血管钙的可视化 ^{2 +}信号旁分泌源性活性氧引发

本实验的总体目标是观察由旁分泌来源的活性氧（ROS）引发的血管钙信号。首先，通过使用氧化敏感性染料对活化巨噬细胞中的 ROS 进行可视化，从而实现这一目标。此外，还可利用基于质粒的荧光传感器在内皮细胞中观察 ROS。

然后在共培养模型中同时观察被细胞示踪红染料标记的活化巨噬细胞和四标记的内皮细胞的荧光信号。最后，利用共聚焦成像系统，检测由巨噬细胞来源的活性氧触发的内皮细胞内钙信号。

这些结果可独立显示活性氧（ROS）水平，同时评估由游隼来源的活性氧（ROS）引发的细胞内钙动员。该方法能够同时检测两种不同的信号分子，深入模拟血管信号传导及病理生理环境。我实验室的两位博士后，Karthik 和 Raj，将演示该方法在活性氧和钙离子测量以及巨噬细胞-内皮细胞相互作用中的操作流程。

将小鼠单核细胞来源的巨噬细胞培养于玻璃底35毫米培养皿中。随后用Toll样受体激动剂刺激细胞，并在37摄氏度下孵育6小时。用于观察细胞质中的变化。

加入对氧化敏感的染料，孵育细胞20分钟。随后在共聚焦成像系统的温控载物台上观察细胞。或者，若要观察经TLR激活的细胞中的线粒体活性氧，可加入线粒体超氧化物指示剂，并在37摄氏度下孵育细胞30分钟。

对于阴性对照，用 PBS 或 DMSO 处理细胞以作为阳性对照。用 2 毫摩尔的抗霉素 A 处理细胞，并在共聚焦成像系统的温度控制载台上对所有细胞进行可视化观察。

使用 ImageJ 软件分析所有图像数据。该荧光探针可高特异性地检测亚微摩尔浓度的过氧化物，并且基于哺乳动物表达载体的设计，可将探针靶向定位于细胞质或线粒体。通过电穿孔法，构建稳定表达适当 hyper 探针质粒的小鼠肺微血管内皮细胞系。

为促进菌落生长，将细胞以低密度接种于完全TMEM培养基中，并培养48小时，随后更换为含有筛选抗生素的完全培养基。筛选出高表达阳性细胞比例最高的克隆，并扩增培养以建立稳定的高表达阳性细胞系用于单独实验。将细胞接种于经0.2%明胶包被的盖玻片上，培养过夜至80%融合度。

现在用TLR配体激活细胞，并在37摄氏度下孵育六小时。为了检测胞质内活性氧（ROS），将细胞的盖玻片装入Adelo细胞培养小室中。加入一毫升预热的缓冲盐溶液，并将小室置于共聚焦成像系统的温控载物台上。

记录细胞中荧光变化以检测线粒体活性氧（mitochondrial ROS）。设置2微摩尔抗霉素A（antimycin A）作为阳性对照。随后制备经处理细胞的盖玻片用于共聚焦显微镜观察。使用ImageJ软件进行图像分析。

将内皮细胞接种于明胶包被的玻璃盖玻片上，培养至80%融合度，用于观察和测量细胞内钙离子浓度变化。在室温下用荧光染料Fluo-4 AM孵育细胞30分钟，以尽量减少染料流失，随后用含有Saponin的实验成像溶液洗涤细胞。接着将盖玻片安装到容积为800 µL的Adelo细胞腔室中，加入预热的实验成像溶液，并将细胞置于共聚焦成像系统配备的温度控制载物台上，另用一管保存备用。

使用500 纳克/毫升的Cell Tracker Red CMTMR（红荧光染料）对目标巨噬细胞群体进行标记，孵育15分钟，随后洗涤细胞并将细胞沉淀重悬于200 微升的实验成像溶液中。接着将标记后的巨噬细胞加入已装载Fluo-4 AM的共聚焦培养腔室中的内皮细胞上，每3秒记录一次绿色和红色荧光，持续10分钟。

在本实验中，J 7 74 0.1 细胞经 TLR 2、3 和 4 配体刺激 6 小时。代表性共聚焦图像显示，通过 DCF 测得的胞质 ROS 水平升高。有趣的是，MitoSOX 红色荧光表明线粒体 ROS 也出现类似上升。

这些荧光变化具有定量性，因此结果必须进行归一化处理，并以每种处理的相对倍数变化来表示；抗霉素A的信号可作为线粒体活性氧产生的阳性对照。该图显示了稳定表达Hyper-Cyto或Hyper-Mito的内皮细胞中胞质和线粒体过氧化物水平的图像。

经TLR激动剂刺激的MP ECS。定量分析平均荧光变化显示，在共培养系统中刺激6小时后，高细胞质荧光和高线粒体D荧光均增加。为评估Peregrine ROS信号通路，分别从野生型和GP 91 Fox基因敲除小鼠中新鲜分离出mirin巨噬细胞，并用1微克/毫升LPS激活6小时。

用C-M-T-P-X将巨噬细胞标记为红色，并添加到绿色荧光四。加载。MPM ecs。有趣的是，与来自GP 91 Fox基因敲除小鼠的巨噬细胞相比，来自野生型小鼠的LPS激活巨噬细胞在MPM ECS中引发了更大且更迅速的钙动员。

在进行该实验操作时，需注意长时间孵育或激光照射均会导致DCF发生自氧化。必须避免Hyper Cyto和Hyper D二尖瓣的光漂白。若操作得当，掌握RA测量技术后，可在巨噬细胞和内皮细胞中于七小时内完成检测。