Name: 光谱共焦成像的荧光标记的尼古丁受体敲在慢性尼古丁政府小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习使用光谱共焦显微成像技术定量分析慢性尼古丁暴露小鼠脑内荧光标记的α4 YFP烟碱型乙酰胆碱受体的变化。该方法可实现亚微米分辨率的高精度受体定位与表达水平检测。

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Anthony Renda 获得了维多利亚大学研究生奖学金的支持。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金、NARSAD 青年研究者奖（授予 R.N.）、维多利亚基金会—Myre 与 Winifred Sim 基金、加拿大创新基金会资助、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大自然科学与工程研究理事会研究工具与仪器基金的资助。我们感谢 Jillian McKay、Christina Barnes、Ariel Sullivan、Jennifer MacDonald 和 Daniel Morgado 在小鼠饲养管理方面提供的出色支持。

1. 泵植入
<ol>
	<li>在植入泵之前，填充并准备 Alzet 微渗透泵（Alzet，型号 2002，Cupertino，USA），注意避免引入气泡。该型号微渗透泵以 0.5 μl/hr 的速率持续输送溶液 14 天。确保无菌条件。称量空泵和填充后的泵。在实验结束时（植入后 10 天），可用注射器和针头从泵中抽出剩余液体并称重，以计算已泵出的体积。</li>
	<li>含对照溶液的泵中装有生理盐水（0.9% w/v，Teknova，S5819，Hollister，USA）。配制尼古丁溶液时，将 1 M 储存液的 (-)-尼古丁酒石酸氢盐（Sigma，货号# N5260）用生理盐水（0.9% w/v）稀释，并通过 0.22 μm 注射器滤器过滤除菌。我们此前曾以 0.4 和 2 mg/kg/hr（按尼古丁游离碱计算）的剂量连续给予尼古丁 10 天。</li>
	<li>准备三个盐水浴（三个盛有盐水的 10 cm 培养皿）。泵填充并封口后，依次在每个盐水浴中彻底清洗泵体，以去除外壳表面残留的药物。将填充好的泵浸入盐水溶液中保存直至手术，对照泵与尼古丁泵应分别置于不同的盐水容器中。</li>
	<li>为促进动物术后健康恢复并降低术后感染风险，应提前准备好清洁的笼具用于长期恢复。</li>
	<li>手术后即刻的短期恢复阶段，准备一个配备加热垫和加热灯的笼具。</li>
	<li>为研究慢性尼古丁作用，每组使用 5 至 6 只纯合 α4YFP 基因敲入小鼠（2–3 月龄）（对照组或尼古丁组）。α4YFP 基因敲入小鼠品系已回交至 C57BL/6J 小鼠背景 10 代。确保所有小鼠的年龄和性别一致，并在同一天完成所有手术操作，以最小化实验变异。为防止手术期间及术后小鼠体温过低，手术台应配备覆盖无菌手术单的加热垫。</li>
	<li>使用 3 L/min 氧气和 3% 异氟烷诱导 α4YFP 基因敲入小鼠麻醉，随后以 2.5 L/min 氧气和 1% 异氟烷维持麻醉。我们优先选择异氟烷麻醉，因其在手术结束后可迅速从体内清除，小鼠通常在约 2 分钟内恢复意识并能够活动。立即滴加眼药膏（Tear-Gel，Novartis）以防止角膜损伤。</li>
	<li>通过颈部背部皮肤切口将泵皮下植入，并将泵沿背部背侧向尾部方向推入。用 95% 乙醇擦拭小鼠前肢之间的背部区域，使毛发贴服。使用 0.8 mm Graefe 镊子（Fine Science Tools，11050-10）夹起皮肤，用虹膜剪刀（Fine Science Tools，14060-10）做一长约 1 cm 的中央侧向切口。</li>
	<li>为创建容纳泵的皮下空间，将标准剪刀（Fine Science Tools，14101-14）插入切口，并小心向动物尾端推进。</li>
	<li>使用 1.0 mm Graefe 镊子（Fine Science Tools，11650-10）从盐水中取出泵。用镊子撑开切口，将泵插入切口，使渗透泵的帽端朝向动物尾部，并将泵推向尾端。</li>
	<li>用 0.8 mm 镊子将伤口夹闭，涂抹适量 Vetbond（3M，货号# 1469SB）胶水，保持夹闭状态直至伤口完全封闭。</li>
	<li>将动物从异氟烷面罩中取出，皮下注射镇痛剂美洛昔康（meloxicam，0.1 mg/kg），然后放入短期恢复笼具直至恢复意识并能自由活动。随后转移至长期恢复笼具，并自由提供食物和饮水 ad libitum。</li>
</ol>
2. 通过心脏内灌注固定α4YFP基因敲入小鼠
<ol>
	<li>在操作前一天配制溶液并放置于 4° C为尽量减少差异，所有小鼠将在同一天使用同一批次的溶液进行灌注。</li>
	<li>在通风良好的区域进行灌注固定。用 ddH₂O 冲洗蠕动泵（Masterflex Easy Load, 7518-00；Masterflex 泵控制器, 60648）管路2O.</li>
	<li>加入约 0.0015 g 肝素（抗凝剂，Sigma，货号 H4784）至 20 ml PBS（pH 7.6，Invitrogen，货号 70011）中。</li>
	<li>通过在后肢肌肉注射氯胺酮（25 mg/kg，Wyeth Animal Health）与盐酸美托咪啶（0.25 mg/kg，Pfizer）混合液，对α4YFP基因敲入小鼠进行麻醉，并立即将其放回原笼。</li>
	<li>将动物固定在插入金属托盘中的泡沫塑料盖上。用95%乙醇擦拭胸部。用Adson镊子（Fine Science Tools, 91106-12）夹住皮肤，用虹膜剪剪开胸腔。用超细止血钳（Fine Science Tools, 13021-12）夹住肋骨，暴露心脏。</li>
	<li>以 4 ml/min 的流速开始泵入 PBS，并将 23G 蝴蝶针（Becton Dickinson, 367253）插入动物的左心室。立即剪开右心房，使血液和灌注液得以流出。</li>
	<li>灌注20 ml PBS（pH 7.6），随后灌注30 ml 4% 多聚甲醛（pH 7.6，用PBS将16% PFA储备液稀释而成，Electron Microscopy Sciences，货号# 15710），再灌注20 ml 5% 蔗糖（pH 7.6）。我们发现过度固定会增加自发荧光。用5%蔗糖灌注可清除脑组织中残留的PFA，从而降低自发荧光。</li>
	<li>取出脑组织并置于30%蔗糖溶液中保存3天。</li>
	<li>为冷冻脑组织以进行冠状切片，用剃刀片切除小脑，将脑组织置于塑料包埋模具（VWR，货号# 18986-1）中，前端朝上，加入O.C.T.包埋剂（Tissue-Tek，货号# 4583）完全浸没脑组织。置于干冰中冷冻后，储存于-80℃20 °C 切片前</li>
	<li>脑切片（30 μm 在冷冻切片机上将脑组织切成一定厚度的切片，然后转移至涂覆载玻片上。将脑切片储存在 -20°C 置于含有无水硫酸钙干燥剂的载片盒中。载片盒应放入自封袋中密封，以避免潮湿及在-80 °C储存时发生冻伤。20°C.</li>
</ol>
3. 使用光谱共聚焦显微镜对荧光标记的nAChR进行成像
<ol>
	<li>确保载玻片尽量减少暴露于任何光源，以最大限度降低光漂白。</li>
	<li>使用不会抑制荧光蛋白荧光的封片介质对脑切片载玻片进行封片。我们使用 Mowiol 4-88（Tris-HCl 和甘油中 pH 8.5，EMD-Calbiochem，货号# 475904）效果良好，该介质在数小时后会硬化。封片前务必使 Mowiol 平衡至室温，以避免产生气泡。封片时切勿使用指甲油，因其会淬灭 YFP 荧光。</li>
	<li>使用 Nikon C1si 光谱共聚焦显微镜系统采集图像。光谱共聚焦成像及线性解混方法的详细信息见其他文献13-15。采用光谱共聚焦显微镜的原因在于固定脑组织具有固有的自发荧光。Nikon C1si 上的光谱共聚焦成像利用由 32 个光电倍增管探测器组成的阵列，对荧光发射光在特定波长范围内的信号进行采样，通过光栅色散元件将光在空间上按不同波长分散，其原理类似于棱镜将白光折射成彩虹色16。所采集的数据为一系列波长图像（lambda stack）——即在不同波长下采集的图像，从而为 lambda stack 中每个像素收集发射光谱。由于 YFP 和组织自发荧光各自具有特征性的光谱特征，因此可利用线性解混代数算法将 lambda stack 分解为独立的 YFP 信号和自发荧光信号（图 2）。因此，即使在自发荧光水平较高的组织中，也能实现对 YFP 荧光的精确量化。</li>
	<li>可调整多种参数以优化图像质量和荧光采集效率。我们将报告通常使用的设置，但这些设置可根据样本和共聚焦显微镜的具体情况调整。为准确量化慢性尼古丁处理引起的 α4YFP 亚基表达变化，需确保所有像素信号的灰度级强度低于饱和值（12 位灰度级下 < 4095）。此外，为应对受体上调可能导致的信号增强，需调整共聚焦设置，使像素信号强度约为饱和值的三分之一（~1300–1400）或更低。一旦参数优化完成，所有成像过程和样本均需保持完全相同的设置。</li>
	<li>我们使用以下参数对 α4YFP 进行成像：采用 60X 油镜 CFI Plan Apo VC 物镜（1.40 数值孔径，工作距离 0.13 mm），488 nm 激光线使用 40 mW 氩离子激光器最大透射率的 15%，光谱探测器增益设为 220，成像光谱范围为 496.5 nm 至 656.5 nm，分辨率为 5 nm，图像分辨率为 512 × 512 像素，成像区域为 50 μm × 50 μm，针孔尺寸为中等（直径 60 μm），像素驻留时间为 4.08，扫描平均次数为 2 次，灰度级为 12 位。</li>
</ol>
4. 光谱共聚焦图像的线性解混与图像分析
<ol>
	<li>要对使用光谱共聚焦显微镜拍摄的样本图像进行线性光谱反卷积，首先必须获取YFP的参考光谱以及组织自发荧光的参考光谱。</li>
	<li>获取任何参考光谱的一个重要前提是：使用与样本成像相同的激光波长，获得信噪比较高的荧光光谱。尽管氩离子激光器的514 nm波长对YFP的激发效率更高，但我们更倾向于使用488 nm激光线对YFP成像，因为该波长与YFP发射峰之间具有更好的分离度，且488 nm激光线更不易扭曲发射峰形，从而能够完整获取YFP的整个发射光谱，包括从上升至峰值的全过程。我们对转染了可溶性YFP的细胞系进行成像，以获得较强的YFP信号，并将所得的YFP光谱存入我们的参考光谱库中。过表达转染的α4YFP细胞系也可用于此目的，因其同样可提供高信噪比的光谱。</li>
	<li>为获得自发荧光的参考光谱，我们对野生型小鼠脑切片中拟用于α4YFP小鼠成像的各个脑区进行成像，采集其相应的自发荧光光谱。我们使用相同的488 nm激光线，并尽可能采用相似的成像参数，尽管可能会调整探测器增益、激光强度或进行平均成像以最大化信噪比。</li>
	<li>在获取α4YFP小鼠脑区的光谱共聚焦图像后，利用该脑区对应的YFP参考光谱和野生型小鼠自发荧光参考光谱，通过线性光谱反卷积算法将图像分解为YFP信号和自发荧光信号。</li>
	<li>反卷积后的α4YFP图像可在ImageJ等图像分析软件中打开（<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>），然后计算感兴趣区域的平均像素强度。可使用名为“loci_tools.jar”的ImageJ插件（<a href="http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej" target="_blank">http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej</a>）导入Nikon ics/ids共聚焦文件。</li>
	<li>我们对同一脑区的野生型小鼠重复相同的线性光谱反卷积与分析流程，以获得背景残留值。</li>
	<li>随后，通过从未经校正的α4YFP平均强度值（4.5）中减去背景残留值（4.6），得到校正后的α4YFP平均强度值。</li>
</ol>
5. 代表性结果
我们展示了一张来自纯合α4YFP小鼠内侧缰核的代表性真彩色投影图像，该图像是通过光谱共聚焦显微镜采集的lambda图像堆栈生成的（图3A）。同时展示了来自同一lambda图像堆栈中包含α4YFP阳性神经元的兴趣区域的发射光谱（图3B）。在约527 nm处可见明显的发射峰，这正是黄色荧光蛋白（YFP）的荧光发射峰值。邻近内侧缰核的区域显示出的发射光谱在527 nm处无明显的光谱峰，表明该区域缺乏α4YFP烟碱型乙酰胆碱受体亚单位。通过使用YFP和小鼠脑组织自发荧光的参考光谱进行线性光谱解混（二者发射光谱存在显著重叠，图4），可实现YFP信号与自发荧光信号的分离，从而获得α4YFP解混图像、自发荧光解混图像以及残余通道图像。在内侧缰核紧密排列的细胞体中，可以清晰地识别出α4YFP荧光的定位（图4）。
在海马中，α4YFP主要定位于内侧穿通通路、颞-海马旁通路以及海马伞12。这些均为海马的谷氨酸能神经支配区域。我们检测了慢性尼古丁处理对海马穿通通路中α4YFP表达的影响（图5）。连续给予尼古丁（2 mg/kg/hr，持续10天）后，与对照组生理盐水处理的小鼠相比，慢性尼古丁处理小鼠的α4YFP荧光强度显著增加（69 ± 14%，p = 0.001，Wilcoxon秩和检验）（图5）。
<img alt="α4YFP基因敲入小鼠成像流程、光谱解混示意图、共聚焦显微镜设置" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 显示在慢性尼古丁处理下对α4YFP nAChR亚基变化进行成像的流程图。微型渗透压泵中装入生理盐水或尼古丁，并皮下植入α4YFP纯合小鼠体内。10天后，对小鼠进行灌流，使用4%多聚甲醛固定，随后将小鼠脑组织切片（厚度为30 μm）并贴附于载玻片上。脑切片在光谱共聚焦显微镜（Nikon C1si）上进行成像，并通过光谱解混获得YFP信号和自发荧光图像。随后使用ImageJ软件进一步分析α4YFP图像。
<img alt="光谱数据分析示意图；吸收光谱；归一化强度与波长关系图。" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 从光谱共聚焦显微镜获取的 lambda 堆栈图像及其经线性光谱拆分后各组分的示意图。（A）采集一组 lambda 堆栈图像。（B）lambda 堆栈由在不同波长光下采集的图像组成，从而在整个堆栈的每个像素上均收集到发射光谱。（C）由于 YFP 和组织自发荧光各自具有特征性的光谱特征，因此可利用线性光谱拆分代数算法将 lambda 堆栈解卷积为独立的 YFP 信号和自发荧光信号。因此，即使在自发荧光水平较高的组织中，也能实现对 YFP 荧光的精确量化。
<img alt="荧光显微镜图像与发射光谱图；光学特性分析。" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 表达α4YFP nAChR的脑区的光谱共聚焦图像。（A）使用尼康C1si光谱共聚焦显微镜获取的α4YFP小鼠内侧缰核区域的lambda堆栈图像的真彩色投影。（B）感兴趣区域（包含表达α4YFP的神经元，绿色）和内侧缰核外区域（红色）的光谱图。
<img alt="荧光显微镜，光谱分析；带有发射光谱图的显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4. 内侧缰核的线性光谱解混。（A）经线性光谱解混后分离出的 α4YFP 图像，以及（B）自体荧光图像。（C）用于光谱解混的 YFP（绿色三角形）和自体荧光（黄色圆形）参考光谱。
<img alt="比较尼古丁与生理盐水处理的α4YFP表达的荧光成像及柱状图" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5. 慢性尼古丁暴露的α4YFP基因敲入小鼠海马中α4 nAChR的上调。（A）海马区α4YFP荧光的拼接图像。两条虚线框选区域大致对应于海马穿通通路下支的位置，用于每只小鼠的分析。（B）与慢性生理盐水处理组相比，慢性尼古丁暴露小鼠穿通通路中的α4YFP荧光显著增强（*，p = 0.001，Wilcoxon秩和检验）。结果表示为生理盐水组与慢性尼古丁处理组小鼠（每组5只，共n = 20次测量）的均值 ± 标准误（SEM）。
<img alt="共聚焦显微镜Z轴堆栈分析；包含强度图和光学切片结果的示意图。" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6. 与抗体标记相比，α4YFP具有更优的深度表达。α4YFP荧光的X-Z正交视图（A）和使用Cy5作为二抗标记的VGlut2抗体染色结果（B）。（C）荧光信号强度随深度衰减的曲线图，显示抗体染色（黑色方块）的信号衰减程度大于α4YFP（空心圆圈）。

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<li>Jones, I. W., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+doesn%27t+nicotinic+ACh+receptor+immunoreactivity+knock+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out.</a> Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).</li>
<li>Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+suitability+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+standard+immunodetection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures.</a> J. Neurochem. , (2007).</li>
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<li>Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+underlies+chronic+nicotine-induced+up-regulation+of+nicotinic+agonist+binding+sites+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).</li>
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<li>King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta2-subunit-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+are+critical+for+dopamine-dependent+locomotor+activation+following+repeated+nicotine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration.</a> Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).</li>
<li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li>
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<li>Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroadaptive+changes+in+the+mesoaccumbens+dopamine+system+after+chronic+nicotine+self-administration%3A+a+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study.</a> Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).</li>
<li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+containing+the+%C3%8E%C2%B22+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li>
<li>Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habenular+%CE%B15+nicotinic+receptor+subunit+signalling+controls+nicotine+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake.</a> Nature. 471, 597-601 (2011).</li>
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</ol>

我们没有需要披露的内容。

在基因敲入小鼠模型中使用荧光受体来确定特定离子通道的数量和定位具有多项优势。与在所有细胞中普遍表达的蛋白质（如肌动蛋白）不同，离子通道的数量要少得多，且其在不同神经元亚型中的表达存在差异，这使得通过传统的免疫组织化学技术进行准确分析具有挑战性。α4YFP基因产物在野生型（WT）水平表达，受相同的启动子、增强子和转运机制调控12。荧光受体也表现出与野生型离子通道相同的功能和敏感性12。遗憾的是，传统免疫组织化学方法在对固定的小鼠神经组织切片使用多种常见抗体时，常出现抗体渗透不完全的问题17，从而导致结果偏差。而基因敲入模型可在整个组织中提供一致的荧光强度（图6）。尽管某些商业抗体可能存在非特异性结合的问题18, 19，但通过谨慎选择抗体种类与浓度，并设置适当的对照，仍可实现中枢神经系统中烟碱型受体的免疫组织化学定位20, 21。α4YFP荧光的变化反映了受体亚基蛋白表达的改变，可在亚细胞分辨率下对特定神经元亚型进行定量分析。这些结果可结合Western blot技术用于量化蛋白表达水平，以及RT-PCR技术用于检测mRNA转录水...

<table><tbody><tr><td>微型渗透泵</td><td><a href="http://www.alzet.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Alzet</a></td><td>型号 2002</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>S5819</td><td></td></tr><tr><td>(-)-烟碱酒石酸氢盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5260</td><td></td></tr><tr><td>眼药水</td><td>诺华公司</td><td>Tear-Gel</td><td></td></tr><tr><td> Vetbond 黏合剂</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>惠氏动物健康</td><td>0856-4403-01</td><td></td></tr><tr><td>盐酸美托咪啶</td><td>辉瑞制药有限公司</td><td>1950673</td><td></td></tr><tr><td>23G 蝴蝶针</td><td>BD 生物科学</td><td>367253</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>塑料包埋模具</td><td>VWR 国际公司</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>EMD Millipore</td><td>475904</td><td>pH 8.5</td></tr></tbody></table>

慢性尼古丁给药条件下，荧光标记的烟碱型受体在基因敲入小鼠中的共聚焦光谱成像

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

中枢神经系统（CNS）中的配体门控离子通道与多种具有严重医学和社会后果的疾病相关。例如，通过吸烟导致的尼古丁成瘾是全球早逝的主要原因之一（世界卫生组织），其可能机制是大脑中离子通道分布的改变1。在啮齿类动物和人类中，长期暴露于尼古丁会导致脑组织中烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）数量增加1-3。 similarly，谷氨酸能受体 GluN1 或 GluA1 通道的改变也与对其他成瘾性药物（如可卡因、苯丙胺和阿片类药物）的敏感化有关4-6。

因此，绘制并量化特定离子通道的分布和表达模式的能力对于理解成瘾机制至关重要。针对不同脑区药物作用的研究随着放射性配体等技术的出现而得到推进。然而，放射性配体结合技术的空间分辨率较低，无法对特定神经元亚型中的配体门控离子通道进行定量分析。

基因编码的荧光报告分子，例如绿色荧光蛋白（GFP）及其多种颜色变体，已彻底改变了生物学领域7。通过将荧光报告分子与内源性蛋白质进行基因融合，可在活体（in vivo）中对蛋白质进行可视化观察7–10。使用荧光探针标记蛋白质的一个优势在于避免了抗体的使用，而抗体常存在非特异性结合以及难以接近靶蛋白的问题。我们已采用该策略对烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）进行荧光标记，从而可在转染的培养细胞中利用 Förster 共振能量转移（FRET）研究受体的组装过程11。最近，我们进一步采用基因敲入（knock-in）策略构建了表达黄色荧光蛋白标记的 α4 nAChR 亚基（α4YFP）的小鼠模型，使得可通过光谱共聚焦显微镜在中枢神经系统（CNS）神经元中以亚微米分辨率对受体进行离体（ex vivo）精确定量12。该靶向性荧光基因敲入突变被整合至内源基因位点，并由其天然启动子调控，与野生型小鼠中未标记的受体相比，其表达水平和调控特性均保持正常。这一基因敲入策略可进一步拓展应用于其他离子通道的荧光标记，为在中枢神经系统中可视化和定量受体提供了强有力的手段。

本文描述了一种在长期尼古丁暴露后定量特定中枢神经系统神经元中 nAChR 表达变化的方法。我们的方法包括微型渗透泵植入、心脏灌注固定、来自 α4YFP 基因敲入小鼠的荧光标记烟碱受体亚基的成像与分析（图 1）。我们优化了固定技术，以尽量减少固定脑组织中的自发荧光。我们详细介绍了使用光谱共聚焦显微镜结合线性光谱解混算法进行成像的方法，以扣除自发荧光信号，从而准确获取 α4YFP 荧光信号。最后，我们展示了长期尼古丁暴露引起海马内侧穿通路中 α4YFP 受体上调的结果。

我们开发了一种新技术，通过结合基因敲入方法对受体进行荧光蛋白标记以及光谱共聚焦成像等多种手段，定量分析中枢神经系统特定亚型神经元亚细胞区域中烟碱型乙酰胆碱受体的变化，以更深入地理解尼古丁成瘾的机制。

中枢神经系统（CNS）中的配体门控离子通道与多种具有严重医学和社会后果的疾病密切相关。对于……

本实验的总体目标是定量分析慢性尼古丁处理后小鼠脑内荧光标记的烟碱型受体的变化。首先，将装有生理盐水或尼古丁的微型渗透泵植入α4-YFP基因敲入小鼠体内。处理结束后，通过心内灌注固定小鼠，随后对脑组织进行冷冻切片。接下来，使用光谱共聚焦显微镜对带有盖玻片的脑组织进行成像。该实验流程的最后一步是进行线性光谱解混，并分析α4-YFP的表达水平。最终结果表明，光谱共聚焦显微镜结合线性光谱解混技术能够以亚微米分辨率精确量化暴露于慢性尼古丁的小鼠脑神经元中α4-YFP标记的烟碱型乙酰胆碱受体亚单位的上调表达。与现有的抗体或放射性配体标记等方法相比，该技术的主要优势在于，黄色荧光蛋白（Y FPS）可被基因编码并直接连接至受体，从而实现对标签受体的直接且更精确的成像。这有助于对中枢神经系统神经元中受体定位进行高分辨率的亚细胞成像，并避免了探针特异性、染色不均或探针难以进入组织深层抗原位点等潜在问题。演示该操作的是我实验室的研究生 Anthony rda。在通过经颅灌注固定取出脑组织后，用剃刀片切去小脑。在包埋模具底部脑组织下方滴加一小滴封片剂，将脑组织腹侧朝上放入塑料包埋模具中。然后将模具置于干冰中。将脑组织按正确方向冷冻后，用包埋剂填满模具的其余部分。接着，使用冷冻切片机切取30 µm厚的脑切片。用两把细毛刷将切片转移至涂覆好的载玻片上。始终用载玻片盒盖遮盖脑切片，以避免光照。将脑切片存放在含有一个无水硫酸钙干燥石的载玻片盒中。载玻片盒应置于密封的自封袋内，以防止湿气进入，避免在零下20摄氏度储存时发生冻伤。确保载玻片尽量避免接触任何光源，以减少成像前的光漂白现象。在保持载玻片被载片盒盖遮盖的情况下，可剪去移液器吸头尖端，以减少封片时气泡的形成。使用不会抑制荧光蛋白荧光的封片介质，例如 MO Wild 4 88。在加盖玻片前，确保封片液已平衡至室温。为避免产生气泡，应逐个对脑切片进行加盖玻片操作。加盖玻片时请勿使用指甲油，因其会导致荧光淬灭。YFP荧光。使用光谱共聚焦显微镜系统采集脑区图像，该系统即使在自发荧光水平较高的组织中，也能实现YFP荧光的精确量化。为了对光谱共聚焦显微镜获取的样本图像进行线性光谱分离，必须首先获得YFP和组织自发荧光的参考光谱。首先，使用488纳米激光线对转染了可溶性YFP的细胞系进行成像，获得高信噪比的YFP荧光参考光谱。接着，使用相同的激光线，从野生型小鼠脑切片的相应脑区获取自发荧光参考光谱。然后，对α4-YFP小鼠脑区进行光谱共聚焦成像，通过应用线性光谱解混算法，结合来自同一脑区的YFP和野生型小鼠自发荧光的参考光谱，将成像信号分解为YFP信号和自发荧光信号。在图像分析软件（如 Image J）中打开未混合的 alpha4-YFP 图像，然后计算目标区域的平均像素强度。对来自野生型小鼠脑切片同一脑区的光谱共焦图像重复相同的线性光谱分离与分析

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

光谱共焦成像的荧光标记的尼古丁受体敲在慢性尼古丁政府小鼠

本视频展示了尼古丁如何通过激活小鼠腹侧海马体中的烟碱型乙酰胆碱受体，引起轴突上持续的钙信号传导。...

成像腹侧海马轴突在突触共培养中尼古丁诱导的钙信号传导

本文介绍了一种用于研究急性分离脑片神经元中配体门控离子通道功能的有效方法。该方法结合标准膜片钳技术记录神经元，同时使用充满药物的微电极对神经元进行局部药物施加。...

局部给药法研究小鼠脑切片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

我们开发了一种腹侧海马-伏隔核环路的基因嵌合体构建方法 体外...

活体成像观察尼古丁诱导的腹侧海马轴突钙信号传导及神经递质释放

本文介绍了一种通过尼古丁光解技术在小鼠脑切片中研究烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的方法。当该技术与同时进行的膜片钳记录和双光子激光扫描显微镜相结合时，尼古丁光解能够将烟碱型受体功能与细胞形态联系起来，从而加深对胆碱能神经生物学的理解。...

通过光激活型尼古丁的激光闪光光解法探查小鼠脑片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

采用多重原位杂交（ISH）技术，同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合体中两种G蛋白偶联受体和一种转录因子的转录本。该方案可用于生成迷走传入神经元转录谱的精确图谱。...

使用多重技术检测小鼠迷走感觉神经元中G蛋白偶联受体的表达 原位 杂交

本方案描述了利用哺乳动物 Neuro-2a 细胞系表达并定量神经元型烟碱乙酰胆碱受体亚基的方法。通过 pH 敏感性荧光标签结合共聚焦显微镜，可精确评估受体在质膜上的定位情况，以及在 pH 中性细胞内区室中的表达情况，从而促进对 nAChR...

利用哺乳动物细胞中的定量成像技术定位质膜及细胞内神经元型烟碱乙酰胆碱受体

在本方案中，我们介绍了利用红色荧光Ca2+指示剂染料对脑组织切片中GFP标记的神经元进行Ca2+信号成像的最新进展。...

对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

本文介绍了一种用于诱导神经元稳态可塑性的方案改良方法，以研究星形胶质细胞G蛋白偶联受体的可塑性。该方法近期已被用于检测幼年小鼠星形胶质细胞I型代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的变化，也可应用于测量成年小鼠组织中多种星形胶质细胞GPCR的表达上调或下调，可在原位（in situ）和在体（in...

通过调控神经元放电频率诱导星形胶质细胞受体的可塑性

在出生后小脑发育过程中，起源于生发区的未成熟颗粒细胞表现出不同的迁移模式，以到达其最终位置并建立神经元网络。本方案描述了小脑切片的制备方法以及利用共聚焦宏观成像技术研究调控神经元迁移因素的实验方法。...

Ex Vivo 利用共聚焦宏观成像技术观察出生后小脑颗粒细胞迁移

后包埋免疫胶体金法是进行特定分子亚细胞定位高分辨率分析的最有效方法之一。本文介绍了一种定量分析视网膜带状突触处谷氨酸受体的实验方案。...

视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析

学习使用光谱共焦显微成像技术定量分析慢性尼古丁暴露小鼠脑内荧光标记的α4 YFP烟碱型乙酰胆碱受体的变化。该方法可实现亚微米分辨率的高精度受体定位与表达水平检测。

慢性尼古丁给药条件下，荧光标记的烟碱型受体在基因敲入小鼠中的共聚焦光谱成像

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