黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

以下实验的总体目标是测量当两种分子均锚定在相互作用细胞表面时，受体与配体相互作用的动力学。该目标首先通过功能化红细胞实现，这些红细胞作为黏附传感器，携带配体，并制备表达受体的细胞。第二步是组装微移液管腔室，并进行黏附测试以记录黏附事件。

接下来，绘制细胞接触时间与黏附概率的关系曲线，并使用模型进行拟合。为了估算动力学参数，需从数据中获得二维有效结合亲和力和解离速率的估计值。那么，这种检测方法的思路源自何处？

人们研究受体与配体的相互作用。大多数情况下测量的是断裂力，我们也在进行类似的研究，但有一天我们想到，是否可以直接测量二元结果——以零表示无黏附，以一表示有黏附，并通过这些零和一的测量结果推导出动力学参数，从而展示微管频率检测方法。我实验室的研究科学家Dr.Veronica Zana Zina将向您演示该实验。

从全血中分离的红细胞用于生物素标记，以进行黏附频率检测。开始该操作时，离心含有分离红细胞的离心管，将10 µL红细胞沉淀分装至若干个样品瓶中，并向每个样品瓶中加入相应体积的PBS，以制备多种不同浓度的红细胞生物素标记溶液。接着，向每个样品瓶中加入10 µL 0.1 M硼酸盐缓冲液。

然后向每支小瓶中加入计算好量的生物素溶液，并立即涡旋振荡。将每支红细胞小瓶放入50毫升锥形管中，室温下在旋转仪上孵育30分钟。30分钟后，向每支小瓶中加入EAS 45缓冲液，并在2000转/分钟下离心2分钟。用EAS 45缓冲液再重复洗涤两次，共洗涤三次。

最后，向每个小瓶中加入 100 µL EAS 45 缓冲液，并在 4°C 下保存，以在上一步中使红细胞表面的配体功能化。在此步骤中，红细胞在 4°C 下与饱和浓度的链霉亲和素（strep TTR）孵育 30 分钟，随后用 EAS 45 缓冲液在 2000 rpm 转速下洗涤三次，每次 2 分钟。之后，可直接将红细胞与生物素标记的配体孵育，或先将红细胞与相应的生物素标记捕获抗体孵育，再与配体孵育。本视频所示方案采用的是生物素标记捕获抗体。

微量移液器采用熔点较低的硼硅酸盐玻璃毛细管制成。首先使用微量移液器拉制仪将毛细管拉伸成形，然后使用配备微型熔炉的显微操作器将微量移液器尖端切割至所需大小的开口。

所需直径通常根据研究中所用细胞的大小而定，范围为一到五微米。制备细胞腔室时，使用两片按所需尺寸切割的显微镜盖玻片，用气吹清除盖玻片上的灰尘，加入细胞腔室培养基，并从两侧用矿物油密封腔室，以防止培养基蒸发，否则会在实验过程中改变渗透压。

本实验所用的微移液系统由三个子系统组成：用于观察、记录和分析微移液管吸取细胞运动的成像子系统，用于从细胞室中选择细胞的微操作子系统，以及用于将细胞吸入微移液管的压力子系统。成像子系统的中心部件是一台倒置显微镜，配备100倍油镜物镜。物镜图像由电荷耦合器件相机检测，并传送至录像机。

将视频计时器连接到系统以记录时间。用去离子水填充微量移液器后，将其放置在安装于显微镜上的机械驱动装置的支架中。可通过三轴液压显微操作器对微量移液器进行精细定位。

其中一个微移液器支架安装在由计算机编程控制的压电驱动器上。这使得移液器能够精确移动并执行黏附测试循环。压力调节子系统用于控制吸力。

实验过程中，液压管路将微管持器与液体储液器相连。通过精密机械定位装置，可精确调节储液器的高度。在腔室组装完成后，设置微管，将细胞注入腔室以开始检测，用各自的微管吸液捕获相互作用的细胞，并利用PSO电动平移器驱动红细胞与中性粒细胞接触和分离，以精确控制接触面积和接触时间。

当红细胞在细胞分离过程中发生拉长时，视为发生黏附事件；若红细胞未发生拉长，则视为无黏附事件。在Excel电子表格的某一列中，通过记录“1”表示发生黏附，“0”表示未发生黏附，以记录观察到的黏附事件。

使用每种接触时间的至少三组不同细胞对，记录黏附频率随接触时间变化的曲线。为获得均值和标准误作为对照，可通过使用包被相关配体的红细胞，或利用特异性功能阻断剂封闭配体或受体，来记录非特异性结合曲线。通过减去非特异性黏附频率，可计算出在每个接触时间点的特异性黏附频率。

特异性黏附频率随接触时间变化的数据通过一个概率模型进行拟合，该模型描述了单一种类受体与单一种类配体之间的二级正向反应和一级逆向单步相互作用。在此方程中，KA 为二维亲和力，KA 为二维解离速率。

MR 和 ML 分别为受体和配体密度，AC 为接触面积。该曲线拟合包含两个参数，ac、k、a 和 K off，其中 AC 与 KA 合并在一起，统称为有效二维亲和力，其与解离速率的乘积即为有效二维结合速率，AC K on 等于 AC KA 乘以 K off。此处展示的是整合素 alpha L beta two 的测定示例。

中性粒细胞上的位点密度。首先将中性粒细胞与一微克每毫升的E选择素IG孵育，然后加入饱和浓度的PE标记的抗人CD11a单克隆抗体，或以相应的鼠IgG作为对照。孵育30分钟后，将样品洗涤并在流式细胞仪上以标准参数读取结果。

明亮的PE校准微球。图A显示了校准微球的荧光直方图，以及经E选择素IG处理或未处理细胞的直方图。特异性CD11A单克隆抗体染色以实线表示，相应的同型匹配对照抗体染色以虚线表示。

图B展示了密度定量的过程。计算了四个微珠各自平均荧光强度的log 10值。根据图A中的校准峰数值以及该批次微珠对应的每微珠PE分子数进行校准。

对重新选择的侵入细胞绘制了每微珠PE分子数的log10与荧光强度log10之间的线性回归。特异性单克隆抗体对应的log10 fi值为3.99（以蓝色实心圆表示），对照抗体为2.23（以蓝色空心圆表示）。求解X的线性方程后，计算得αLβ2（即中性粒细胞）的总数为9,587。

利用中性粒细胞直径为8.4微米，计算得到表面密度为每平方微米43个结合位点。下一张图显示了在1秒和10秒时特异性结合的连续黏附频率fi。接触时间由涂覆ICAM-1的红细胞与表达整合素αLβ2的人中性粒细胞之间重复黏附测试循环测得。

与此相反，此处显示的是人 IgG 包被的红细胞与表达整合素 αLβ2 的人中性粒细胞之间，在 1 秒和 10 秒接触时间下，通过重复的黏附试验循环测得的非特异性结合的运行黏附频率 fi。最后一幅图展示了 IA-1 与中性粒细胞整合素 αLβ2 结合概率的动力学，每个接触时间下三个细胞对的测量结果取平均值后对接触时间作图，以消除非特异性结合的影响。实验采用了两种不同条件。

一个经抗TFC捕获抗体包被的红细胞，与人IgG孵育，而非ICAM-1 IgG，以及两个未包被捕获抗体的红细胞结合的中性粒细胞。非特异性结合以人IgG对照曲线记录，用于获得特异性黏附概率曲线。采用先前所示的非特异性结合校正方程进行计算。

校正后的特异性黏附概率曲线通过模型拟合，该曲线可得到有效结合亲和力。CKA 等于 1.4 乘以 10 的负 4 次方 微米的 4 次方，koff 等于 0.3 s⁻¹。

观看本视频后，您应能够充分理解当两种分子均锚定在I型相互作用细胞表面时，如何测量受体-配体相互作用动力学。在进行该实验操作时，需注意初始配体密度的优化，以使黏附频率处于中等范围。同时需牢记，血液以及某些特定处理试剂（例如叠氮化钠和二甲基亚砜）可能具有极高危险性。因此，必须采取必要的安全预防措施，例如仔细阅读试剂的材料安全数据表（MSDS），并在操作过程中佩戴手套。