Name: 编制完整的牛尾巴器官培养的椎间盘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 学习从牛尾中分离完整椎间盘用于器官培养的技术，包括消毒、肌肉切除、定制工具切割及喷射冲洗清洁骨表面等关键步骤。该方法可保持细胞活性，适用于生物反应器中的机械加载研究及椎间盘退变与再生机制探索。

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本项目由瑞士国家科学基金会（SNF # 310030-127586/1）资助。

1. 椎间盘的采集
<ol>
	<li>从当地屠宰场获取整条牛尾，若可能应选择无皮肤的牛尾，因为皮肤的存在会增加污染的风险（图2）。</li>
	<li>准备一个大型砧板，并在砧板上设置无菌操作台及无菌器械（图2）。</li>
	<li>在无菌超净工作台内，将用含55 mM柠檬酸钠的0.9%氯化钠溶液浸湿的无菌纱布准备好，并放入6孔板的每个孔中。</li>
	<li>准备一个盆，用自来水将1:100稀释的聚维酮碘溶液（Betadine）配制好。</li>
	<li>将整条牛尾浸入含有1%聚维酮碘溶液的盆中，持续5分钟。</li>
	<li>用无菌纱布快速擦干牛尾，并将其放置在无菌操作台上。</li>
	<li>使用#22号手术刀片小心地去除尾部周围的肌肉组织。</li>
	<li>切除不需要的尾部部分，通常为尾部两端，因其包含相对较大或过小的椎间盘（IVD）（图3）。</li>
	<li>使用#10号手术刀片进一步修整椎间盘周围的肌肉和肌腱，注意不要切到椎间盘的外层纤维环。</li>
	<li>用外科皮肤标记笔标记椎间盘的腹侧（此步骤为可选，有助于在我们的生物反应器中确定轴向旋转的中心）。</li>
	<li>轻轻活动尾部以定位椎间盘与椎骨的连接点，用手术刀片的钝边触感判断椎间盘与骨组织之间的边界。分离切口应位于距椎间盘向椎骨方向1–2 mm处。将定制的工业刀片夹具置于分离位置（图4）。</li>
	<li>通过敲击定制的工业刀片夹具顶部，分离椎间盘与椎骨（图3）。</li>
	<li>在椎间盘-椎骨连接的另一侧重复上述操作。</li>
	<li>用含55 mM柠檬酸钠的0.9%氯化钠溶液浸湿的无菌纱布包裹分离得到的椎间盘。</li>
	<li>继续分离椎间盘，直至获得所需数量的样本（通常可收获约6个，直径在10–20 mm之间）。</li>
	<li>将喷射灌洗系统（Zimmer, inc.）连接至无菌乳酸林格氏液，5 L袋装液体较为适用（也可使用无菌PBS或0.9%生理盐水溶液）。</li>
	<li>用镊子夹持椎间盘，使用Zimmer Pulsavac喷射灌洗系统对终板表面两侧进行喷射灌洗（图1C）。喷枪应以30–60°角对准终板表面，每侧冲洗约30秒（图1和图7）。</li>
	<li>将椎间盘放回6孔板中，并用湿润纱布包裹，同时对下一个椎间盘样本进行喷射清洗。</li>
	<li>椎间盘现已准备好用于器官培养及后续应用（如细胞活力检测、力学加载、器官培养等）（图1D）。</li>
</ol>
2. 代表性结果
用于评估椎间盘制备是否成功的检测指标可采用扩散实验，即用PBS配制小分子量荧光染料（如荧光红）的1%溶液2。将椎间盘置于至少100 mL染料溶液中，在自由溶胀条件下使染料被动扩散进入椎间盘，持续24小时。随后将椎间盘在液氮中速冻，再恢复至室温，并通过一系列丙酮转移步骤进行脱水处理（依次使用-80 °C预冷、-20 °C、4 °C，最后至室温的丙酮）。之后可将椎间盘包埋于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）中，用锋利刀片切割成100 μm厚的切片。这些切片可用任何标准明场显微镜观察，但优先推荐使用荧光显微镜，因为荧光红可发出红色荧光（图5-6）。经喷射灌洗步骤后，骨表面的小梁结构显得非常洁净（图7）。
成功的器官培养参数首先包括无污染、细胞活力保持（图8-9）、椎间盘高度以及整体“椎间盘完整性”，这些可通过组织学切片和沙黄O/快绿染色或Meyer苏木精3进行评估。我们已开发并发表了相关方案和宏程序4,5，用于对活体椎间盘组织进行染色，并利用共聚焦激光扫描显微镜及活/死细胞染色试剂盒（Molecular Probes, Invitrogen, 巴塞尔, 瑞士）在三维水平上扫描细胞活力。此外，我们进一步开发了一种宏程序和常规方法，基于NIH ImageJ平台4-6，实现对三维组织或三维载体中的细胞进行自动计数，以评估细胞活力。另有替代性方案被提出，即通过蛋白酶和II型胶原酶对细胞外基质进行连续消化，获得细胞悬液后进行染色，从而测定椎间盘细胞的活力7。早期版本的方案中，在椎间盘收获后、器官培养前，需在含有十倍浓度青霉素/链霉素的PBS中孵育10分钟。但随着喷射灌洗步骤的引入，该步骤已不再必要，因为喷射灌洗本身在培养过程中已显示出有利效果。
<img alt="脊柱结构示意图、营养流动、椎间盘裂纹、器官培养装置、研究方法。" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 制备具有完整终板及一层薄骨（1–2 mm）的牛尾椎椎间盘（IVD）的方法学步骤概述。A) 椎间盘（IVD）及其营养通路的示意图。B) 使用定制刀片夹具和工业锋利刀片切割出椎间盘的操作流程。C) 喷射灌洗步骤，以确保高细胞活力，并维持终板及两侧各1–2 mm骨组织的附着，从而支持营养交换。D) 最终，该椎间盘可置于生物反应器的样本腔中进行培养，或用于其他后续应用。
<img alt="骨生长分析；尾椎的解剖图像和X射线，突出显示生长板。" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 上图：完整长度的新鲜牛尾（理想情况下应在死亡后2-3小时内获取，以确保细胞高存活率）。下图：约6月龄牛尾的X射线图像，显示骨性终板（EP）与椎体（VB）之间存在生长板（GP）及次级骨化中心。
<img alt="骨骼固定过程；设置中的设备（A），骨骼上的夹具（B），力学测试装置（C）" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. A) 在无菌条件下解剖牛尾所用的工具。B) 定制的刀片夹持器正在切割牛尾椎间盘以获取运动节段。C) 定制刀片夹持器的侧视图，配有标准工业刀片（Lutz，德国）。
<img alt="椎体结构示意图及样本，显示椎体、椎间盘、生长板和劈裂位点。" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4. 去除周围肌肉和韧带后的牛尾示意图及实物图，展示用于切取运动节段的劈裂位点。应使用自制刀片夹具将部分椎体“劈开”，理想位置为距离软骨终板约1-2 mm处，以确保获得完整的骨表面。
<img alt="骨骼组织样本对比；测量、分析；使用尺子刻度进行实验。" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 喷淋冲洗步骤前（A）与步骤后（B）清洁效果的对比展示。注意喷淋处理后椎间盘节段骨表面的清洁程度。
<img alt="显示骨生长的组织学分析示意图，包括初级和次级骨化中心。" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6. 新鲜制备的牛尾椎间盘（IVDs）在1%派洛宁红溶液中自由溶胀扩散24小时的实验，显示生长板的阻断作用。一张数字X射线矢状位图像显示仍含有生长板的椎间盘，以及另一张经矢状面切割的牛尾椎间盘组织块在自由扩散24小时后的荧光显微镜图像，可见软骨性和骨性终板结构。GP：生长板，2ndry CO：次级骨化中心。
<img alt="组织学分析，椎间盘。显微图像显示髓核和纤维环的细节。" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7. 新鲜制备的牛尾椎间盘（IVD）在1%派洛宁红溶液中自由溶胀24小时的实验，用于展示喷射灌洗处理的清洁效果。对切除的牛椎间盘组织进行矢状厚切片（约100 mm），骨性终板厚度约为1.5 mm，左侧为接受喷射灌洗处理的样本，右侧为未经处理的对照侧。插图显示所用喷雾模式，来自Zimmer创面清创系统，用于牛椎间盘离体组织在1%派洛宁红溶液中进行24小时自由扩散实验。
<img alt="细胞活力检测结果、荧光显微镜图像、时间推移比较，第0至14天。" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8. 采用喷射灌洗法处理的牛椎间盘组织片段在自由肿胀条件下培养0天和14天后，分别获取的共聚焦成像堆栈（约250μm）的活/死细胞投影图像，包括髓核（NP）、内层纤维环（IA）和外层纤维环（OA）。绿色细胞 = 被钙黄绿素AM（乙酰甲酯）染色的活细胞，红色细胞 = 被碘化丙啶同源二聚体-1染色的死细胞核。
<img alt="细胞活力图，随时间变化的椎间盘；髓核与纤维环比较；活力百分比。" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 9"> 
图9. 采用共聚焦激光扫描显微镜对活体组织进行三维层扫成像，评估椎间盘细胞活力。在自由膨胀条件下培养21天期间，髓核（NP）与纤维环（AF）的细胞活力变化。（均值 ± 标准误，N=6）。组间统计学差异通过非参数Kruskal-Wallis符号秩和检验进行分析。在髓核中，第21天与其他所有时间点之间存在显著差异；而在纤维环中，第7天与第0天之间存在显著差异。（* p &lt; 0.05，** p &lt; 0.01）。

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
<li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells%3A+a+feasibility+study+using+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li>
<li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+protocols+for+live%2Fdead+staining+in+three-dimensional+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc%2Fendplate+culture+model%3A+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li>
<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
<li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li>
<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

我们无可披露内容。

成功进行器官培养的第一步是确保外植体不被污染。在开始操作前，应先将尾部去皮。任何带入无菌实验室的动物毛发都可能带来污染风险。牛尾应尽可能新鲜（这会影响初始细胞的活力）。此外，建议使用碘伏清洗步骤，以进一步降低污染风险。分离椎间盘与椎体时，可不使用自制刀片夹具和锤子，而改用组织学带锯（切割时应使用PBS或林格氏液冷却金刚石锯片）。注意，带锯、样品夹持器和切割刀片均须保持无菌。此处演示的技术不仅限于牛尾椎间盘的分离，还可推广至其他动物物种，如猪、羊和兔的尾部甚至腰椎椎间盘的分离。在脊突存在的区域进行椎间盘采集时，必须首先完全去除所有突起结构。
图9中给出的细胞活力数据是在自由膨胀条件下培养长达21天后收集的，可作为参考。该方法在自由膨胀条件下可维持细胞活力达14天。21天时细胞活力下降可能是由于缺乏机械负荷，而机械负荷已被证明对促进营养物质通过终板扩散以及维持椎间盘细胞活力具有重要作用3。在静水压压缩和/或额外的昼夜负荷条件下，细胞活力很可能会更高8-10。
作为一种替代方案，可通过使用...

<table><tbody><tr><td>来自当地屠宰场的新鲜牛尾椎间盘组织（理想情况下在动物死亡后数小时内获取，且不含皮肤）。 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulsavac Plus AC 系统</td><td>Zimmer 公司，瑞士</td><td>00-5150-486-01</td><td>使用髋部喷头并连接交流电源（配备8节AA电池盒的型号）时性能最佳&amp;#8211;但效果较差且不够方便</td></tr><tr><td>高容量风扇喷雾头配防溅罩，12.7 cm 长度 </td><td>Zimmer inc.，瑞士</td><td>00-5150-175-00</td><td>有多种喷头可供选择，我们已成功测试了这一款</td></tr><tr><td>22号和10号手术刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>#10: 0201 #22: 0208</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片持柄 #3 和 #4</td><td>德国豪斯曼</td><td>#3: 06.103.00 #4: 06.104.00</td><td></td></tr><tr><td>Lutz 工业刀片</td><td>吕茨，德国</td><td>1022.0884</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液&amp;rsquo;不含葡萄糖的溶液</td><td>比赫塞尔，瑞士</td><td>133 0002</td><td></td></tr><tr><td>6孔多孔板</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Mundipharma，瑞士</td><td>10055025</td><td></td></tr><tr><td>外科皮肤标记笔</td><td>Porex Surgical，瑞士</td><td>9560</td><td></td></tr><tr><td>大型切菜板</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可</td></tr></tbody></table>

完整牛尾椎间盘的器官培养制备

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

椎间盘（IVD）是脊柱中连接椎体与椎体的关节，其功能是传递脊柱载荷并为脊柱提供灵活性。椎间盘由三个部分组成：最内层的髓核（NP），被纤维环（AF）所包裹，以及两侧连接髓核和纤维环与椎体的软骨终板。由退行性椎间盘疾病（DDD）和椎间盘突出可能引起的盘源性疼痛，已被确认为现代社会中的一个主要问题。为了研究椎间盘退变的可能机制，含有活椎间盘细胞的体外器官培养系统具有很高的吸引力。完整牛尾部尾椎椎间盘的体外培养已发展为一种相关模型系统，可在良好控制的生理和力学环境中研究其力学-生物学特性。牛尾椎间盘相对容易大量获取，并且在细胞密度、细胞群体和尺寸方面与人类腰椎椎间盘非常相似。然而，以往保留软骨终板和骨性终板的牛尾部椎间盘获取技术在培养1-2天后即失败，原因是凝固的血液明显阻塞了营养通路。椎间盘是人体最大的无血管器官，因此髓核细胞的营养完全依赖于来自相邻椎体毛细血管芽的扩散。终板表面存在的骨碎片和凝血块可能阻碍营养物质向椎间盘中心的扩散，从而影响细胞活力。我们团队建立了一种相对快速的“破取”技术，可从尾部取出椎间盘，且污染风险较低。我们能够利用外科喷射灌洗系统对新鲜切割的骨性终板表面进行通透处理，有效清除血凝块和切割残留物，从而高效地重新开放营养物质向椎间盘中心扩散的通路。在培养前必须避免并去除椎体两侧的生长板。在本视频中，我们概述了制备过程中的关键步骤，并展示了在自由肿胀培养条件下维持14天高细胞活力的成功器官培养的关键技术。若能通过机械加载生物反应器维持适当的力学环境，培养时间还可进一步延长。本研究所展示的技术也可推广至其他动物物种，如猪、羊和兔的尾部及腰椎椎间盘分离。

本方案介绍了一种用于器官培养的牛尾部椎间盘采集技术 体外 器官培养

椎间盘（IVD）是连接脊椎骨的脊柱关节，其功能是传递脊柱的负荷，并提供……

本实验的总体目标是从牛尾中完整分离椎间盘，用于培养及其他后续应用。在本案例中，目的是利用复杂的力学载荷，在生物反应器中对椎间盘进行培养。首先对小牛尾部进行消毒，随后去除肌肉组织，以清晰暴露骨性结构和椎间盘结构。接着，使用定制切割工具切取单个椎间盘，保留其两侧各2至3毫米的部分椎体。第三步是使用喷射灌洗系统清洁椎间盘的骨表面，以确保葡萄糖等小分子溶质能够扩散至椎间盘中心。最后一步是将椎间盘置于稳定缓冲液中，或用无菌纱布包裹，以保持其湿润，用于后续实验操作。最终，通过活/死染色法检测细胞活性，以评估操作成功与否，该检测在椎间盘培养开始后14天或21天进行。以下方案旨在展示如何保存可逆性椎间盘片段以进行器官培养，这有助于回答力学生物学和组织工程领域的关键问题。牛尾椎间盘之所以成为组织工程中的一种模型系统，其原因显而易见。首先，其细胞密度与人类椎间盘极为相似，且同样非常低。其次，该部位的细胞群体中不存在脊索细胞，这一点与人类情况非常相似。第三，其尺寸和生化组成也与人类情况极为相近。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为难以区分骨性终板与椎体骨，因此很难确认软骨生长板的存在。我们最初产生这一方法的想法，是在寻找一种快速且无菌的技术以分离带有终板的可翻转椎间盘用于单独培养时。这些方法的可视化演示非常重要，因为切割位置距离骨性终板仅约一毫米，难以准确定位。首先，从当地屠宰场获取完整的牛尾。理想情况下，尾部组织应在死亡后不超过四小时内获取，并去除皮肤。由于皮肤的存在会增加污染的可能性，因此需确保解剖过程中使用的所有器械均处于无菌状态。同时，通过在工作台面上放置经高压灭菌的砧板，创建一个无菌的工作区域。然后在无菌超净工作台中，用含有55毫摩尔柠檬酸钠的0.9%无菌氯化钠溶液浸湿一块无菌纱布。将浸湿的纱布分别放入六孔板的每个孔中。接下来，用自来水将1至100倍稀释的聚维酮碘溶液倒入洁净的容器中，并将尾部浸入该溶液中5分钟。浸泡后，去除尾部。用无菌纱布短暂擦干，并将其置于无菌工作台。首先使用20号或22号手术刀去除尾部周围的肌肉组织。然后使用断头器切除尾部不需要的部分，通常为近端和远端部分，这些区域含有相对较大和非常小的椎间盘。然后使用10号手术刀修剪椎间盘周围的肌肉和肌腱。必要时注意不要切除外层的纤维环。为便于定位，可使用外科皮肤标记笔标记椎间盘的前侧。接下来，轻轻移动尾部以定位椎间盘与椎骨的连接点。使用手术刀片的钝边沿椎间盘与骨骼之间的边界进行分离。然后确定切割位置，该位置应位于椎间盘向椎骨方向1至2毫米处。将自制的工业刀片夹具放置在切割位置。此示意图非常清楚地显示了切割位置，通过在自制的工业刀片夹具顶部敲击，来切割椎间盘及椎骨。然后将刀片夹具移至椎间盘与椎骨连接的另一侧，并从此侧敲击穿过椎间盘与椎骨的连接处，以释放椎间盘。然后用含有55毫摩尔柠檬酸钠的0.9%氯化钠溶液浸湿的无菌纱布迅速分离椎间盘。重复该过程以获得所需数量的椎间盘。通常从一条尾部可获得约六个直径为10至20毫米的椎间盘。在收获所有可翻转的椎间盘后，将喷射灌洗系统连接至一个三升装的无菌乳酸林格氏液、无菌 PBS 或 0.9% 无菌生理盐水袋。然后用镊子夹持一个可翻转椎间盘，以喷射灌洗装置对终板表面的两侧各冲洗 30 秒，喷射角度应与终板表面呈 30 至 60 度。此图像展示了喷射灌洗的清洁效果，上排椎间盘为清洁前的可翻转椎间盘，下排为同一椎间盘清洁后的状态。完成第一个椎间盘的清洗后，在清洗其他可翻转椎间盘时，应将其包裹在湿润的纱布中。清洗完毕后，可翻转椎间盘即可用于器官培养。此外，在层流罩中操作时，可进行扩散实验以评估可翻转椎间盘制备是否成功。每张椎间盘准备含有5%胎牛血清的40毫升无菌DMEM培养基。将培养基转移至烧杯中，然后将单个椎间盘浸入培养基内。将烧杯置于组织培养孵育箱中的摇床上，孵育条件设置为37摄氏度和5%二氧化碳。椎间盘可采用此方法培养约14天。使用这些定制的样本培养室可维持适当的机械负荷，从而实现较长时间的培养。首先，按之前方法准备每份椎间盘对应40毫升含5%胎牛血清的无菌DMEM培养基。接下来，将可翻转培养皿放入一个定制的培养室中，并加入40毫升 freshly prepared 培养基。在通风橱下关闭培养室。将定制的样品室置于组织培养孵育箱中。根据圆盘的表面积向腔室中添加相应重量。首先，每枚椎间盘配制 100 毫升 PBS 中含 1% 荧光染料（如红紫素）的溶液。然后将圆盘浸入该溶液中，并在相同条件下孵育过夜。对于孵育后的自由膨胀培养，先将椎间盘在液氮中速冻，然后浸入-80 °C的丙酮中。接着，通过在-20 °C、4 °C以及最后在室温的丙酮中各孵育24小时，将椎间盘缓慢恢复至室温。当椎间盘恢复至室温后，按照标准操作程序，将其完全包埋于聚甲基丙烯酸甲酯中，包埋时间为一至两周。完全包埋后，使用锋利刀片切割并用研磨机抛光处理样品盘。处理完成后，可通过显微镜评估丙酮氰醇红在整个样品盘中的扩散情况。这些图像显示了一项自由溶胀扩散实验的结果。图C显示了采用本方法制备的可翻转椎间盘的X射线整体观，其中两个骨性终板均已处理。在上方，生长板未被去除，并在荧光显微镜下成像。可以看出，红色荧光染料的扩散受到标记为gp的生长板的阻碍，因此生长板充当了阻止染色更深软骨终板层及可翻转椎间盘的屏障。生长板位于标记为 co 的初级和次级骨化中心之间。如果生长板被成功去除，红色荧光染料便可无阻碍地扩散至标记为 np 的髓核。这些图像展示了喷射灌洗处理的清洁效果。矢状切片的厚度约为100微米，骨性终板的厚度约为1.5毫米。此处，椎间盘接受了喷射灌注处理，可见染料在整个终板中扩散。然而，在未进行喷射灌注处理的对照侧，染料的扩散效果较差。在此我们看到采用喷射灌洗法处理并置于自由膨胀条件下培养的牛椎间盘可逆节段的活/死细胞共聚焦显微镜图像，其中标注 np 的为核区（nucleus pole processis），标注 IA 的为内层纤维环（inner annulus fibrosis），标注 oa 的为外层纤维环（Thea annulus fibrosis）。绿色区域为经乙酰甲酯钙染色的活细胞，红色区域为经 aum 染色的死细胞细胞核。此处的同源二聚体一显示，相同区域的图像表明，在自由膨胀条件下培养 14 天后，仍有大量由绿色荧光指示的存活细胞存在。该图显示了在21天的培养期间，椎间盘的髓核和纤维环区域细胞活力的变化，结果为六个样本的平均值±平均值的标准误差。如图所示，组间统计学差异采用非参数的Rosco Wallace符号秩和检验进行分析。在髓核中，第21天与所有其他时间点之间存在显著差异，而在纤维环中，第7天与第0天之间存在显著差异。通过该方法，可对培养条件进行调整，以进一步探究机械负荷、营养或生长因子对退变或再生过程的影响。本方案加快了椎间盘组织的获取技术，可获得适用于组织工程、生理学或机械生物学研究的可解释性椎间盘节段。传统方法通常使用组织学切片、带锯或轴承技术，耗时比本方案长约两个小时。

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科研

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生物工程

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完整牛尾椎间盘的器官培养制备

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