荧光检测方法，为微流体液滴平台

您好，我是 Jersey。大家好，我叫 Shabi，我们都是伦敦帝国理工学院的博士后研究员，与 Andrew Di Melo 教授和 Josh Del 博士一起研究微流体液滴平台。基于液滴的微流体平台有望成为更高通量实验的候选者，因为它们可以以非常高的精确定义体积生成，并且它们的竞争对手的生成频率可以高达几公斤。

此外，由于感兴趣区域最晚可以封装在几升的隔室中，因此可以消除串扰和分散，并且可以更准确地对分析过程进行计时。在我们小组中，我们已经成功地将 micro droplet 平台应用于许多应用程序。例如，聚合酶链反应、纳米颗粒合成和单分子细胞测定。

必须有效地提取、利用和利用这些系统中生成的大量信息。在这方面，选择的检测方法应该是正确的，提供高灵敏度和低检测限，适用于一系列分子种类，无损，并且能够以简单的方式与微流体设备集成。为了满足这一需求，我们开发了一套实验工具和方案，能够从小体积环境中提取大量物理信息，并适用于各种物理、化学和生物因素的分析。

在该协议中，我们将介绍应用于在 Dropbox 中检测单个细胞和映射混合过程的方法。传统上，微流体芯片是使用光刻方法在聚二甲基 Sloane PGMS 中制造的。这个过程应该在洁净室设施中获得微流体通道 Spinco，SU eight 50 在硅片上软烘烤在 65 度和 95 度的热板上以蒸发溶剂并使薄膜致密化冷却后，暴露 SU 八，在适当的掩模下用紫外线辐射抵抗， 冷却后再将晶片在 65 度和 95 度烘烤。

在搅拌的同时，使用适当的显影液显影未暴露的区域。使用新鲜的 EC 溶剂冲洗晶片，然后在气体下干燥以产生干净的表面。用己烷和甲醇洗涤液处理晶片。

此外，为了完成 esate master 制造过程，将吸附剂在干燥液中蒸发到表面上 40 分钟。为了形成结构化的微流体基材，我们将 S 保护剂 1 8 4 混合成 10：1 的树脂交联剂比例，并将其拉到母版上。将其在干燥液中脱气并在 65 度下固化设备。

切开固化的 PDMS 并将其从母版上剥离。使用活检打孔器为流体管创建通路孔。在 65 度下固化另一层 PDMS 20 分钟。

将准备好的顶层放在底层上，在 65 度下固化过夜。将培养皿中的薯片去皮，切丁。一旦芯片被制造出来，它们就可以通过注入感兴趣的溶液来使用。

用所需的溶液填充注射器，确保管道的任何部分都没有气泡残留。对于液滴生成，使用两个阶段。水性分散相包含目标试剂。

油相充当与针头针头一端具有相同内径的连续相配合管，将针头安装在注射泵上并确定所需的注入流速。对于每个相，建议油水流速的最小比率为 1，以避免水相润湿 PDMS，这会导致不稳定的液滴形成。将管路的另一端直接连接到 PDMS 基板上打孔的孔。

对于更复杂的解决方案，也可以实现二氧化硅、毛细管端口或连接器。将芯片的出口连接到管路上，并直接插入收集器，用于废液收集或进一步分析处理。设置完成后，有两种主要的微通道配置来生成液滴：流聚焦或 T 型液络部格式，因为使用这些几何形状将两种允许的流体聚集在一起以及随后在界面中形成的毛细管 ins 会产生巨大的力。

一噢分散小至几飞升的液滴是自发产生的。一旦产生液滴，就可以使用光学装置对其进行探测。光学系统设置以下协议。

使用具有自动亚微米定位能力的共聚焦显微镜和以与所涉及的 Fluor 瀑布吸收相匹配的波长工作的激光器。为了激发它们，使用以几兆赫兹的重复频率运行的脉冲激光器进行荧光寿命成像。痰实验使用光束转向镜和光学元件来控制光束高度和光束方向。

使用二向色镜将激光束反射到物镜中。如果同时使用两个激光器，则可以安装双波段 diic 反射镜。为了实现两个激光束的反射，请使用无限远校正高数值孔径 NA 显微镜物镜将激光聚焦到微流体通道内的紧密焦点。

使用相同的高 NA 物镜收集样品在微流体通道内发射的荧光，并通过相同的二向色镜透射。使用单波段或双波段发射滤光片去除任何残余激发光。将荧光发射聚焦到 75 微米针孔上。

使用平凸透镜。将针孔定位在显微镜物镜的共聚焦平面上。使用另一个二向色镜将荧光信号分流到两个检测器上。

用发射滤光片过滤二向色镜反射的荧光，并用平凸透镜将其聚焦到第一个检测器上。对于涉及二次红色荧光灯的实验，使用另一个发射滤光片过滤双镜透射的荧光，然后用另一个平凸透镜将其聚焦到第二个检测器上。使用雪崩光电二极管检测荧光光子。

对于荧光数据采集，将来自雪崩光电二极管检测器的电子信号耦合到多功能 DAQ 设备，以便在个人计算机上运行数据记录。对于痰实验，使用脉冲激光器并将检测器连接到在单独 PC 上运行的时间相关单光子计数 TCS PC 卡。该卡允许获得荧光寿命数据。

使用 TCS PC 方法。每个检测到的荧光光子都与一个入射激光脉冲相关，因此每个发射的荧光光子都被分配了一个延迟时间。该数据可以拟合到单个或多个指数衰减曲线，以获得荧光团辐射率的估计值。

我们现在知道，从生物学、物理学和化学的角度来看，细胞都是高度异质的。因此，理想情况下，我们应该一次分析每个单元格。但是，应以更高的通量进行分析，以便我们能够收集足够的定量信息以得出可靠且有意义的结论。

这里我们有一个将大肠杆菌细胞封装在单个液滴中的例子，这样就可以执行原样作。使用已培养过夜的大肠杆菌前 10 大菌株。为了检测细胞的活力，请使用 cyto nine 和碘化丙啶。

两种染料都是 DNA 间整理染料，它们的荧光强度增加了 20 倍以上。与 DNA 结合后，cyto 9 是一种绿色荧光染料，具有膜渗透性和碘化丙啶。它是一种红色荧光染料，具有膜不渗透性。

因此，活细胞发出绿色荧光，而死细胞则同时发出绿色和红色荧光。在这里，我们可以看到液滴的产生和带有 T 结的单细胞封装。该视频是用高速摄像机录制的，但液滴可以以每秒数千次的速度产生。

细胞时，必须确保细胞培养物被稀释，以便细胞少于产生的液滴，防止细胞沉淀，这可能发生在注射器或管道中。在注射器内使用磁力搅拌棒，使细胞均匀分布在溶液中。使用非常细的 50 微米管将注射器连接到微芯片。

这确保了管道内的快速流速，从而防止细胞沉淀。以下是基于细胞的实验中照片计数作为时间函数的典型示例。映射液滴内的混合过程。

可以使用两种具有不同寿命的不同荧光 4 产生液滴。在流动的液滴中，会产生流场，最终将两种最初分离的溶液混合，以增强混合过程。流场的对称性可以通过使用缠绕通道来改变。

为了探测液滴，将光学探针体积聚焦在液滴沿其流动的微通道高度的一半处，从通道的一侧开始，沿通道的整个宽度进行每次实验。以 1 微米的间隔。实施一种算法，将与液滴相关的单个爆发与油相的噪声背景区分开来，并确定每个爆发的持续时间。

实施第二种算法，以提取在执行实验的特定宽度处沿每个液滴长度的延迟时间和强度值。然后使用最大似然估计器 MLE 算法来评估实验中每个液滴的荧光寿命。平均实验中所有液滴的寿命值可以减少 MLE 计算的最终误差。

探测的液滴越多，获得生命周期轨迹后的误差就越小。对于每个宽度，将所有轨迹合并到 2D 地图中。由于每个生命周期值都与两个 4 菌群的特定混合物相关联，因此可以获得浓度或混合图。

我们已经描述了微器件的制造、实验装置以及微液滴形成和区域封装以及过程（液滴）的光学检测的相关协议。这两个示例选择了液滴中单个细胞的检测和混合过程的映射。流动的液滴内部代表了目前正在研究的液滴微流体的常见应用。

正如所提出的实验所说明的那样，液滴微流控平台的使用具有某些吸引人的特性，例如高通量导致完美的限制和更高的可重复性。生成的大量信息以及生成此信息的最高速度。DU 需要使用具有最高时空分辨率的快速检测方法，才能从这种小型化平台中获得全部优势。

在这种情况下，我们证明了使用高精度荧光光谱技术是可能的。