微流控液滴平台的荧光检测方法

大家好，我是Jersey。嗨，我叫Shabi，我们两人都是伦敦帝国理工学院的博士后研究员，与Andrew Di Melo教授和Josh Del博士共同从事微流控液滴平台的研究。基于液滴的微流控平台因其能够以非常高的通量生成体积精确可控的液滴，并且其生成频率可高达每秒数千个，因而成为实现高通量实验的有力候选技术。

此外，由于感兴趣区域可以被封装在低至几升的隔室中，因此能够消除串扰和扩散，并能更精确地控制分析过程的时间。在我们课题组，我们已成功将微液滴平台应用于多种场景，例如聚合酶链式反应、纳米颗粒合成以及单分子细胞检测。

这些系统产生的大量信息必须被高效地提取、利用和应用。在这方面，所选择的检测方法应当恰当，具备高灵敏度和低检测限，适用于多种分子种类，具有非破坏性，并能够以简便的方式与微流控装置集成。为满足这一需求，我们开发了一系列实验工具和方案，能够从小体积环境中提取大量物理信息，并可用于广泛范围的物理、化学和生物体系的分析。

在本实验方案中，我们将介绍两种用于检测单细胞及在 Dropbox 中绘制混合过程图谱的方法。微流控芯片传统上采用光刻技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上制备。该过程需在洁净室环境中进行，以制备微流控通道 Spinco、SU-8 50。首先将硅片在热板上进行软烘，温度分别为 65°C 和 95°C，以蒸发溶剂并使薄膜致密化；冷却后，使用紫外光透过特定掩膜对 SU-8 光刻胶进行曝光，随后再次将硅片在 65°C 和 95°C 下进行烘烤。

在搅拌条件下，使用适当的显影液对未曝光区域进行显影。用新鲜的EC溶剂冲洗晶圆，然后在气体氛围下干燥，以获得洁净的表面。依次用正己烷和甲醇洗涤晶圆。

此外，为完成模具的制备过程，需在干燥器中将粘附剂蒸发沉积到表面，持续40分钟。为了形成结构化的微流控基底，我们将Sylgard 184以10:1的树脂与交联剂比例混合，并将其浇注覆盖在模具上。在干燥器中进行脱气处理，然后在65°C下固化器件。

将固化后的PDMS切下并从模具上剥离。使用穿刺活检打孔器为流体管路创建通路孔。在65摄氏度下将另一层PDMS固化20分钟。

将制备好的上层置于底层之上，在65摄氏度下固化过夜。从培养皿中剥离芯片并切碎。芯片制备完成后，即可通过灌注目标溶液进行使用。

用所需溶液填充注射器，确保管路各部分均无气泡残留。在液滴生成过程中，使用两相体系：水相为分散相，含有目标试剂。

油相作为连续相，需使用一端与注射器针头尖端内径相同的导管连接至针头，并将注射器安装到注射泵上，设定所需的输注流速。对于每一相，建议油相与水相流速的最小比值为1，以避免水相润湿PDMS，否则会导致液滴生成不稳定。将导管的另一端直接连接至PDMS基底上打好的孔洞。

对于更复杂的溶液体系，还可采用二氧化硅、毛细管端口或连接器。将芯片的出口端连接至管路，并引导至收集容器，用于废液收集或进一步分析处理。完成此设置后，可通过两种主要的微通道构型生成液滴：流动聚焦式或T型 junction 结构，这是由于利用这些几何结构使两相可混溶流体汇聚时产生剪切力，以及在界面处随之形成的毛细作用所致。

可自发生成体积仅为数飞升的微小液滴。一旦液滴生成，即可通过光学装置对其进行检测。光学系统的设置遵循以下方案。

使用具有自动亚微米定位功能的共聚焦显微镜，并采用与所用荧光染料吸收波长相匹配的激光器。为激发荧光，使用重复频率为数兆赫兹的脉冲激光器进行荧光寿命成像。痰液实验中采用光束转向镜和光学元件来调控光束高度及光束方向。

使用二向色镜将激光束反射至物镜。如果同时使用两束激光，可安装双通道二向色镜。为了实现两束激光的反射，应采用无限远校正的高数值孔径（NA）显微物镜，将激光聚焦到微流控通道内的一个紧密焦点上。

使用相同的高数值孔径物镜和同一块二向色镜，收集微流控通道内样品发出的荧光。通过单通道或双通道发射滤光片去除任何残余的激发光。将荧光发射聚焦到一个75微米的针孔上。

使用平凸透镜。将针孔置于显微镜物镜的共焦平面上。使用另一块二向色镜将荧光信号分束至两个探测器。

使用发射滤光片过滤二向色镜反射的荧光，并通过平凸透镜将荧光聚焦到第一探测器上。对于涉及第二红色荧光染料的实验，使用另一发射滤光片过滤二向色镜透射的荧光，再通过另一个平凸透镜将其聚焦到第二探测器上。采用雪崩光电二极管检测荧光光子。

进行荧光数据采集时，将雪崩光电二极管探测器输出的电子信号连接至多功能数据采集（DAQ）设备，并在个人计算机上运行数据记录程序。对于痰液实验，使用脉冲激光器，并将探测器连接至另一台计算机上运行的时间相关单光子计数（TCS PC）卡。该卡可用于获取荧光寿命数据。

采用TCS PC方法。每个检测到的荧光光子均与入射激光脉冲相关联，因此每个发射的荧光光子都被赋予一个延迟时间。该数据可拟合为单指数或多指数衰减曲线，以估算荧光团的辐射速率。

目前我们已知，细胞在生物学、物理学和化学层面上均具有高度异质性。因此，理想情况下，我们应当逐个分析每个细胞。然而，这些检测需要以更高的通量进行，以便我们能够收集到足够的定量信息，从而得出可靠且有意义的结论。

在此示例中，我们将大肠杆菌细胞包裹在单个液滴中，以便进行后续操作。使用过夜培养的大肠杆菌 Top 10 菌株。为了检测细胞的活力，使用胞吐宁（cyto nine）和碘化丙啶（propidium iodide）。

这两种染料均为DNA嵌入性染料，与DNA结合后其荧光强度可增加20倍以上。细胞质染料为绿色荧光染料，具有膜通透性；碘化丙啶是一种红色荧光染料，不具有膜通透性。

因此，活细胞呈现绿色荧光，而死细胞则同时发出绿色和红色荧光。在此我们可以观察到液滴的生成以及通过T型 junction 实现的单细胞包裹。该视频使用高速相机拍摄，但液滴的生成速率可达每秒数千个。

在包封细胞时，必须确保细胞培养物已被稀释，使细胞数量少于生成的液滴数量，同时需防止细胞发生沉降，沉降可能发生在注射器或管路中。在注射器内使用磁力搅拌子以保持细胞在溶液中均匀分布。使用极细的管路（50 微米）将注射器连接至微流控芯片。

这可以确保管路内流速较快，从而防止细胞沉降。以下是基于细胞实验中光子计数随时间变化的典型示例。用于表征液滴内混合过程的分布情况。

可以使用两种具有不同寿命的氟化液体制备液滴。在流动的液滴内部会产生流场，最终使原本分离的两种溶液混合，从而增强混合过程。通过使用蜿蜒通道，可以改变流场的对称性。

为了检测液滴，将光学探针的测量体积聚焦于微通道高度的一半位置，液滴沿微通道流动，从通道的一侧开始，沿通道的整个宽度进行每次实验，间隔为一微米。实施一种算法，以区分与液滴相关的单个脉冲信号和油相的噪声背景，并确定每个脉冲的持续时间。

采用第二种算法，提取在实验所设定宽度下每个液滴沿其长度方向的延迟时间和强度值。然后使用最大似然估计（MLE）算法评估实验中每个液滴的荧光寿命。对实验中所有液滴的寿命值取平均，可降低 MLE 计算的最终误差。

探测的液滴越多，获得寿命轨迹后的误差就越小。对于每个宽度，将所有轨迹合并成一张二维图。由于每个寿命值都对应着两种荧光团的特定混合比例，因此可以得到浓度或混合比例分布图。

我们描述了用于微液滴生成、区域封装及液滴过程光学检测的微装置制备、实验装置及相关实验方案。所选的两个示例分别为液滴中单细胞的检测以及流动液滴内混合过程的成像，这些代表了当前微液滴微流控技术研究中的常见应用。

如实验所示，液滴微流控平台具有一些显著优势，例如高通量、完美的限域性以及更高的可重复性。此类平台产生的大量信息及其生成速度极快，因此若要充分发掘这些微型化平台的潜力，就必须采用具有最高时空分辨率的快速检测方法。

在此案例中，我们展示了利用高精度的含氟光谱技术可以实现这一点。