Name: 血管钙的可视化 2 +信号旁分泌源性活性氧引发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 了解利用氧化敏感染料和荧光传感器在巨噬细胞与内皮细胞共培养模型中可视化活性氧诱导的血管钙信号的方法。该技术有助于研究细胞间旁分泌信号机制。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院基金（R01 HL086699、HL086699-01A2S1、1S10RR027327-01）对 MM 的资助。本文部分得到了 Carl Zeiss Microimaging LLC 的支持。

可以使用氧化敏感性染料（1 和 2）或质粒传感器（3 和 4），通过共聚焦显微镜在活细胞中检测活性氧物种。
1. J774 细胞中胞质活性氧的可视化
<ol>
	<li>将 J774.1 小鼠单核细胞来源的巨噬细胞（106 个细胞/ml）接种于玻璃底 35 mm 培养皿（Harvard Apparatus）中，培养 48 小时。</li>
	<li>用 TLR 激动剂处理细胞（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2 激动剂；10 μg/ml，聚肌胞苷酸-Poly (I:C)-TLR3 激动剂；1 μg/ml LPS-TLR4 激动剂），在 37°C 下孵育 6 小时。 
	注意：在相似条件下处理的巨噬细胞用于共培养模型中的 Ca2+ 动员实验。</li>
	<li>向细胞中加入氧化敏感性染料 H2DCF-DA（Invitrogen），使其在 ECM（细胞外培养基：121 mM NaCl、5 mM NaHCO3、10 mM Na-HEPES、4.7 mM KCl、1.2 mM KH2PO4、1.2 mM MgSO4、2 mM CaCl2、10 mM 葡萄糖和 2.0% 葡聚糖，pH 7.4；所有试剂均购自 Sigma）中终浓度为 10 μM，并添加 2% BSA，加入培养皿后孵育 20 分钟，随后在共聚焦显微镜下观察。</li>
	<li>染料负载后，将细胞置于配备温控载物台的合适成像系统上进行观察。我们使用 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦成像系统，结合氩离子激光器，以 488 nm 激发波长，通过 40 倍油镜观察 DCF 荧光信号13（图 1A 和 D）。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析图像，该软件由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）免费提供（Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997-2009）。</li>
</ol>
2. J774 细胞中线粒体活性氧的可视化
<ol>
	<li>将 J774.1 小鼠单核细胞来源的巨噬细胞（106 个细胞/ml）接种于玻璃底 35 mm 培养皿（Harvard Apparatus）中，培养 48 小时。</li>
	<li>用 TLR 配体刺激细胞以诱导线粒体活性氧（mROS）的产生（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml，聚肌胞苷酸-Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml LPS-TLR4），在 37°C 下孵育 6 小时。</li>
	<li>向培养皿中加入线粒体超氧化物指示剂 MitoSOX Red（Invitrogen），使其在含 2% BSA 的 ECM 中终浓度为 5 μM，于 37°C 孵育 30 分钟，使细胞充分负载 MitoSOX Red。</li>
	<li>染料负载后，将细胞置于配有氩离子激光器的 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦成像系统的温控载物台上，使用 40 倍油镜，在 561 nm 激发波长下观察 MitoSOX Red 荧光信号（见图 1B 和 E）。</li>
	<li>对照实验中，在染料负载后，成像前向细胞中加入 PBS 或 DMSO（阴性对照），或加入 2 μM 抗霉素 A（Antimycin A，作为线粒体超氧化物生成的阳性对照），成像步骤同 2.4（见图 1C）。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析图像。</li>
</ol>
3. 稳定表达 HyPer-cyto 的 MPMVEC 中胞质活性氧的可视化
<ol>
	<li>我们使用 pHyPer-cyto（Evrogen）质粒，这是一种哺乳动物表达载体，编码一种定位于细胞质的荧光传感器 HyPer，可特异性检测亚微摩尔浓度的 H2O214。</li>
	<li>使用电穿孔或转染试剂将 pHyPer-cyto 载体转染至小鼠肺微血管内皮细胞（MPMVECs）中。我们采用 10 × 106 个细胞，通过 BioRad Gene Pulser 电穿孔系统（250 V；500 μF）使用 10 μg pHyPer-cyto 进行电穿孔转染。将 MPMVECs 培养于添加了 10% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、内皮细胞生长补充剂和抗生素的 DMEM 培养基中。 
	注意：转染后，将细胞以低密度接种，以促进克隆形成。</li>
	<li>转染 48 小时后，更换为含 500 μg/ml G418 的完全培养基。筛选 HyPer 阳性细胞比例最高的克隆，并传代扩增 HyPer 阳性克隆以增加 HyPer 阳性细胞数量（图 2）。 
	注意：我们采用细胞连续稀释法进行单细胞克隆筛选，并筛选稳定高表达 HyPer 的细胞系。</li>
	<li>将稳定表达 pHyPer-cyto 的 MPMVECs 培养于 0.2% 明胶包被的盖玻片上（80% 汇合度）。次日，在 37°C 条件下用 TLR 配体刺激细胞 6 小时（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml，Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml LPS-TLR4）。未处理细胞作为对照。</li>
	<li>处理结束后，将盖玻片安装至 Attofluor 细胞培养腔室（Invitrogen）中。向腔室内加入 1 ml 预热的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS），并将腔室置于 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦成像系统的温控载物台上。使用 40 倍油镜在 488 nm 激发波长下观察并采集荧光变化图像（图 3A 和 D）。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析图像（见第 6 节）。</li>
</ol>
4. 稳定表达 HyPer-dMito 的 MPMVEC 中线粒体 ROS 的可视化
<ol>
	<li>我们使用 pHyPer-dMito（Evrogen）质粒，这是一种哺乳动物表达载体，编码靶向线粒体的 HyPer 蛋白，可定位于线粒体并特异性感应亚微摩尔浓度的 H2O2。</li>
	<li>用 pHyPer-dMito 转染 MPMVEC，并按照第 3.2–3.3 节所述步骤建立稳定的 HyPer-dMito MPMVEC 细胞系。</li>
	<li>将稳定的 HyPer-dMito MPMVEC 细胞接种于经 0.2% 明胶包被的盖玻片上，培养至约 80% 汇合度。</li>
	<li>次日，用 TLR 配体处理细胞（2 μg/ml 脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml 聚肌胞苷酸-Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml LPS-TLR4），在 37°C 孵育 6 小时。未处理细胞作为阴性对照。在成像前加入 2 μM 抗霉素 A（线粒体超氧化物诱导剂，阳性对照）。</li>
	<li>处理结束后，将盖玻片安装至 Attofluor 细胞培养皿（Invitrogen）中，向皿内加入 1 ml 预热的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS），并将培养皿置于 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦显微成像系统的温控载物台上。使用 40 倍油镜，在 488 nm 激发波长下观察并记录荧光变化（图 3B、C 和 E）。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析图像（见第 6 节）。</li>
</ol>
5. 用于可视化内皮细胞中旁分泌来源的活性氧触发的Ca2+信号传导的共培养模型
为了观察和测量[Ca2+]i的变化，我们使用Ca2+敏感的荧光染料fluo-4 AM（Invitrogen）。
<ol>
	<li>将 MPMVECs 培养于经 0.2% 明胶包被的 25 mm 玻璃盖玻片上（80% 汇合度）。</li>
	<li>将生长在盖玻片上的细胞在室温下孵育 30 分钟，孵育液为含 2% BSA 和 0.003% 普流罗尼克酸（pluronic acid）的 ECM，其中加入 fluo-4 AM（Invitrogen），终浓度为 5 μM，以完成 fluo-4 AM 的负载。负载完成后，用含有磺吡酮（sulfinpyrazone）的实验成像溶液（含 0.25% BSA 的 ECM）洗涤细胞，以减少染料流失。</li>
	<li>负载 fluo-4 后，将盖玻片安装至 Attofluor 细胞培养皿（Invitrogen）。向培养皿中加入 800 μl 预热的实验成像溶液，并将其置于 Carl Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦成像系统的温控载物台上。</li>
	<li>在另一管中，使用细胞追踪红色染料 CMTPX（500 ng/ml）（Invitrogen）对从野生型或 gp91phox-/- 小鼠（经 LPS 处理 6 小时）分离的非激活或激活型巨噬细胞进行标记，标记缓冲液为含 2% BSA 和 0.003% 普流罗尼克酸的 ECM。标记后，洗涤细胞并重悬于 200 μl 实验成像溶液中。</li>
	<li>将标记的巨噬细胞加入含有 fluo-4 AM 负载的 MPMVECs 的培养皿组件中。</li>
	<li>使用 Carl Zeiss LSM510 Meta 共聚焦成像系统，配备氩离子激光器，分别以 488 nm 和 561 nm 激发 fluo-4 AM 和细胞追踪红色荧光，每 3 秒记录一次绿色和红色荧光，持续 10–20 分钟（图 4 A-C）。 
	注意：也可使用 J774.1 细胞系诱导 MPMVECs 的 Ca2+ 动员。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件（1.44 版）分析 fluo-4 荧光强度的变化（见第 6 节）。</li>
</ol>
6. 使用 ImageJ 软件进行数据分析
将共聚焦系统获得的图像以 .lsm 格式文件形式转移用于数据分析。LSM 510 Meta 共聚焦显微镜或 LSM 710 多光子共聚焦显微镜配套的 ZEN 2009 和 ZEN 2010 软件分别将文件保存为 .lsm 格式。我们建议使用这种原始的 .lsm 文件进行图像分析，以保留原始图像质量。该文件格式可直接在图像分析程序 Image J 中打开。以下步骤提供了单幅图像定量分析的示例。此数据分析无需额外插件。
<ol>
	<li>在 Image J 程序中使用“文件”&gt;“打开”打开 .lsm 或 .TIFF 文件</li>
	<li>点击“图像”&gt;“颜色”&gt;“拆分通道”选项卡，拆分绿色和 DIC 通道。后续分析使用绿色通道的图像。</li>
	<li>双击并选择“椭圆画笔选区”选项卡，将像素值设置为 20。</li>
	<li>对于 Hyper-cyto 图像，单击单个细胞以定义测量的圆形区域，然后按“M”键测量所选区域的强度。数值将保留在新的结果窗口中。</li>
	<li>接着在按住“Shift”键的同时单击另一个细胞以选择另一个区域，然后按“M”键。强度值将记录在结果窗口中。在 50 个不同的细胞上重复步骤 4–5。</li>
	<li>对于 Hyper d-mito 图像，在“椭圆画笔选区”中将像素值设置为 10。需手动勾画感兴趣区域（ROI），包括特定细胞的线粒体。</li>
	<li>使用自由手绘工具围绕线粒体区域进行勾画，然后按“M”键。在 50 个不同的细胞上重复步骤 6–7。</li>
	<li>从结果窗口复制平均值，并粘贴到 Excel 表格或任意软件中以绘制结果图。我们通常使用 SigmaPlot 或 GraphPad PRISM 将数据绘制成图表。</li>
</ol>
7. 代表性结果
图1显示了在Toll样受体配体刺激下胞质和线粒体活性氧的产生情况。代表性共聚焦图像显示，经刺激6小时后，DCF（胞质）和MitoSOX Red（线粒体）荧光强度增加。荧光变化经归一化处理后以倍数变化表示。
图2展示了稳定的HyPer-cyto和HyPer-dMito内皮细胞的构建过程。通过电穿孔法将pHyPer-cyto或pHyPer-dMito质粒载体转染至小鼠内皮细胞中。利用G418对稳定表达质粒的细胞筛选两周。筛选后，将细胞稀释并接种于96孔板中。分离单个克隆，并通过成像验证其表达的均一性。
图3显示了内皮细胞胞质和线粒体中H2O2水平的测定结果。代表性共聚焦图像显示，刺激6小时后，HyPer-cyto（胞质）和HyPer-dMito（线粒体）的荧光增强。荧光强度变化经归一化处理后以倍数变化表示。
图4显示了巨噬细胞来源的活性氧诱导内皮细胞胞质Ca2+动员的评估结果。将脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞加入已预先负载细胞内Ca2+（[Ca2+]i）荧光指示剂Fluo-4的肺微血管内皮细胞（PMVEC）中。加入野生型LPS激活的巨噬细胞可引发PMVEC中[Ca2+]i升高，而缺乏功能性NADPH氧化酶（gp91phox-/-）的巨噬细胞则减弱了该效应。
<img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="氧化应激分析，DCF 和 MitoSOX Red 的荧光显微镜图像；倍数变化结果的柱状图。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 巨噬细胞产生细胞内活性氧（ROS）和线粒体超氧化物的可视化。J774.1 细胞经 TLR2、TLR3 和 TLR4 配体刺激。（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml，Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml LPS-TLR4）在 37°C 下处理 6 小时。处理后细胞分别负载（A）细胞内 ROS 指示剂（H2DCF-DA；绿色荧光）或（B）线粒体超氧化物指示剂（MitoSOX Red；红色荧光）。（C）使用抗霉素 A 作为线粒体 ROS 产生的阳性对照。采用共聚焦显微镜评估荧光强度变化。（D）和（E）平均荧光变化的定量分析。
<img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="电穿孔法示意图：内皮细胞转染、G418/克隆筛选、共聚焦成像。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2. 内皮细胞胞质和线粒体活性氧指示剂稳定表达的示意图。
<img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="荧光成像及柱状图显示细胞对LTA、Poly(IC)、LPS处理的反应。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 内皮细胞胞质和线粒体H2O2水平的可视化。 稳定表达（A）HyPer-cyto或（B）HyPer-dMito的MPMVECs在37°C下分别用TLR2、TLR3和TLR4配体处理6小时（2 μg/ml，脂磷壁酸-TLR2；10 μg/ml，Poly (I:C)-TLR3；1 μg/ml LPS-TLR4）。（C）使用抗霉素A作为线粒体活性氧产生的阳性对照。处理后，采用共聚焦显微镜检测荧光强度变化。（D）和（E）平均荧光变化的定量分析。
<img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="内皮细胞-巨噬细胞共培养共聚焦成像；Fluo-4 荧光时间图分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4. 巨噬细胞来源的活性氧导致内皮细胞 Ca2+ 动员受损。（A） 内皮细胞与巨噬细胞共培养模型研究的示意图。（B） 分别从野生型（WT）和 gp91phox 基因敲除小鼠（The Jackson Laboratory）中新鲜分离的巨噬细胞，用 1 μg/ml LPS 激活 6 小时。巨噬细胞用 Cell-tracker Red（红色）标记后，加入已负载 Fluo-4 的肺微血管内皮细胞（PMVECs，绿色），以评估旁分泌 O2•- 信号传导。（C） 来自野生型小鼠的 LPS 激活巨噬细胞相较于 gp91phox 基因敲除小鼠的巨噬细胞，可引发 PMVECs 中显著且快速的 Ca2+ 动员。巨噬细胞激活的有效性此前已有验证。

<ol><li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.</li>
<li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li>
<li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li>
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<li>Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+defense+mechanisms.+The+production+by+leukocytes+of+superoxide%2C+a+potential+bactericidal+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent.</a> J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).</li>
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<li>Mukhopadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方法可利用氧化敏感性染料或质粒传感器，快速、定量地测量活细胞中的活性氧（ROS）。Toll样受体（TLR）激动剂是一类通过细胞表面存在的TLR刺激细胞并激活下游信号通路的化合物15。在本实验方案中，我们使用了三种不同的TLR激动剂作为诱导ROS产生的模型系统，分别为：脂磷壁酸（Lipo-teichoic acid）—TLR2激动剂；聚肌胞苷酸（Poly (I:C)）—TLR3激动剂；脂多糖（LPS）—TLR4激动剂。利用对氧化剂敏感的染料检测ROS具有快速的优点，且可检测多种ROS种类。而基于质粒的传感器HyPer则可选择性地检测H2O2水平。H2O2是一种较为稳定的氧化剂，且在稳定表达细胞系中使用HyPer-cyto和HyPer-dMito可避免ROS敏感荧光染料常见的光自氧化问题。HyPer不会人为诱导ROS的产生，可用于检测在不同生理和病理条件下，细胞不同区室中H2O2浓度的快速变化。稳定表达HyPer传感器的细胞可用于克隆筛选，从而获得更可靠、更准确的H2</...

<table><tbody><tr><td>Attofluor 细胞培养皿</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>低糖 DMEM 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>10567-014</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长因子补充剂（ECGS）</td><td>Upstate, Millipore</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>12662011</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;DCFDA</td><td>Invitrogen</td><td>D-399</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>LTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2515</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Invitrogen</td><td>51985091</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10x）</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>pHyPer-cyto</td><td>Evrogen</td><td>FP941</td><td></td></tr><tr><td>pHyPer-dMito</td><td>Evrogen</td><td>FP942</td><td></td></tr><tr><td>Poly(I:C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0913</td><td></td></tr><tr><td>Prism 软件 5.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot 11.0</td><td>Systat software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（10x）</td><td>Invitrogen</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>96 孔组织培养微孔板</td><td>BD Biosciences</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2009 软件</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

由旁分泌来源的活性氧触发的血管钙2+信号转导的可视化

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

氧化应激已被证实与多种病理状态相关，包括缺血/再灌注损伤和脓毒症。氧化应激的概念指的是活性氧（ROS）的异常生成，这些活性氧包括超氧阴离子（O2•-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基。活性氧影响多种细胞过程，包括信号转导、细胞增殖和细胞死亡1-6。ROS 可直接损伤血管和器官细胞，并可引发继发性化学反应和基因改变，最终导致初始 ROS 介导的组织损伤被放大。加剧不可逆组织损伤的放大级联反应中的一个关键环节是循环炎症细胞的募集与激活。在炎症过程中，炎症细胞产生如肿瘤坏死因子-α（TNFα）和 IL-1 等细胞因子，这些因子可激活内皮细胞（EC）和上皮细胞，进一步增强炎症反应7。血管内皮功能障碍是急性炎症的明确特征。巨噬细胞通过尚不明确的机制参与了炎症期间的内皮功能障碍。巨噬细胞激活后会向细胞外释放 O2•- 和多种促炎性细胞因子，从而在邻近细胞中触发病理性信号传导8。在大多数细胞类型中，NADPH 氧化酶是 ROS 的主要和初级来源。最近，我们及其他研究者9,10发现，在多种病理生理条件下，NADPH 氧化酶产生的 ROS 可诱导线粒体产生 ROS。因此，在检测胞质 ROS 的同时，检测线粒体 ROS 的生成同样重要。巨噬细胞通过黄素蛋白酶 NADPH 氧化酶产生 ROS，该酶在炎症过程中起主要作用。一旦被激活，吞噬性 NADPH 氧化酶会产生大量 O2•-，这在宿主防御机制中具有重要意义11,12。尽管旁分泌来源的 O2•- 在血管疾病发病机制中发挥重要作用，但旁分泌 ROS 诱导的细胞内信号传导（包括 Ca2+ 动员）的可视化仍处于假设阶段。我们建立了一个模型，利用激活的巨噬细胞作为 O2•- 的来源，将信号传递给邻近的内皮细胞。通过该模型，我们证明巨噬细胞来源的 O2•- 可导致邻近内皮细胞中的钙信号传导。

本文介绍了一种高效的方法，用于深入研究旁分泌来源的活性氧（ROS）诱导内皮细胞Ca2+信号的可视化。该方法利用共培养模型，检测旁分泌来源的ROS所触发的血管内皮细胞内Ca2+动员。

氧化应激已被证实与多种病理状态相关，包括缺血/再灌注损伤和脓毒症。氧化应激的概念……

本实验的总体目标是观察由旁分泌来源的活性氧（ROS）引发的血管钙信号。首先利用氧化敏感性染料在活化巨噬细胞中观察ROS，此外还可通过基于质粒的荧光传感器在内皮细胞中检测ROS。然后在共培养模型中同时观察被细胞示踪红染料标记的活化巨噬细胞和四标记的内皮细胞的荧光信号。最后，利用共聚焦成像系统，检测由巨噬细胞来源的活性氧触发的内皮细胞内钙信号。这些结果可独立显示活性氧（ROS）水平，同时评估由游隼来源的活性氧触发的细胞内钙离子动员。该方法能够同时检测两种不同的信号分子，从而紧密模拟血管信号传导及病理生理环境。我实验室的两位博士后 Karthik 和 Raj 将演示在活性氧和钙离子测量以及巨噬细胞与内皮细胞相互作用中的实验操作流程。在玻璃底35毫米培养皿中培养小鼠单核细胞来源的巨噬细胞。随后用Toll样受体激动剂刺激细胞，并在37°C下孵育6小时。用于可视化胞质中的目标结构。加入对氧化敏感的染料，孵育细胞20分钟。随后在共聚焦成像系统的温控载物台上观察细胞。或者，若要观察经TLR激活的细胞中的线粒体活性氧，可加入线粒体超氧化物指示剂，并在37摄氏度下孵育细胞30分钟。对于阴性对照，用 PBS 或 DMSO 处理细胞作为阳性对照。用 2 毫摩尔的抗霉素 A 处理细胞，并在共聚焦成像系统的温度控制载台上对所有细胞进行可视化观察。使用 ImageJ 软件分析所有图像数据。该荧光探针可特异性检测亚微摩尔浓度的过氧化物，并且基于哺乳动物表达载体的设计，可将探针靶向定位于细胞质或线粒体。通过电穿孔法，构建稳定表达适当 Hyper 探针质粒的小鼠肺微血管内皮细胞系。为促进菌落生长，将细胞以低密度接种于完全TMEM培养基中，37°C孵育48小时，随后更换为含有筛选抗生素的完全培养基。筛选出高比例超表达阳性细胞的克隆，并扩增培养以建立稳定超表达阳性细胞系，用于单独实验。将细胞接种于0.2%明胶包被的盖玻片上，过夜培养至80%汇合度。现在用 TLR 配体激活细胞，并在 37 摄氏度下孵育六小时。为了检测胞质内活性氧，将细胞的盖玻片安装到 adelo 细胞培养小室中。加入一毫升预热的缓冲盐溶液，并将培养小室置于共聚焦成像系统的温度控制载台上。记录细胞中荧光变化以检测线粒体活性氧（ROS）。加入两微摩尔的抗霉素A作为阳性对照。随后制备经处理细胞的盖玻片用于共聚焦显微镜观察。使用ImageJ软件进行图像分析。将内皮细胞接种于明胶包被的玻璃盖玻片上，培养至80%融合度，用于观察和测量细胞内钙离子浓度变化。在室温下用荧光染料Fluo-4 AM孵育细胞30分钟，以尽量减少染料流失，随后用含有磺胺吡唑的实验成像溶液洗涤细胞。将盖玻片安装到容积为800 µL预热实验成像溶液的Adelo细胞腔室中，并将细胞置于共聚焦成像系统配备温控载物台的独立腔室内。使用 500 纳克/毫升的细胞示踪红 C-M-T-P-X 在 15 分钟内标记待研究的巨噬细胞群体，洗涤细胞并将沉淀重悬于 200 微升的实验成像溶液中。然后将标记的巨噬细胞加入已装载荧光素 4:00 AM 的内皮细胞的共聚焦腔室组件中，每 3 秒记录一次绿色和红色荧光，持续 10 分钟。在本实验中，J 7 74 0.1 细胞经 TLR 2、3 和 4 配体刺激 6 小时。代表性共聚焦图像显示，通过 DCF 检测到胞质内活性氧（ROS）水平升高。有趣的是，MitoSOX 红色荧光表明线粒体活性氧（ROS）也出现类似升高。这些荧光变化具有定量性，因此结果必须进行归一化处理，并以每种处理的相对倍数变化表示。抗霉素A信号可作为线粒体活性氧（ROS）生成的阳性对照验证。该图显示了稳定表达hyper-Cyto或hyper-Mito的内皮细胞中细胞质和线粒体过氧化物水平的图像。经TLR激动剂刺激的MP ECS。共培养系统中刺激6小时后，平均荧光变化的定量结果显示高细胞质荧光和高线粒体D荧光均增加。为评估Peregrine ROS信号通路，分别从野生型和GP 91 Fox基因敲除小鼠中新鲜分离镜像巨噬细胞，并用1微克/毫升LPS激活6小时。用C-M-T-P-X将巨噬细胞标记为红色，并添加到绿色荧光标记的四型中。加载完成。MPM ecs。有趣的是，与来自GP 91 Fox基因敲除小鼠的巨噬细胞相比，来自野生型小鼠的LPS激活巨噬细胞在MPM ECS中引发了更大且更迅速的钙离子动员。在进行该实验操作时，需注意长时间孵育或激光照射均会导致DCF发生自氧化。必须避免Hyper Cyto和Hyper D二尖瓣的光漂白。若操作得当，掌握RA测量技术后，可在巨噬细胞和内皮细胞中于七小时内完成检测。

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