基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

本实验方法利用基于荧光的技术，研究癌细胞和骨骼肌细胞中由储存库调控的钙离子内流（SOCE）的特性。通过记录活细胞中URA2的荧光信号（该信号对细胞内钙离子浓度敏感），实现对SOCE的检测。此外，通过在对钙离子浓度不敏感的波长下加入锰离子并测定其荧光淬灭速率，可直接反映SOCE的激活状态，从而用于SOCE的研究。

在结构特化的骨骼肌细胞中，分离并剥离肌肉，制备肌纤维。随后用低亲和力钙指示剂处理肌纤维，并监测其内部荧光。

这些方法表明，SOCE 存在于非兴奋性细胞和骨骼肌中，其激活呈梯度性，并与细胞内钙库含量紧密偶联。与电生理学、膜片钳等其他方法相比，这种基于荧光素的技术主要优势在于使用方便，可应用于细胞群体研究或高通量筛选。在进行酯酶测定、代谢环境检测及镁离子螯合实验时，选择合适的实验条件至关重要。

因此，对每台仪器进行校准至关重要，因为每台仪器都存在差异。该方法的可视化演示非常关键，因为单根肌纤维的机械剥离操作难以掌握，需要特殊的动手训练，深入理解并学习显微解剖技术，仔细观察，以及极大的耐心。在开始之前，需校准显微镜系统，以实现对URA-2荧光的测量。尽管钙结合与钙-URA-2的激发波长分别为340纳米和380纳米，但在特定显微镜系统中，URA-2用于钙测量的最佳比率动态范围可能出现在其他波长下。

这些波长的变化是由于添加了不同的光学元件，导致光路发生变化所致。同样，每个系统的ISO痉挛点也各不相同。因此，通过光谱扫描来确定这些波长非常重要。

或者，可以通过在任意两个波长下仅使用荧光记录明筛过程，使得最终数值与钙离子浓度无关。首先，将表达RFP并含有针对I one的特异性HRNA或随机序列的质粒转染至培养的K Ys SE约50个细胞中，转染时间为48小时。将转染后的细胞培养在玻璃底培养皿中。

然后移除培养基，并用平衡盐溶液（BSS）冲洗细胞。冲洗后，加入含有 2 µM RA 2:00 AM 的 1 毫升 BSS，将培养皿置于 37°C 下孵育 40 分钟。将细胞在室温下放置 15 分钟，使细胞内的 URA 2:00 AM 转化为 URA two。

然后在显微镜下用BSS洗涤培养板两次。在可视化模式下，选择表达RFP的细胞。选择激发比模式，发射波长设为510纳米，激发波长设为350和390纳米。

该比值显示在第三个窗口中。接下来，记录细胞在灌注四种不同溶液时，在预设波长下的荧光信号。

同样，将KYSE150细胞加载fura-2后进行记录。在激发比值模式下，与先前步骤不同，选择360纳米作为激发波长。随后，在用五种不同的BSS溶液灌注细胞的同时，同步记录360纳米和390纳米处的荧光信号。

本实验方案中，需将 C2C12 细胞（一种小鼠成肌细胞系）培养于玻璃底培养皿中至融合状态，然后在含 2.5% 马血清的分化培养基中诱导其分化为成肌管细胞。用终浓度为 5 µM 的 RA-2000 AM 溶于 BSS 溶液中对 C2C12 成肌管细胞进行负载，并孵育 40 分钟。随后加入终浓度为 20 µM 的苯甲基磺酰胺（benzothiazole sulfonamide，BTS）以抑制肌肉收缩及其引起的运动伪影。

将细胞在室温下孵育15分钟，并在所有溶液中保持BTS。接下来加载四个。将平衡盐溶液注入灌注系统。

如前所述，在每次灌注过程中记录选定细胞在360和390纳米处的荧光。在本实验系列中，同时施加镁离子和硫代苯酯以监测镁离子猝灭效应。

当内质网钙库逐渐耗竭时，为分离趾长伸肌（extensor digitorum longus，EDL），将已处死小鼠的后肢侧向放置，从踝关节至膝关节处去除皮肤。切开表层肌肉组织以暴露EDL肌，并切断其上下两端的肌腱，从而游离出完整的EDL肌。

保持肌腱尽可能长非常重要。现在，为防止任何收缩，将 EDL 肌肉转移至含有 0.1 毫摩尔 EGTA 且无钙的 T road 溶液中，在体视显微镜下操作。将膝关节插入端的肌腱强制分为两半，并将 EDL 肌肉分成两个肌束。

重复该过程，直至获得八束肌腱。若任何一束中丢失了肌腱，则弃用该束。接着，夹住趾长伸肌（EDL）肌束条的两端肌腱，小心拉伸条带，直至剩下三到四根分离的单肌纤维，且每根纤维两端均保留完整的肌腱组织。

在玻璃底培养皿中加入一滴无钙台氏液缓冲液。将EDL肌条平铺于培养皿中，并迅速尽可能吸除多余液体。随后，使用防水透明胶带将两端肌腱牢固固定。

先用无钙溶液洗涤纤维，再用2.5毫摩尔钙溶液洗涤两次。若发现纤维发生过度收缩或损伤，则弃去该纤维；选取健康的肌纤维，用一号洗涤溶液清洗三次，然后将其浸入改良的类细胞内去膜溶液中孵育五分钟。在体视显微镜下，使用固定在针 holder 上的钨针机械去膜，纤维将重新封闭，并在横管系统中截留与钙结合的罗丹明5N。

获取健康的单根完整肌纤维，或至少仍附着部分肌腱的此类纤维束，在我看来是整个实验过程中最具挑战性的步骤之一，紧随其后的是将这些纤维转移到最终实验腔室的始终非常困难的操作。在此过程中，纤维可能发生过度收缩，甚至可能断裂。因此，如果你获得了健康的纤维，后续的机械去膜操作本身就会容易得多。将纤维与含 20 µM Fluo-5N AM 的去膜溶液共同孵育。

孵育后，用洗涤液二进行充分洗涤，并继续孵育30分钟，以确保染料完全去酯化。随后，可使用共聚焦显微镜结合60倍物镜观察感兴趣区域的纤维。在纤维灌注SR加载及SR耗竭溶液的同时，同步记录每种染料的荧光信号。

采用细胞内钙离子检测方法检测了KYS、SE one 50细胞中的SOCE活性。细胞共转染了RFP以及针对编码A-S-O-C-E通道的OR I one基因的短发夹RNA，与对照组（黑色迹线）相比，敲低OR I one的表达导致SOCE活性降低。此外，还通过锰离子淬灭实验验证了KYC one 50细胞中的SOCE。在TG完全耗尽内质网钙库后，灌注锰离子引起显著的荧光下降。

URA 信号丢失更陡的斜率表明 SOCE 活性更高。因此，经 A PB 处理的细胞中荧光缓慢下降，表明该化合物阻断了 SOCE 活性。锰离子淬灭速率取初始 10 秒内淬灭仍处于线性范围且未达饱和时的数据计算得出，类似的锰离子淬灭实验也在培养的肌肉细胞中进行。

在此情况下，锰与tg同时施加。当TG耗尽SR钙库时，荧光淬灭斜率逐渐改变，直至达到最大速率。该S形曲线表明在此实验条件下SOCE呈梯度激活。

在共聚焦成像下，对去膜纤维进行染料Road 5和TT区室染色，显示出如红色通道所示的典型哺乳动物双峰模式。在用Fluo 5 NM溶液灌注加载肌浆网（SR）后，绿色通道中可见典型的点状SR分布模式。当去膜纤维灌注SR耗竭溶液后，Road 5 N和Fluo 5 N的荧光强度均增加，SR区室和TT区室的荧光信号开始下降，表明肌浆网钙库耗竭与SOCE激活之间存在耦联关系。

观看本视频后，您应能充分掌握如何获取首批可存活、健康且完整的肌纤维。这些肌纤维的两端需保留足够的肌腱，以便有效进行皮肤剥离操作，最终使实验者获得具有生理相关性的实验样本，从而带来显著优势。请务必注意，本研究中使用的所有荧光染料通常对光敏感，因此在操作过程中应始终采取避光措施，例如在避光培养皿中进行染料加载，并在暗室中完成洗涤步骤。

掌握该技术后，可在数小时内完成操作。我们建议首先获取数条完整纤维，以提高机械剥离步骤的成功率；此外，若需在发育后对这些纤维进行过夜培养，也应如此操作。该技术为钙信号传导领域的研究人员探索钙库耗竭型钙离子内流在癌细胞生长与死亡中的作用奠定了基础。

肌肉的生理与病理功能。