胞中研究骨骼肌兴奋性

本文介绍了一种利用Fura-2/AM染料进行单细胞Ca2+成像，实时定量监测细胞内钙离子（Ca2+）浓度的方法。该技术可实现高效的染料加载，并通过荧光强度比值准确计算Ca2+水平，是一种简便、快速适用于科研应用的技术方法。...

单细胞钙成像用于研究钙离子通道的激活

学习使用荧光指示剂检测肿瘤细胞和骨骼肌纤维中钙库操纵性钙内流的方法。该技术通过共聚焦成像实现高时空分辨率，为高通量筛选和钙信号研究提供可靠工具。

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

探索更多视频