Name: 生长实验，以评估在酵母中的多聚谷氨酰胺毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习利用酿酒酵母评估多聚谷氨酰胺蛋白毒性的三种互补生长实验方法。通过平板点样和液体培养测定，可定量分析蛋白质错误折叠引起的细胞毒性，为神经退行性疾病研究提供可靠的实验平台。

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杜恩瓦尔德实验室的工作得到了美国衰老研究联合会（AFAR）、遗传性疾病基金会（HDF）和威廉·伍德基金会的资助。

1. 在酵母中表达有毒的多聚谷氨酰胺扩展蛋白
系统性分析已确定了在酵母中引发毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白的精确氨基酸序列7。这种有毒的多聚谷氨酰胺扩展蛋白包含一个位于氨基末端的FLAG标签，随后是亨廷顿蛋白（huntingtin）原始序列中的17个氨基酸、一个多聚Q区域，以及与荧光蛋白（GFP或CFP，见图1a）的羧基末端融合。当在可诱导且相对强效的GAL1启动子控制下表达时，含有46个或更多谷氨酰胺重复（例如72个和103个谷氨酰胺）的多聚谷氨酰胺扩展蛋白会在酵母中产生毒性7, 9。
如先前所述，聚谷氨酰胺（polyQ）的毒性仅在携带Rnq1p蛋白且其处于朊病毒构象[RNQ+]的酵母细胞中显现，例如酵母菌株W3039。有毒性的polyQ扩展蛋白在酵母中重现了polyQ生物学的核心特征，例如polyQ长度依赖性毒性（见下文）和聚集现象（图1b）。值得注意的是，有毒性的polyQ扩展蛋白并不会立即杀死酵母细胞；它们更倾向于损害或阻滞细胞周期及细胞分裂，从而减缓或抑制酵母菌落在平板或液体培养基中的生长（我们未发表的数据）。
2. 表达毒性多聚谷氨酰胺扩增蛋白的酵母细胞可能存在的问题
表达通常具有毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ）扩增蛋白的酵母细胞可能不会表现出任何生长缺陷 9这些多聚谷氨酰胺（polyQ）毒性抑制因子的遗传性质似乎并非基于简单的孟德尔式突变，因此其出现频率相对较高（未发表结果）。我们推测，这些自发产生的抑制因子可能是由于某些尚未明确的朊病毒被消除所致，这些朊病毒在调控polyQ毒性方面发挥的作用与[RNQ+]类似。这些自发产生的polyQ毒性抑制因子可能会影响任何旨在表征polyQ毒性或鉴定及研究polyQ毒性调节因子的实验的成功结果。
为避免这些自发性抑制因子频繁出现，请遵循以下已证明非常有效的预防措施：
<ol>
	<li>进行毒性实验时应使用新鲜的酵母细胞。不要长时间储存酵母。应频繁从冷冻保藏菌种中重新获取新鲜酵母菌落。</li>
	<li>应定期通过荧光显微镜监测毒性多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白的表达与聚集情况。</li>
	<li>在开始任何毒性检测之前，始终将酵母细胞培养在可抑制毒性多聚谷氨酰胺蛋白表达的培养基中（例如，含葡萄糖作为唯一碳源的选择性培养基）。</li>
	<li>每个多聚谷氨酰胺毒性实验应至少使用三个独立的转化子。</li>
</ol>
3. 生长实验
<ol>
	<li>针对每个实验条件，从含有毒性多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白的酵母细胞的三个独立转化子中，各挑取单菌落，分别接种于 3 ml 以葡萄糖为唯一碳源的选择性酵母培养基中。</li>
	<li>将这些培养物在 30 °C 下过夜培养。在此条件下，由于培养基中的葡萄糖抑制了多聚谷氨酰胺扩展蛋白的表达，细胞不表达该蛋白。注意不要使培养物过度生长；过夜培养物的 OD600（600 nm 波长光的吸光度）应保持在 1 以下。</li>
	<li>我们通常采用三种不同的检测方法来监测表达毒性多聚谷氨酰胺扩展蛋白的酵母细胞的生长缺陷：</li>
</ol>
3.1 平板培养
<ol>
	<li>将过夜培养的酵母菌液（在220 rpm振荡条件下培养）用含葡萄糖的选择性培养基稀释至OD600为0.0005（即OD600 = 0.5的菌液进行1:1000稀释）7。</li>
	<li>将每种稀释后的菌液各取50 μl均匀涂布于一个直径为10 cm的平板上，每个平板分别含有以葡萄糖或半乳糖作为唯一碳源的选择性培养基（每板约形成700个菌落）。</li>
	<li>将平板在30 °C下培养3至4天。培养结束后，拍摄每块平板的照片，并分别计数葡萄糖平板和半乳糖平板上的菌落数目。在理想条件下，当使用表达高毒性polyQ扩展蛋白（103Q）的酵母细胞时，半乳糖平板上应无菌落或仅有极少数菌落（图2a）。</li>
</ol>
3.2 点样实验
该检测方法比上述涂布检测更具定量性，因此在同一块平板上进行相同实验时，能够揭示聚谷氨酰胺（polyQ）毒性的细微差异。
<ol>
	<li>将过夜培养的含葡萄糖培养基中的菌液稀释至 OD600 为 0.1。</li>
	<li>用移液器将 200 μl 稀释后的菌液加入无菌的 96 孔板中，并使用多通道移液器在无菌水中进行五次五倍连续稀释。</li>
	<li>使用点样器（也称为蛙式接种器，带有用于转移细胞悬浮液的 8 × 6 针阵列），将细胞悬浮液转移至含有选择性培养基且以葡萄糖为唯一碳源的平板，以及含有选择性培养基且以半乳糖为唯一碳源的平板上。</li>
	<li>让平板晾干后，在 30 °C 下培养三至四天。</li>
	<li>培养结束后，拍摄每块平板的照片（图 2b）。</li>
</ol>
3.3. 通过液体培养物的生长监测酵母中 polyQ 的毒性
本方案是此处描述的三种检测方法中定量性最强的（OD600数值），甚至能够检测到聚谷氨酰胺（polyQ）毒性的细微差异。然而，如前所述，自发抑制子的出现可能产生误导性结果。因此，我建议将本检测方法与上述两种平板检测方法中的至少一种联合使用。我们建议使用BioscreenC仪器进行这些实验。BioscreenC是一种可在设定温度和振荡条件下，自动测定100孔板中酵母培养物光密度的仪器。其他培养酵母细胞并测定其光密度的方法也可能适用。
<ol>
	<li>用 3 ml 无菌水将仅以葡萄糖为唯一碳源的最低培养基中的酵母细胞洗涤三次。</li>
	<li>将甘露醇培养基中过夜培养的菌液稀释至 OD600 为 0.1。</li>
	<li>向 100 孔 BioscreenC 板的每个孔中加入 300 μl 酵母培养物。</li>
	<li>打开 Easy Bioscreen Experiment 程序。确定需要监测的样品数量（包括空白和仅培养基对照），设置温度为 30 °C，实验时长为 3 天，测量间隔为 15 分钟，滤光片设置为 600 nm /Brown，振荡模式设置为每次测量前以中等强度振荡 15 秒。</li>
	<li>BioscreenC 仪器及其配套软件将生成实验过程中每个数据点的 Excel 表格。</li>
	<li>使用 Excel 为每个样品绘制生长曲线，并比较不同样品的生长情况（图 2c）。此前已有对 BioscreenC 实验产生数据的详细分析方法描述10。</li>
</ol>
4. 代表性结果
<img alt="亨廷顿蛋白结构示意图，polyQ 区域，FLAG标签，荧光显微镜分析。" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 酵母 polyQ 模型。a) 毒性 polyQ 扩展蛋白的示意图。 b) 荧光显微镜图像显示表达短片段、无毒性的 polyQ 扩展蛋白的酵母细胞（25Q，左图）和表达长片段、有毒性的 polyQ 扩展蛋白的酵母细胞（103Q，右图）。
<img alt="亨廷顿蛋白表达效应；琼脂平板生长（103Q），系列稀释；生长曲线分析。" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 表达多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白的酵母细胞生长实验的代表性结果。a) 铺板实验。 将约 700 个酵母细胞涂布于平板上，并在 30 °C 下培养三天。上图显示含葡萄糖培养基的平板，即毒性多聚谷氨酰胺扩展蛋白（103Q）的表达未被诱导。下图显示含半乳糖培养基的酵母平板，即毒性多聚谷氨酰胺扩展蛋白的表达被诱导。请注意，在本实验中未出现自发性抑制子。b) 点样实验。 将携带非毒性多聚谷氨酰胺蛋白（25Q）或毒性多聚谷氨酰胺扩展蛋白（103Q）的酵母细胞进行连续五倍稀释，共五组，点样于抑制蛋白表达的葡萄糖平板（左图）或诱导蛋白表达的半乳糖平板上。平板随后在 30 °C 下培养三天。c) BioscreenC 实验。 使用 BioscreenC 仪器监测表达非毒性多聚谷氨酰胺蛋白（25Q）或毒性多聚谷氨酰胺扩展蛋白（103Q）的酵母细胞培养物的生长情况。实验条件及 BioscreenC 实验的数据分析详见正文。

<ol><li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li>
<li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+repeats+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li>
<li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li>
<li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+bread+to+brains+and+beyond%3A+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li>
<li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+%28-%29-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本论文概述了三种互补的实验方法，通过检测表达毒性多聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白的酵母细胞生长减缓现象，来测定模式生物酵母中的polyQ毒性。利用酵母开展的研究已为蛋白质错误折叠及其继发毒性的基本细胞与分子机制提供了深刻见解，其中包括polyQ扩展蛋白的错误折叠与毒性机制9,11,12。基于本文所述实验方案的研究已成功帮助鉴定并表征了polyQ毒性的遗传增强因子或抑制因子、调控polyQ毒性的小分子化合物，以及介导polyQ毒性的细胞机制5-8,13,14。
所述方案可轻松调整，用于研究其他影响 polyQ 毒性的因素，例如不同的生长条件或可减轻或加剧 polyQ 毒性的遗传突变。此外，所述实验方案也可简便地调整用于检测其他有毒错误折叠蛋白在酵母中的毒性。

<table><tbody><tr><td>Frogger（6×8 针）</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP 407 AH</td><td></td></tr><tr><td>BioscreenC</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>100 孔蜂窝板</td><td>Growth Curves USA</td><td>9602550</td><td></td></tr></tbody></table>

评估酵母中多聚谷氨酰胺毒性的生长实验

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

蛋白质错误折叠与多种人类疾病相关，尤其是阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病1。亨廷顿病（HD）是由亨廷顿蛋白中多聚谷氨酰胺（polyQ）区域异常扩增所致。这种polyQ扩增的亨廷顿蛋白呈现异常构象（即发生错误折叠），并导致细胞毒性2。至少还有八种神经退行性疾病也由polyQ扩增引起，包括脊髓小脑性共济失调和肯尼迪病3。
模式生物酵母已帮助人们深入理解聚谷氨酰胺（polyQ）毒性的细胞与分子基础，包括聚Q毒性中分子内和分子间因素的影响，以及表达聚Q扩展蛋白的细胞中受损的细胞通路的鉴定3-8。重要的是，许多在酵母中发现的聚Q毒性特征在其他实验系统中乃至亨廷顿病（HD）患者样本中均得到一定程度的重现，从而证明了酵母模型在揭示聚Q毒性基本机制方面的重大意义。
在酵母中直接且相对简单地测定多聚谷氨酰胺（polyQ）毒性的方法是检测表达多聚谷氨酰胺扩展蛋白的酵母细胞的生长缺陷。本文描述了三种互补的实验方法，通过测定表达多聚谷氨酰胺扩展蛋白的酵母细胞的生长情况来评估其在酵母中的毒性。前两种实验方法通过平板监测酵母的生长，第三种方法则使用BioscreenC仪器监测液体培养酵母的生长。 
此外，本文描述了在操作酵母多聚谷氨酰胺（polyQ）模型时可能出现的实验困难，并概述了有助于避免或减少这些困难的策略。本文所述的实验方案可用于鉴定和表征调控polyQ毒性的遗传通路及小分子。此外，所描述的检测方法可作为模板，用于对其他与疾病相关的错误折叠蛋白在酵母模型中引起的毒性进行精确分析。

本文描述了三种互补的实验方案，用于评估聚谷氨酰胺（polyQ）扩展蛋白在酵母Saccharomyces cerevisiae中的毒性。这些方案可轻松修改，以监测其他错误折叠蛋白在酵母中的毒性。

蛋白质错误折叠与许多人类疾病相关，尤其是神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病……

本实验的总体目标是利用酵母作为实验平台，评估和分析与多聚谷氨酰胺扩张蛋白相关的毒性。在抑制多聚谷氨酰胺表达的条件下培养酵母后，获得其扩张蛋白。通过三种互补的酵母细胞生长实验，对表达有毒性多聚谷氨酰胺扩张蛋白的酵母进行检测，以可靠地评估其毒性，其中第一种生长实验已得到验证。此处通过铺板实验监测多聚谷氨酰胺的毒性。作为第二种互补性的生长实验，采用点板实验来检测细胞生长的细微差异。第三种实验展示了最定量的方法，其中酵母细胞在液体培养基中培养，并通过监测600纳米处的光密度来评估毒性，最终可获得可重复且定量的结果。通过仔细观察酵母细胞在平板和液体培养基中的生长情况，该文献记录了多聚谷氨酰胺在酵母细胞中的毒性作用。该方法可解答有关蛋白质错误折叠疾病的关键问题，例如解析与错误折叠蛋白（包括多聚谷氨酰胺蛋白）毒性相关的遗传和细胞基础。系统的分析已确定了在酵母中引发毒性的多聚Q扩展蛋白所需的精确氨基酸序列。这种有毒的多聚Q扩展蛋白包含一个位于氨基末端的Flag标签，其后是亨廷顿蛋白原始序列中的17个氨基酸、一个多聚Q区域，以及一个与荧光蛋白融合的羧基末端。表达本应具有毒性的多聚Q扩展蛋白的酵母细胞可能不会表现出任何生长缺陷，这是由于出现了多聚Q毒性的自发抑制子，这可能会危及旨在表征多聚Q毒性或其调控因子的任何实验的成功结果。为避免这些自发抑制子频繁出现，务必采取预防措施，包括在毒性实验中使用新鲜的酵母细胞。避免长时间储存酵母，并应频繁从冷冻保存的菌种中重新获取新鲜的酵母菌落。通过荧光显微镜定期监测毒性多聚谷氨酰胺（poly Q）扩增蛋白的表达与聚集情况。在进行任何毒性检测之前，始终将酵母细胞培养在抑制毒性蛋白表达的培养基中。作为最后的预防措施，每次实验应使用多个独立的转化子。首先，本方案中展示的生长实验采用含葡萄糖作为唯一碳源的 3 毫升选择性酵母培养基，以获得表达多聚谷氨酰胺（poly Q）扩展蛋白的酵母细胞。从三个独立的转化子分别接种三份培养物，并在 30 摄氏度下过夜培养。在这些条件下，由于葡萄糖的抑制作用，细胞不会表达多聚Q扩展蛋白。为通过平板上的生长情况监测缺陷，需避免过夜培养物过度生长，将600纳米处的光密度控制在1以下。首先，取OD600为0.5的过夜酵母培养物，用含葡萄糖的选择性培养基进行1:1000稀释，然后将每种稀释后的培养物各取50微升，均匀涂布于一块以葡萄糖作为唯一碳源的选择性培养基平板上，使每个稀释样品在平板上形成约700个菌落。同时接种到含有半乳糖的选择性培养基上。以半乳糖作为唯一碳源，在30°C下培养3至4天。培养结束后，拍摄每块平板的照片，并计数葡萄糖和半乳糖平板上的菌落数量。在理想条件下，使用表达高毒性多聚谷氨酰胺（poly Q）扩增蛋白的酵母细胞时，半乳糖平板上应无或仅有极少数菌落。点样实验比平板实验更具定量性，因此能够揭示多聚谷氨酰胺毒

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