Name: 荧光检测方法，为微流体液滴平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: 学习微流体液滴平台的高通量荧光检测方法，用于单细胞封装与混合过程映射。本方案结合共聚焦显微镜与荧光寿命成像技术，实现飞升级液滴的高灵敏度分析。

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作者谨此感谢以下研究理事会和资助项目的支持：EPSRC、HFSP、韩国国家研究基金会（资助编号 R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410）。

1. 微芯片制备
<ol>
	<li>SU8 原版制作 
	为了获得微流控通道的 40 μm 高度，以 3000 rpm 在 Si 晶圆上旋涂 SU8-50（MicroChem Corp.）30 s。在加热板上进行软烘烤 65°C 5 分钟 95°C 30分钟，以蒸发溶剂并使薄膜致密化。冷却后，用360–440 nm的辐射光对SU8光刻胶进行曝光，剂量为300 mJ/2 在适当的掩模下曝光后，将晶圆烘烤 65°C 2 分钟 95°C 4分钟。冷却后，在搅拌条件下用未曝光区域显影剂（Micrpoposit EC溶剂，Chestech）显影5分钟。5 使用新鲜的EC溶剂冲洗晶圆，然后在气流下干燥以获得洁净的表面。用正己烷和甲醇依次洗涤晶圆。最后在表面蒸发沉积三氯(1,1,2,2-四氟辛基)硅烷（在干燥器中放置40分钟），完成SU8模具的制备。</li>
	<li>PDMS 固化、切割与打孔 
	为了制备结构化的微流控基底，我们将 Sylgard 184（Dow Corning）以 10:1（w/w）的树脂与交联剂比例混合，然后浇注于模具上。在干燥器中脱气，随后将器件（顶层）在 65°C将固化后的PDMS剪下并从模具上剥离。使用穿刺活检打孔器制备用于流体管路的通孔。将另一层PDMS（8 g树脂均匀涂布于10×10 cm培养皿中）在 65°C. 将制备好的上层置于底层之上，然后在 65°C将芯片从培养皿中剥离并切碎后使用。</li>
</ol>
	
2. 实验设置
<ol>
	<li>微流控装置
		<ol>
			<li>使用注射器（来自贝克顿·迪金森公司或SGE分析科学公司的塑料或玻璃注射器）装入所需溶液，并确保管路各部分均无气泡残留。在液滴生成过程中使用两相体系：水相（分散相）包含感兴趣的试剂（例如细胞在培养基中的悬浮液，或分子荧光探针的溶液）；油相在此作为连续相，通常由油与表面活性剂的混合物组成，例如2% Raindance 表面活性剂（RainDance Technologies）溶于氟化油（3M Fluorinert 电子液体 FC-40）；或2% Span 80（Croda）溶于矿物油。</li>
			<li>将聚乙烯管（Harvard Apparatus）的一端连接至与注射器针头内径相同的针头上。管路应裁剪至尽可能短的长度，以最大限度减少因振动扰动引起的流动不稳定性。</li>
			<li>将管路的另一端直接连接至PDMS基底上打孔的位置。也可采用更复杂的连接方式，例如使用石英毛细管接口或连接器（如Upchurch Nanoports），以实现微流控芯片与管路之间更稳固的连接。将芯片的出口端连接至管路，并引导至收集容器（用于废液收集或进一步分析物处理）。</li>
			<li>将注射器安装在注射泵上（例如PHD 4400 Hpsi可编程注射泵，Harvard Apparatus），并为每一相设定所需的输注流速（通常为每分钟数微升量级）。建议油相与水相流速比至少为1，以避免水相对PDMS的润湿，从而防止液滴生成不稳定（具体取决于器件几何结构）。出于同样原因，在引入水相之前，建议先单独用油相冲洗整个微流控通道。本实验所采用的最终装置示意图见图2a。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>光学系统装置
		<ol>
			<li>为在微流控通道内对微小体积（低至数皮升）进行高空间与时间分辨率探测，使用共聚焦显微镜（具备自动亚微米定位功能）。</li>
			<li>使用理想情况下具有高量子产率的水溶性荧光分子。采用激光激发，其波长应与所用荧光探针的吸收波长相匹配。例如，常见的荧光分子如异硫氰酸荧光素（FITC）和Alexa-Fluor 488可使用488 nm半导体激光器（例如PicoQuant Gmbh，LDH-P-C-485）高效激发；Texas Red或别藻蓝蛋白（APC）等荧光分子则可使用633 nm的He/Ne激光器（例如Newport R-31425）高效激发。</li>
			<li>在进行荧光寿命成像（FLIM）实验时，使用重复频率为数MHz（脉冲间隔数纳秒）的脉冲激光器，并选择具有足够差异化寿命特性的荧光探针。</li>
			<li>使用光束转向镜和光学元件控制光束高度及方向。</li>
			<li>使用二向色镜将激光束反射至物镜。若同时使用两束激光，可安装双通带二向色镜以反射两束激光（例如，对于488 nm和633 nm激光，Chroma Technology Corporation的z488/633rdc镜为理想选择）。</li>
			<li>使用无限远校正、高数值孔径（NA）的显微物镜（例如Olympus 60倍/1.2 NA水浸物镜）将激光聚焦于微流控通道内的极小光斑。当使用较高微通道（>100 μm）时，应选择合适的工作距离足以覆盖微通道全高的物镜。</li>
			<li>使用同一高NA物镜收集样品（位于微流控通道内）发出的荧光，并通过同一二向色镜透射。</li>
			<li>使用单通带或双通带发射滤光片（例如Chroma Technology Corporation的z488/633滤光片）去除任何残余的激发光。</li>
			<li>使用平凸透镜（例如+50.2 F；Newport Ltd.）将荧光发射聚焦至75 μm的小孔上。将小孔置于显微物镜的共焦平面上。</li>
			<li>使用另一二向色镜（例如630dcxr，Chroma Technology Corporation）将荧光信号分束至两个探测器。</li>
			<li>将被二向色镜反射的荧光通过发射滤光片（例如Chroma Technology Corporation的hq540/80 m滤光片）过滤，并使用平凸透镜（例如f = 30.0，内径25.4 mm，Thorlabs）聚焦至第一个（“绿色”）探测器。在涉及第二荧光探针（红色）的实验中，将透过二向色镜的荧光用另一发射滤光片（例如Chroma Technology Corporation的hq640lp滤光片）过滤，再通过另一平凸透镜聚焦至第二个（“红色”）探测器。</li>
			<li>使用雪崩光电二极管（例如AQR-141，EG&amp;G，Perkin-Elmer）检测荧光光子。最终装置示意图见图2b。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
3. 液滴生成与数据采集
<ol>
	<li>液滴生成方法
		<ol>
			<li>可采用两种主要的微通道构型来生成液滴：流动聚焦式或T型 junction 结构（图3a 和 3b）6,7。只要所形成的液滴宽度与微通道本身相当，这两种方法在效果上是等效的。利用这些几何结构将两种不相溶流体汇聚时产生的剪切力，以及界面处随之发展的毛细不稳定性，可自发形成单分散液滴（小至数飞升）。</li>
			<li>可采用不同方式对试剂进行包封：试剂可在芯片外预先配制并混合至目标混合物/浓度，或分别引入芯片内，在液滴形成前混合（图3c）。后一种方法灵活性更高，因为只需调节各流体的相对流速即可改变混合物组成或浓度。需注意，在进行细胞包封时，注射器中的细胞悬液应持续搅拌，以避免在实验时间尺度内细胞发生沉降。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>荧光数据采集
		<ol>
			<li>将雪崩光电二极管探测器（见2.2.12节描述）输出的电子信号连接至运行于个人计算机上的多功能数据采集设备（DAQ）用于数据记录（例如 PCI 6602，National Instruments）。</li>
			<li>对于荧光寿命成像（FLIM）实验，将探测器连接至另一台独立计算机上运行的时间相关单光子计数（TCSPC）卡（例如 TimeHarp 100，PicoQuant GmbH）。该卡可基于TCSPC方法获取荧光寿命数据：每一个检测到的荧光光子均与一个入射激光脉冲相关联，因此每个发射的荧光光子均被赋予一个延迟时间。该数据可拟合为单指数或多指数衰减曲线，以估算荧光团的辐射速率系数。使用探测器的仪器响应函数（IRF）对原始数据进行反卷积处理：IRF可通过低浓度金胺-O（Auramine-O）溶液获得（其荧光寿命为数皮秒）8。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
4. 液滴内细胞识别与混合区域的定位
<ol>
	<li>细胞识别与液滴内混合过程的映射
		<ol>
			<li>使用 Escherichia coli Top 10 菌株进行活力检测实验。将细胞在LB肉汤培养基中过夜培养，并在实验前将光密度调整至0.5。</li>
			<li>使用0.4 μM SYTO9和1 μM碘化丙啶检测细胞活力。两者均为DNA嵌入型荧光染料，与DNA结合后荧光强度增强超过20倍。SYTO9为绿色荧光染料，可穿透细胞膜；碘化丙啶为红色荧光染料，不能穿透完整细胞膜。因此，活细胞呈现“绿色”荧光，而死细胞则同时显示“绿色”和“红色”荧光信号。</li>
			<li>采用2.2节中介绍的装置进行绿色/红色荧光检测。</li>
			<li>使用便携式微型磁力搅拌器（Utah Biodiesel Supply，犹他州）搅拌细胞悬液，将7 mm磁力搅拌子置于3 mL BD Plastipak注射器中，以防止细胞沉降。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>利用荧光寿命成像（FLIM）映射混合事件
		<ol>
			<li>将光学探测体积聚焦于液滴流动的微通道高度一半的位置。</li>
			<li>由两种水溶液生成液滴（如图3c所示），每种溶液分别含有一个（无相互作用的）荧光探针，其具有不同的特征荧光寿命。</li>
			<li>从通道一侧开始，在整个通道宽度范围内以1 μm为间隔逐点进行实验。当激光束聚焦于通道边缘附近时，荧光强度会急剧下降，由此可清晰识别通道边界。</li>
			<li>设计算法以区分与液滴相关的信号脉冲和油相的背景噪声，并确定每个脉冲的持续时间。</li>
			<li>设计第二个算法，用于提取在特定宽度位置处沿每个液滴长度方向的延迟时间和荧光强度值。9</li>
			<li>随后采用最大似然估计（MLE）算法评估实验中每个液滴的荧光寿命。8 对实验中所有液滴的寿命值进行平均，可降低MLE计算的最终误差（检测的液滴数量越多，误差越小）。</li>
			<li>当获得每个宽度位置的寿命轨迹后，将所有轨迹整合为一张二维图。由于每个寿命值对应于两种荧光探针的特定混合比例，因此可获得浓度（或混合程度）分布图。</li>
			<li>可选地，通过在微流控通道高度方向的不同位置重复本实验，可轻松获得液滴混合的三维图谱。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>将原始实验数据文件重新解析为适当的计算语言，以便进一步分析（例如，包含光子计数随时间变化的文本文件，可直接提取到 Matlab 中进行数据处理和分析）。对于更复杂实验（如 FLIM）的数据文件，或为了运行最大似然估计（MLE）算法，或从寿命轨迹构建混合模式的二维图谱，可能需要编写特定代码来访问文件中的数据。</li>
</ol>
6. 代表性结果
细胞识别
在基于细胞的实验中，光子计数随时间变化的典型示例如图4a和c所示，时间跨度为两百毫秒。重要的是，Luria–Bertani肉汤（LB培养基）作为弱荧光背景，可定义水相液滴的边界，而在此背景之上，可清晰分辨出对应于单个细胞存在的显著光子脉冲。LB荧光背景呈现出近似矩形的横截面（以红色和绿色虚线标出）。
荧光爆发的半高全宽（FWHM）来源于 E. coli 细胞的信号持续时间比背景液滴事件短30倍，这与液滴的相对长度（40微米，对应体积为30皮升）一致。 E. coli 细胞（1.5–2.0 微米）。10
利用双通道检测系统，可通过分析绿色和红色通道来区分活细胞与死细胞的存在。图4b和d显示了描述每个液滴中细胞数量的概率分布。
利用荧光寿命成像显微技术（FLIM）对混合事件进行定位
分子荧光寿命是单个荧光团的一种内在性质，仅受其化学环境的影响。因此，通过测量荧光寿命可以获得环境信息（如溶液 pH 值、温度、极性和黏度），其分辨率和精确度优于依赖于实验因素（如浓度、激发光强度和光学收集效率）的时间积分荧光测量方法。9,11
如其他地方所述8，可通过使用两种具有不同荧光寿命值的荧光染料来绘制液滴内部的混合模式。在一个包含两种（非相互作用）荧光物质的混合物中，荧光衰减将呈现双指数形式，如公式1所示： 
<img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq1.jpg" alt="指数衰减方程 I(t)=α₁e⁻ᵗ/τ₁+α₂e⁻ᵗ/τ₂，瞬态吸收分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式1">
各个寿命组分定义为 τ1 和 τ2；每个组分的振幅分别由 α1 和 α2 表示。平均寿命可定义如下： 
<img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq2.jpg" alt="化学动力学方程图示，τ̅=τ₁β₁+τ₂β₂，用于说明反应动力学。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2">
其中 β1 和 β2 分别为各组分的分数，定义如下： 
<img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq3.jpg" alt="公式：β1=α1/(α1+α2)，β2=α2/(α1+α2)；数学表达式。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3">
由于探测体积固定，液滴流经该位置，因此可获得在特定宽度下液滴长度方向上寿命值的变化轨迹。在图5a中可以观察到基于6000个液滴平均得到的特定宽度下的典型轨迹。
将贯穿整个通道宽度的轨迹合并，可形成二维浓度（或混合）图。典型结果如图5b所示。
通过对大量液滴的结果进行平均，可显著降低所得结果的标准误差（图5a 的标准误差为1%，置信区间为95%）。寿命轨迹的测定方法假设所有液滴在实际中是相同的。这一假设在很大程度上成立，主要原因有两个：如果液滴存在显著差异，则所获得的平均寿命轨迹将呈现更平缓、发散性更弱的特征（而实验中始终检测到沿平均液滴长度方向存在明显的寿命差异）；此外，无论分析的具体液滴个体如何，或计算中所用液滴数量多少，实验结果均具有良好的可重复性。8
<img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig1.jpg" alt="微加工光刻工艺示意图，涉及SU8、PDMS及芯片键合。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 微流控芯片制备的工艺流程图。
<img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig2.jpg" alt="采用激光激发的微流控装置；使用氦氖激光器和半导体激光器进行荧光分析的示意图。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. a) 表示用于液滴生成的注射泵和注射器连接至微流控芯片的示意图；b) 典型光学装置的示意图，用于双激光–双荧光团（绿色和红色）的激发与检测。DC = 二向色镜，EM = 发射滤光片，L = 透镜，PH = 针孔，APD = 雪崩光电二极管检测器。
<img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig3.jpg" alt="微流控液滴生成示意图：流动聚焦 vs. T型 junction；水相，油相流动。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 芯片上液滴形成策略：a）流动聚焦构型；b）T型 junction 构型；c）在液滴中对两种原本分离的水相试剂进行芯片上封装。
<img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig4.jpg" alt="色谱研究中时间分辨强度与细胞概率分析的图示。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4. 记录的 0.2 秒光学信号轨迹，对应于 (a) 死亡细胞和 (c) 活细胞（细胞悬液流速：1 μl min-1，油相流速：2 μl min-1）。每个拱形信号对应于形成水相液滴的弱荧光 LB 培养基，液滴边界以虚线标示。绿色信号表示在 633 nm 波长下的检测信号，红色信号表示超过 633 nm 波长的检测信号。细胞通过 DNA 插入染料产生的垂直尖峰信号加以区分。(b) 死亡细胞和 (d) 活细胞在单个液滴内细胞占据的概率分布。
<img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig5.jpg" alt="荧光寿命分析；图表和热图显示完全混合动力学；Str-AF488, FITC。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5. a) 在特定宽度下，沿液滴长度方向典型的平均寿命轨迹；b) 将沿液滴全宽度探测到的所有平均轨迹整合为二维寿命图（或浓度图，以 % FITC / % Str-AF488 表示）的典型表示。

<ol><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li>
<li>Zheng, B., Angew, I. smagilov, F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid%2FLiquid%2FGas+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li>
<li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplets%3A+A+sea+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li>
<li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li>
<li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li>
<li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+%CE%BCs+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 μs Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li>
<li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li>
<li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li>
<li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们描述了用于微液滴生成、试剂包封以及对处理后的液滴进行光学检测的微流控装置的制备方法、实验装置及相关操作流程。所选的两个示例（液滴中单细胞的检测以及流动液滴内部混合过程的表征）代表了当前正在利用液滴微流控技术广泛研究的常见应用。
如实验所示，液滴微流控平台具有一些显著优势，例如高通量、近乎完美的限域性以及高重复性&#x2026; 尽管产生了大量信息，并且信息生成速度极快，但若要充分发掘这些微型化平台的优势，仍需采用具有高时空分辨率的快速检测方法。本文中，我们证明了利用高精度荧光光谱技术可实现这一目标。特别是荧光寿命成像（FLIM）检测技术（采用重复周期短至数纳秒的脉冲激光）展现出从快速流动的液滴（约每秒200个）中获取高速信息的能力。在此情况下，检测事件的时间分辨率可低至1 &mu;s. 在液滴尺寸和浓度的限制方面，使用更高数值孔径的物镜和更高功率的激光器，可轻松实现对小至5 μm的液滴中纳摩尔浓度（nM）物质的检测 &mu;m（液滴尺寸的限制由光刻制造工艺和亚微米定位平台的分辨率决定）。 
微流控液滴是进行大规模实验的理想载体，可用于处理微量试剂，甚至可针对单个目标或事件。目前该技术的局限性在于难以高通量地从大量不同来源（数十或数百种）生成液滴。此外，对所生成的每一个单独液滴进行靶向和操控的困难，严重限制了这些技术的实际应用。因此，这些问题已成为重要研究工作的核心，旨在开发必要的技术解决方案，以使微流控液滴平台能够在高通量应用中成为研究与分析的标准参考方法。

<table><tbody><tr><td>荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-Alexa Fluor 488</td><td>试剂</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>全氟十氢化萘</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9900</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-全氟辛醇</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td>试剂</td><td>Premier Farnell UK LTD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>金胺-O</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861030</td><td></td></tr><tr><td>485 nm 脉冲二极管激光器</td><td>设备</td><td>PicoQuant</td><td>LDH-P-C-485</td><td></td></tr><tr><td>TCSPC 卡</td><td>设备</td><td>PicoQuant</td><td>TimeHarp 100</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>设备</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>z488rdc,</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>设备</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>雪崩光电二极管</td><td>设备</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>AQR-141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 top 10 菌株</td><td>细胞</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr></tbody></table>

微流控液滴平台的荧光检测方法

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

用于开展化学与生物学研究的微流控平台的开发，在很大程度上受到系统微型化所带来的多种潜在优势的推动。这些优势包括能够高效处理纳升至飞升级别的样品体积、易于集成功能性组件、天然适用于大规模多重分析、分析通量提高、控制性能增强以及仪器占用空间减小。1
近年来，人们对基于液滴（或分段流）的微流控系统的开发及其作为高通量实验平台的潜力产生了极大关注。2-4 在此类系统中，由于两相不混溶流体之间的毛细不稳定性，水相在油相中的乳液可自发地在微流控通道内形成。重要的是，可生成体积和组分均精确定义的微液滴，生成频率可达数千赫兹。此外，通过将目标试剂封装在由连续不混相流体分隔的独立微区室中，可消除样品间的串扰以及扩散性和泰勒（Taylor）效应引起的分散，从而显著降低交叉污染，并能够以极高精度控制分析过程的时间进程。另外，由于液滴内容物与通道壁面无直接接触（通道壁面被连续相润湿），可有效防止试剂在通道壁面上的吸附与损失。
一旦生成并处理了此类液滴，就有必要提取所需的分析信息。在这方面，理想的检测方法应具备快速、高灵敏度和低检测限的特点，适用于多种分子种类，具有非破坏性，并能以简便的方式与微流控装置集成。为满足这一需求，我们开发了一系列实验工具和方案，能够从小体积环境中提取大量光物理信息，并可用于分析广泛的物理、化学和生物参数。本文介绍了其中两种方法的应用实例，分别用于单细胞检测以及皮升级液滴内混合过程的成像。我们报道了完整的实验流程，包括微流控芯片的制备、光学系统的搭建，以及液滴生成与检测的过程。

基于液滴的微流控平台有望用于高通量实验，因其能够以千赫兹速率低成本生成皮升级、自成隔室的微小反应容器。通过与快速、灵敏且高分辨率的荧光光谱方法相结合，可高效地提取、利用并整合这些系统中产生的大量信息。

用于开展化学与生物学研究的微流控平台的开发在很大程度上受到一系列潜在优势的推动，这些优势包括……

您好，我是 Jersey。我叫 Shabi，我们两人都是伦敦帝国理工学院的博士后研究员，与 Andrew Di Melo 教授和 Josh Del 博士共同开展基于微流控液滴平台的研究。基于液滴的微流控平台是实现高通量实验的有力候选技术，因为这些液滴可以以非常高的频率生成，且体积精确可控，其生成频率可达每秒数千个。此外，由于感兴趣区域可以被封装在低至几升的隔室中，因此能够消除串扰和扩散，并能更精确地控制分析过程的时间。在我们课题组，我们已成功将微液滴平台应用于许多领域，例如聚合酶链式反应、纳米颗粒合成以及单分子细胞检测。这些系统产生的大量信息必须被高效地提取、利用和应用。在这方面，所选择的检测方法应当恰当，具备高灵敏度和低检测限，适用于多种分子种类，具有非破坏性，并能以简便的方式与微流控装置集成。为满足这一需求，我们开发了一系列实验工具和实验方案，能够在小体积环境中提取大量物理信息，并适用于广泛范围的物理、化学和生物体系的分析。在本方案中，我们将介绍应用于单细胞检测及 Dropbox 中混合过程映射的两种方法。微流控芯片传统上采用光刻技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）上加工制备。该过程需在洁净室设施中进行，以获得微流控通道。将 SU-8 50 光刻胶在硅片上旋涂成膜后，置于热板上于 65°C 和 95°C 分别进行软烘，以蒸发溶剂并使薄膜致密化；冷却后，使用适当的掩膜对 SU-8 光刻胶进行紫外光曝光，随后再次将硅片在 65°C 和 95°C 下烘烤。在搅拌条件下，使用适当的显影液对未曝光区域进行显影。用新鲜的EC溶剂冲洗晶圆，然后在气体环境下干燥，以获得洁净的表面。依次用正己烷和甲醇洗涤晶圆。此外，为完成模具的制备过程，需在干燥器中将粘附剂蒸发沉积到表面，持续40分钟。为了制备具有微结构的微流控基底，我们将Sylgard 184按10:1的树脂与交联剂比例混合，并将其浇覆在模具上。在干燥器中进行脱气处理，随后在65°C下固化器件。将固化后的PDMS切下并从模具上剥离。使用活检打孔器为流体管路创建通路孔。在65摄氏度下将另一层PDMS固化20分钟。将制备好的上层置于底层之上，在65摄氏度下过夜固化。从培养皿中剥离芯片并切碎。芯片制备完成后，即可通过灌注目标溶液进行使用。用所需溶液填充注射器，确保管路各部分均无气泡残留。在液滴生成过程中，使用两相液体：水相为分散相，含有目标试剂。油相作为连续相，使用一端与注射器针头尖端内径相同的连接管连接针头，将注射器安装在注射泵上，并设定所需的输注流速。对于每一相，建议油相与水相流速的最小比率为1，以避免水相润湿PDMS，否则会导致液滴生成不稳定。将管路的另一端直接连接至PDMS基底上打好的孔洞。对于更复杂的溶液体系，还可采用二氧化硅、毛细管端口或连接器。将芯片的出口端连接至管路，并引导至收集容器，用于废液收集或进一步分析处理。完成此设置后，微通道主要有两种构型可用于生成液滴：流动聚焦式或T型 junction 结构，其原理是利用这些几何结构使两种可相容流体汇聚时产生的剪切力，以及在界面处随之形成的毛细不稳定性。一种可自发生成体积小至数飞升的分散液滴。一旦液滴生成，即可通过光学装置对其进行检测。光学系统的设置遵循以下方案。使用具有自动亚微米定位功能的共聚焦显微镜，以及发射波长与所用荧光染料吸收波长相匹配的激光器。为激发荧光，采用重复频率为数兆赫的脉冲激光器进行荧光寿命成像。实验中利用光束转向镜和光学元件来调控光束高度及光束方向。使用二向色镜将激光束反射至物镜。若同时使用两束激光，可安装双通道二向色镜。为实现两束激光的反射，采用无限远校正的高数值孔径（NA）显微物镜，将激光聚焦于微流控通道内一个极小的焦点。使用相同的高数值孔径物镜和相同的二向色镜，收集微流控通道内样品发出的荧光。通过单通道或双通道发射滤光片去除任何残余的激发光。将荧光发射聚焦到一个75微米的针孔上。使用平凸透镜。将针孔置于显微镜物镜的共焦平面上。使用另一块二向色镜将荧光信号分束至两个探测器。使用发射滤光片过滤二向色镜反射的荧光，并通过平凸透镜将其聚焦到第一探测器上。对于涉及次级红色荧光染料的实验，使用另一发射滤光片过滤二向色镜透射的荧光，再通过另一个平凸透镜将其聚焦到第二探测器上。采用雪崩光电二极管检测荧光光子。进行荧光数据采集时，将雪崩光电二极管探测器输出的电子信号连接至多功能数据采集设备，并在个人计算机上运行数据记录程序。对于痰液实验，使用脉冲激光器，并将探测器连接至另一台计算机上运行的时间相关单光子计数（TCS PC）卡。该卡可用于获取荧光寿命数据。采用TCS PC方法。每个检测到的荧光光子均与入射激光脉冲相关联，因此每个发射的荧光光子都被赋予一个延迟时间。该数据可拟合为单指数或多指数衰减曲线，以估算荧光团的辐射速率。目前我们已知，细胞在生物学、物理学和化学层面上均具有高度异质性。因此，理想情况下，我们应当逐个分析每个细胞。然而，这些检测方法需要具备较高的通量，以便我们能够收集到足够的定量信息，从而得出可靠且有意义的结论。在此示例中，将大肠杆菌细胞包裹于单个液滴中，以便进行后续操作。使用过夜培养的 Top10 菌株大肠杆菌。为检测细胞活力，使用细胞计数试剂和碘化丙啶。这两种染料均为DNA嵌入性染料，与DNA结合后其荧光强度可增加20倍以上。Cytox Green是一种可穿透细胞膜的绿色荧光染料，而碘化丙啶是一种不可穿透细胞膜的红色荧光染料。因此，活细胞呈现绿色荧光，而死细胞则同时发出绿色和红色荧光。在此我们可以观察到液滴的生成以及通过T型 junction 实现的单细胞包裹。该视频使用高速相机拍摄，但液滴的生成速率可达每秒数千个。在包封细胞时，必须确保细胞培养物已被稀释，使细胞数量少于生成的液滴数量，并防止细胞发生沉降，沉降可能发生在注射器或管路中。在注射器内使用磁力搅拌子以保持细胞在溶液中均匀分布。使用非常细的管路（50 微米）将注射器连接至微流控芯片。这可以确保管路内具有较快的流速，从而防止细胞发生沉降。以下是基于细胞实验中光子计数随时间变化的典型示例。用于表征液滴内混合过程的分布情况。可以使用两种具有不同寿命的氟化液来生成液滴。在流动的液滴内部会产生流场，最终使原本分离的两种溶液混合，从而增强混合过程。通过使用蜿蜒通道，可以改变流场的对称性。为探测液滴，将光学探针的探测区域聚焦于微通道高度的一半位置，液滴沿该通道流动。从通道的一侧开始，以1微米为间隔，在整个通道宽度范围内依次进行每次实验。实施一种算法，以区分与液滴相关的单个脉冲信号和油相的噪声背景，并确定每个脉冲的持续时间。采用第二种算法，提取在实验所设定宽度下各液滴沿其长度方向的延迟时间和强度值。然后使用最大似然估计（MLE）算法评估实验中每个液滴的荧光寿命。对实验中所有液滴的寿命值取平均，可降低 MLE 计算的最终误差。探测的液滴越多，一旦获得寿命轨迹，误差就越小。对于每个宽度，将所有轨迹合并成一张二维图。由于每个寿命值都对应着两种荧光体特定的混合比例，因此可以得到浓度或混合比例分布图。我们描述了用于微液滴生成、区域封装及该过程中液滴光学检测的微装置制备、实验装置及相关实验方案。所选的两个示例分别为液滴中单细胞的检测以及流动液滴内混合过程的映射，代表了当前微液滴微流控技术研究中常见的应用。如实验所示，液滴微流控平台具有一些显著优势，例如高通量、完美的限域性以及更高的可重复性。此类平台产生的大量信息及其极快的信息生成速度，要求必须采用具有最高时空分辨率的快速检测方法，才能充分发掘这些微型化平台的潜力。在此情况下，我们证明了可以利用高精度的含氟光谱技术实现这一点。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

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