Name: 宣传和检测Maedi visna病毒传染性表达绿色荧光蛋白的分子克隆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 了解绵羊脉络丛细胞中梅迪维斯纳病毒GFP感染性分子克隆的构建与检测方法。该方案利用荧光显微镜和流式细胞术监测病毒复制，为病毒宿主相互作用研究提供有效工具。

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本工作由冰岛研究基金和冰岛大学研究基金资助。

1. 转染
该分子克隆包含在两个质粒中，分别为12 kb的p8XSp5-egfp和4.5 kb的p67r。9,10
<ol>
 <li>用XbaI酶切等摩尔量的两种质粒，即4.4 μg的p8XSp5-egfp和1.6 μg的p67r，酶切后进行连接，再转染。</li>
 <li>连接反应中使用1 Weiss单位的连接酶，总体积为50 μl，于16°C过夜孵育。</li>
 <li>连接完成后，将连接产物于65°C孵育15分钟以灭活连接酶。此步骤可省略。</li>
 <li>转染前两天，将106个SCP细胞接种于T25组织培养瓶中，在5 ml DMEM + 10%小羊血清和2 mM谷氨酰胺（不加抗生素）中培养两天，直至细胞融合度达到90%的单层。若两天后细胞融合度未达90%，可继续培养一天。</li>
</ol>
注意：羔羊血清可用胎牛血清（FBS）替代。我们常规使用羔羊血清，因为某些MVV毒株会被FBS抑制；然而，该MVV毒株不受FBS抑制。
<ol start="5">
 <li>当细胞准备进行转染时，更换培养基为含1%血清（小羊血清或FBS）但不含抗生素的DMEM。 
 我们使用Lipofectamin 2000（Invitrogen）进行转染。</li>
 <li>将DNA稀释于500μl Opti-MEM培养基中。</li>
 <li>将20μl Lipofectamin 2000稀释于500μl Opti-MEM培养基中，并在室温（RT）静置5分钟。</li>
 <li>5分钟孵育后，将稀释的DNA与稀释的Lipofectamine 2000混合（总体积 = 1000 μl）。轻轻混匀，并在室温下孵育20–30分钟。</li>
 <li>将转染混合物（1 ml）加入含有SCP细胞和培养基（5 ml）的T25培养瓶中。通过轻轻摇晃混匀。</li>
 <li>在37°C和5% CO2条件下过夜孵育（18–24小时）。</li>
 <li>次日更换培养基为含1%血清、2mM谷氨酰胺、100IU青霉素和100IU链霉素的DMEM。</li>
 <li>通过倒置荧光显微镜监测SCP细胞中GFP的表达。这些原代细胞的转染效率通常较低，约为5–15%。</li>
 <li>继续在37°C、5% CO2条件下孵育数天，以使病毒在培养瓶中扩散。完全感染通常需要7–14天。</li>
 <li>通过将上清液分装至Eppendorf管中收集病毒。在微量离心机中以3000 rpm离心5分钟，去除细胞碎片。将含有病毒的上清液转移至新管中。于-80°C保存。</li>
</ol>
2. 病毒滴定
<ol>
 <li>在96孔板中每孔加入100 μl含10%血清、2 mM谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素的DMEM培养基，接种3×104个SCP细胞。于37°C、5% CO2条件下培养。</li>
 <li>若次日细胞达到汇合状态，则更换培养基为每孔100 μl含1%血清、2 mM谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素的DMEM培养基。</li>
 <li>按以下方式稀释病毒：
 <ol>
 <li>在96孔圆底或V型底板中，向4 × 10个孔每孔加入180 μl含1%血清、2 mM谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素的DMEM培养基。</li>
 <li>进行四重复的10倍系列稀释：向该板第一列的4个孔中各加入20 μl病毒液，使用多通道移液器反复吹打以确保样品充分混匀。更换移液器吸头后，将20 μl液体转移至下一列4个孔，依此类推。最后一列孔不加病毒作为阴性对照。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>向SCP细胞及培养基中每孔加入100 μl病毒稀释液。</li>
 <li>于37°C、5% CO2条件下培养。连续观察两周GFP荧光及细胞病变效应。 
细胞病变效应表现为细胞变圆、透明度降低，与正常细胞相比突起伸展，最终出现多核细胞并导致细胞死亡。</li>
 <li>采用Reed-Muench法11计算病毒滴度（TCID50）。</li>
</ol>
3. 感染细胞的流式细胞术分析
注意：为了快速监测病毒的复制情况，可通过流式细胞术检测感染的细胞。
<ol>
 <li>用胰蛋白酶消化感染的细胞（约 105），用 PBS 洗涤 1 次，重悬于 500 μl PBS 中。</li>
 <li>加入 500 μl 4% 多聚甲醛溶液（终浓度为 2%），室温孵育 30 分钟。</li>
 <li>在微量离心机中以 3000 rpm 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
 <li>用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟，然后在 FACScan 分析仪上进行分析，计数 10,000 个事件。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
该病毒应具有完全感染性，并能复制至滴度达到106 – 107 半数组织培养感染剂量50/ml。感染的细胞具有荧光，可通过流式细胞术和荧光显微镜检测。通常，使用流式细胞术可在感染的细胞培养物中检测到超过60%的细胞表达GFP（图1）。同样，通过荧光显微镜观察时，大多数细胞呈现荧光（图2A和B）。
<img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="流式细胞术散点图；GFP表达分析；实验数据可视化。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. SCP细胞感染KV1772-egfp病毒7天后的FACScan分析结果。
<img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="细胞培养对比；显微镜图像 A) 未染色细胞，B) 荧光染色细胞。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. SCP 细胞感染 KV1772-egfp 后培养 7 天的相差显微镜图像（A）。相同细胞的荧光显微镜观察结果（B）。

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所展示的表达GFP的MVV分子克隆，将有助于在体外和体内分析MVV与宿主细胞的相互作用及其致病性。病毒在复制7-14天后无疑会因逆转录酶的不准确性而积累一些突变。然而，该克隆作为单周期载体的使用存在局限性。其一，该克隆的应用仅限于绵羊和山羊来源的细胞。使用我们的构建体转染这些细胞的效率仅为5-15%，而使用pEGFP-N3载体时转染效率为15-20%，相比之下，293-T细胞的转染效率则超过90%。293-T细胞曾被测试作为MVV载体的包装细胞，但所产生的病毒颗粒在绵羊细胞和293-T细胞中均无感染性12，这可能是由于尚未明确的限制性因子所致。该感染性克隆由两个质粒组成，这是另一项不足之处。这主要是因为全长克隆在大肠杆菌（E. coli）中不稳定。然而，将其全长克隆构建至低拷贝质粒中应是可行的。
质粒和细胞可向作者索取。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10938025</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>51985018</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr></tbody></table>

扩增与检测表达绿色荧光蛋白的传染性绵羊梅迪-维斯纳病毒分子克隆

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

绵羊肺腺瘤病毒（Maedi-visna virus，MVV）是一种感染绵羊的慢病毒，可导致缓慢进展的间质性肺炎和脑炎1。体内条件下，MVV的主要靶细胞被认为是单核细胞系来源的细胞2。然而，某些MVV毒株也能在其他类型的细胞中复制3,4。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是研究活细胞中慢病毒感染的常用标记物。我们已将egfp基因插入MVV的dUTPase基因中。dUTPase基因在大多数绵羊和山羊的慢病毒毒株中高度保守，并已被证明在山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）的复制中具有重要作用5。然而，已有研究表明，在本研究使用的MVV分子克隆中，dUTPase在体外和体内均非复制所必需6。MVV的复制严格局限于绵羊或山羊来源的细胞。我们使用一种源自绵羊脉络丛的原代细胞系（SCP细胞）进行病毒的转染与扩增7。该表达荧光的MVV具有完全感染性，且EGFP的表达在连续传代至少6代后仍保持稳定8。TCID50测定结果与EGFP信号之间具有良好的相关性。因此，该病毒可用于体外和体内研究中快速检测感染细胞，适用于细胞嗜性及致病性相关研究8。

我们描述了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）且具有完全感染性的绵羊肺炎病毒（maedi-visna virus）的分子克隆。该病毒的复制可通过荧光显微镜和流式细胞术进行检测。

绵羊梅迪-维斯纳病毒（Maedi-visna virus, MVV）是一种感染绵羊的慢病毒，可导致缓慢进展的间质性肺炎和脑炎1。MVV在……中的主要靶细胞为……

本实验的总体目标是扩增并检测一种表达绿色荧光蛋白的传染性克隆，该克隆来自 Mildy 病毒与无病毒对照。这种绿色荧光蛋白已被克隆至 Myy Ner 病毒基因组中 D utp Ace 的衣壳蛋白基因内。感染性克隆包含在两个质粒中。首先，用 xpa 一种限制性内切酶切割携带 myy Ner 序列的两个质粒，并进行连接。其次，将构建体转染至绵羊脉络丛细胞中。最后，通过荧光显微镜和流式细胞术检测感染了 myy vino 病毒的细胞。大家好，我是冰岛大学实验病理学研究所 TER 研究所的 Stefano Neron。今天我们将向您展示一种扩增和检测表达绿色荧光蛋白的感染性血管病毒分子克隆的实验方法。分子克隆分别包含于大小为12千碱基和4.5千碱基的质粒P eight XSP five EGFP和P six seven or中。取等摩尔量的两种质粒进行酶切，即4.4微克的P eight XSP five EGFP和1.6微克的P six seven or，用XPA one酶切后连接，再进行转染。连接完成后，将连接产物于65摄氏度孵育15分钟。转染前两天，将10的6次方个SCP细胞接种于T25组织培养瓶中，在5毫升DMEM培养基（含10%胎牛血清和2毫摩尔谷氨酰胺，不含抗生素）中培养两天，使其生长至90%汇合度的单层细胞状态。如果细胞在两天后仍未达到90%汇合度，可让细胞继续培养一天。可使用胎牛血清（FBS）替代羔羊血清。我们常规使用羔羊血清，因为某些MVV毒株会被FBS抑制。然而，该MVV毒株不受FBS抑制。当细胞准备进行转染时，更换培养基为含1%小牛血清或FBS的DMEM培养基，且不含抗生素。我们使用Lipofectamine 2000进行转染，将DNA溶于500 µL Opti-MEM培养基中，同时将20 µL Lipofectamine 2000溶于500 µL Opti-MEM培养基中，室温静置5分钟。孵育5分钟后，将稀释的DNA与稀释的Lipofectamine 2000混合，总体积为1000 µL。轻轻混匀，室温孵育20至30分钟。将转染混合物加入含有SCP细胞和培养基的T25培养瓶中，轻轻摇晃混匀。37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中过夜培养。次日更换培养基为含1%血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100 IU/毫升青霉素和100 IU/毫升链霉素的DMEM。通过倒置荧光显微镜监测GFP和SCP细胞的表达情况。这些原代细胞的转染效率较低，通常为5%至15%。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育数天，以使病毒在培养瓶中扩散。通常需要7至14天才能完成完全感染。通过离心将上清液收集到微量离心管中以收获病毒。在微型离心机中以3000 × g离心5分钟，以去除细胞碎片。将含有病毒的上清液转移至新的离心管中。将三乘以十的四次方个SCP细胞置于含10%血清、2毫摩尔谷氨酰胺、每毫升100 IU青霉素和每毫升100 IU链霉素的100微升DMEM培养基中，于零下80摄氏度保存，每孔一份。在96孔板中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。若次日细胞达到汇合状态，则将培养基更换为含1%血清的DMEM。每孔加入100微升，按下述方法稀释病毒。在96孔圆底或V底板中，每孔加入180微升含1%血清的DMEM培养基，共处理四组，每组10孔，用于进行四次重复的十倍系列稀释。向每块板第一列的四个孔中分别加入20微升病毒液。使用多通道移液器反复吹打混匀，确保样品充分混合。更换移液器吸头，将20微升转移至接下来的四个孔，依此类推。最后的孔不加病毒，作为空白对照。向SEP细胞中加入100微升病毒稀释液，并放入培养箱中孵育。37摄氏度和5%二氧化碳。观察GFP荧光和细胞病变效应持续两周。细胞病变效应包括细胞变圆、透明度降低，与正常细胞相比突起延伸，最终出现多核细胞并导致细胞死亡。使用Reed-Muench法计算病毒滴度，以快速监测病毒的复制情况。可通过流式细胞术和胰蛋白酶消化检测感染的细胞。检测约10的5次方个感染细胞。用 PBS 洗涤一次，然后在 500 微升 PBS 中重悬。加入 500 微升 4% 多聚甲醛溶液，终浓度为 2%，室温孵育 30 分钟。在 3000 ×g 或 PMM 下离心 5 分钟以沉淀细胞。用PBS洗涤两次，每次五分钟，然后在流式细胞分析仪上进行分析。计数10,000个事件。本文所述的表达GFP的病毒分子克隆可用于在体内和体外研究我的神经病毒与宿主的相互作用及其致病性。尽管尚未证明我的神经病毒能够感染人类细胞，但进行实验时仍需严格遵守生物安全等级的全部预防措施。细胞和质粒均可从我们实验室获取。祝您的实验顺利。

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