扩增与检测表达绿色荧光蛋白的传染性绵羊梅迪-维斯纳病毒分子克隆

本实验的总体目标是扩增并检测一种表达绿色荧光蛋白的传染性克隆，该克隆来自 Mildy 病毒与无病毒对照。这种绿色荧光蛋白已被克隆至 Myy Ner 病毒基因组中 D utp Ace 的衣壳蛋白基因内。

感染性克隆包含在两个质粒中。首先，用 xpa 一种限制性内切酶切割携带 myy Ner 序列的两个质粒，并进行连接。其次，将构建体转染至绵羊脉络丛细胞中。

最后，通过荧光显微镜和流式细胞术检测感染了 myy vino 病毒的细胞。大家好，我是冰岛大学实验病理学研究所 TER 研究所的 Stefano Neron。今天我们将向您展示一种扩增和检测表达绿色荧光蛋白的感染性血管病毒分子克隆的实验方法。

分子克隆分别包含于大小为12千碱基和4.5千碱基的质粒P eight XSP five EGFP和P six seven or中。取等摩尔量的两种质粒进行酶切，即4.4微克的P eight XSP five EGFP和1.6微克的P six seven or，用XPA one酶切后连接，再进行转染。连接完成后，将连接产物于65摄氏度孵育15分钟。转染前两天，将10的6次方个SCP细胞接种于T25组织培养瓶中，在5毫升DMEM培养基（含10%胎牛血清和2毫摩尔谷氨酰胺，不含抗生素）中培养两天，使其生长至90%汇合度的单层细胞状态。

如果细胞在两天后仍未达到90%汇合度，可让细胞继续培养一天。可使用胎牛血清（FBS）替代羔羊血清。我们常规使用羔羊血清，因为某些MVV毒株会被FBS抑制。

然而，该MVV毒株不受FBS抑制。当细胞准备进行转染时，更换培养基为含1%小牛血清或FBS的DMEM培养基，且不含抗生素。我们使用Lipofectamine 2000进行转染，将DNA溶于500 µL Opti-MEM培养基中，同时将20 µL Lipofectamine 2000溶于500 µL Opti-MEM培养基中，室温静置5分钟。

孵育5分钟后，将稀释的DNA与稀释的Lipofectamine 2000混合，总体积为1000 µL。轻轻混匀，室温孵育20至30分钟。将转染混合物加入含有SCP细胞和培养基的T25培养瓶中，轻轻摇晃混匀。

37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中过夜培养。次日更换培养基为含1%血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100 IU/毫升青霉素和100 IU/毫升链霉素的DMEM。通过倒置荧光显微镜监测GFP和SCP细胞的表达情况。

这些原代细胞的转染效率较低，通常为5%至15%。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育数天，以使病毒在培养瓶中扩散。通常需要7至14天才能完成完全感染。通过离心将上清液收集到微量离心管中以收获病毒。

在微型离心机中以3000 × g离心5分钟，以去除细胞碎片。将含有病毒的上清液转移至新的离心管中。

将三乘以十的四次方个SCP细胞置于含10%血清、2毫摩尔谷氨酰胺、每毫升100 IU青霉素和每毫升100 IU链霉素的100微升DMEM培养基中，于零下80摄氏度保存，每孔一份。

在96孔板中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。若次日细胞达到汇合状态，则将培养基更换为含1%血清的DMEM。每孔加入100微升，按下述方法稀释病毒。

在96孔圆底或V底板中，每孔加入180微升含1%血清的DMEM培养基，共处理四组，每组10孔，用于进行四次重复的十倍系列稀释。向每块板第一列的四个孔中分别加入20微升病毒液。使用多通道移液器反复吹打混匀，确保样品充分混合。

更换移液器吸头，将20微升转移至接下来的四个孔，依此类推。最后的孔不加病毒，作为空白对照。向SEP细胞中加入100微升病毒稀释液，并放入培养箱中孵育。

37摄氏度和5%二氧化碳。观察GFP荧光和细胞病变效应持续两周。细胞病变效应包括细胞变圆、透明度降低，与正常细胞相比突起延伸，最终出现多核细胞并导致细胞死亡。

使用Reed-Muench法计算病毒滴度，以快速监测病毒的复制情况。可通过流式细胞术和胰蛋白酶消化检测感染的细胞。检测约10的5次方个感染细胞。

用 PBS 洗涤一次，然后在 500 微升 PBS 中重悬。加入 500 微升 4% 多聚甲醛溶液，终浓度为 2%，室温孵育 30 分钟。在 3000 ×g 或 PMM 下离心 5 分钟以沉淀细胞。

用PBS洗涤两次，每次五分钟，然后在流式细胞分析仪上进行分析。计数10,000个事件。本文所述的表达GFP的病毒分子克隆可用于在体内和体外研究我的神经病毒与宿主的相互作用及其致病性。

尽管尚未证明我的神经病毒能够感染人类细胞，但进行实验时仍需严格遵守生物安全等级的全部预防措施。细胞和质粒均可从我们实验室获取。祝您的实验顺利。