细胞内复性检测
2012年1月24日
在这个协议的方法来衡量热休克后细胞内蛋白质复性的描述。这种方法可以用来研究如分子伴侣和他们的共同因素或化合物能够影响他们的活动foldases。萤火虫荧光素酶的活动是作为记者来衡量伴侣复性活动。
以下实验的总体目标是测量热休克后再折叠的伴侣依赖性细胞内蛋白。使用荧光素酶报告基因，首先用包被荧光素酶报告基因和目标伴侣的质粒转染细胞。然后在实验设计中分离转染的细胞以获得恢复时间点。
第二天，对细胞进行热休克以诱导蛋白质去折叠。允许回收以重新获得细胞内蛋白质折叠，然后测量荧光素酶报告基因活性。结果基于荧光素酶测定测量时间依赖性和伴侣依赖性蛋白质重折叠。
与现有方法（如体外复性测定）相比，该技术的主要优点是可以获得化合物或蛋白质对伴侣活性影响的生理读数。这项技术的影响延伸到神经退行性疾病或癌症等多种疾病的治疗，因为伴侣在这些病理的发展中起着重要作用。首先，在水浴中将培养基、PBS 和胰蛋白酶预热至 37 摄氏度。
用 5 毫升 PBS 洗涤 HEK 2 93 细胞的汇合培养物。然后加入 1 毫升含有 0.025% EDTA 的胰蛋白酶，轻轻旋转板以使胰蛋白酶均匀分布，并在 37 摄氏度下孵育。定期摇动板以验证细胞脱离。
现在，res 将细胞悬浮在 10 mL 完全 DMEM 培养基中，并转移到 50 mL猎鹰管中。然后使用 Beckman 计数器板计数细胞。细胞的 co fluly 约为 60% 至 70%，并孵育 6 至 8 小时。
将 extreme 基因、9 试剂平衡至室温，并将等分试样的无血清培养基平衡至 37 摄氏度。将无血清培养基移液到两个 einor 管中。然后加入 extreme 基因 9 试剂，不接触 einor 管壁，在室温下孵育 5 分钟。
同时，在试管 1 中制备 2D NA 转染混合物，在试管 2 中加入 ran vanilla firefly 和空载体对照。加入 ran vanilla firefly 和分子伴侣。将 DNA 加入转染试剂混合物中，涡旋并在室温下孵育 20 分钟。
继续将此混合物添加到铺板的细胞上并孵育 24 小时。使用胰蛋白酶种子细胞在 6 个孔板中以 60% 至 70% 的 co fluly 收获转染的细胞，并将它们在培养箱中放置过夜。从转染的细胞中吸出培养基。
然后加入 1 毫升热休克缓冲液并孵育 30 分钟。要停止 Denovo 蛋白质合成，请用多联仿条密封盖子，并在 45 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟。现在取出 paraform 并将细胞放回培养箱中，以便在指定的时间点进行回收。
收获细胞并在 PBS 中洗涤一次为了获得高效的细胞裂解快照，将细胞沉淀在液氮中冷冻，加入 200 微升稀释的被动裂解缓冲液。现在一式三份等分。96 孔板每孔 30 μL 细胞裂解液。
为了评估转染效率，从未电击的参比样品开始。为了测量 RAN 荧光素酶活性，在含有 1 毫摩尔 A TP 和 0.2 微摩尔 ezine 反应缓冲液的 gly Gly 缓冲液反应缓冲液中制备新鲜的 0.2 毫摩尔荧光素。将 96 孔板插入光度计并启动程序。
Wallach 1420 工作站.将泵 1 引入含有 0.2 微摩尔 ezine 反应缓冲液的 Falcon 管中。从菜单中选择选项分配器维护，然后勾选泵 1。
选择选项 fill 以编辑板布局。在菜单上选择选项 explore protocol and results。选择协议。
现在选择要读取的孔。返回 Wallach 管理器并单击开始以测量样品排放。在 482 纳米处，继续进行分配器维护并选择空并泵送 1 以将所有残留溶液释放回试管中。
现在将管子移动到装有水的猎鹰上，然后蜱虫，冲洗。选择 empty 继续。然后将泵 1 的试管放入反应缓冲液中，将泵 2 的试管放入 LUCIFERIAN 溶液中。
更改板布局。为泵 1 和泵 2 选择加注。从分配器维护菜单中，选择方案并开始测量 560 纳米的萤火虫荧光素酶反应波长。
在重复结束时，重复该过程 empty， flush， empty。对于泵 1 和泵 2，请在 Wallach 1420 Explorer 中查看结果。每个实验都与一个测定相关联。
编号、用户名开始日期和结束日期将结果导出为 Excel 文件。对于分析，蛋白质复性与恢复时间直接相关。在本实验中，在热休克后的不同时间点评估细胞。
在不存在和存在分子伴侣的情况下。正如预期的那样，在对照和转染分子伴侣的细胞中，重折叠荧光素酶的百分比随着恢复时间的延长而增加。相比之下，无效的数据集在时间和重新折叠之间的相关性方面显示较差的 R 平方值。
遵循这种技术，可以进行其他方法，如体外 TPA 测定，以回答其他问题，如抑制伴侣的酶活性。看完这个视频，您应该对如何测量细胞内蛋白有很好的了解。我们在 hitch shock 之后跟踪。
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概述
该协议描述了一种测量热休克后细胞内蛋白质重折叠的方法，重点关注分子伴侣的作用。萤火虫荧光素酶活性作为评估伴侣重折叠活性的报告器。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 蛋白质折叠
- 分子伴侣
背景
- 了解蛋白质重折叠对细胞功能至关重要。
- 热休克可能导致蛋白质展开，需要重折叠机制。
- 分子伴侣协助重折叠过程。
- 荧光素酶测定提供了重折叠活性的定量测量。
研究目的
- 测量伴侣依赖的细胞内蛋白质重折叠。
- 研究热休克对蛋白质结构的影响。
- 利用荧光素酶作为报告器来评估伴侣活性。
所用方法
- 用含有荧光素酶和伴侣基因的质粒转染细胞。
- 在转染后设立恢复时间点。
- 诱导热休克以促进蛋白质展开。
- 测量荧光素酶活性以评估重折叠效率。
主要结果
- 观察到蛋白质的时间依赖性重折叠。
- 通过荧光素酶测定确认了伴侣活性。
- 结果表明伴侣在蛋白质恢复中的有效性。
- 数据支持分子伴侣在细胞应激反应中的作用。
结论
- 该方法有效测量热休克后的蛋白质重折叠。
- 荧光素酶测定是研究伴侣活性的可靠工具。
- 研究结果有助于理解细胞中的蛋白质稳态。
常见问题
Executive Industry Relevance
This intracellular refolding assay provides a cell-based readout for measuring molecular chaperone activity, enabling target validation in protein homeostasis pathways. By linking chaperone function to luciferase refolding, it supports mechanistic de-risking in oncology and neurodegeneration drug discovery. The assay facilitates compound screening for modulators of chaperone activity, informing lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chaperone-dependent protein refolding as a therapeutic hypothesis in stress response pathways.
- Operational Value: Provides a quantitative, luciferase-based readout for assessing chaperone function in live cells.
- Predictive Value: Supports target confidence by measuring compound effects on intracellular refolding activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds that inhibit or stimulate chaperone-mediated refolding.
- Operational Value: Uses a normalized dual-luciferase system (firefly/renilla) to control for transfection efficiency and variability.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chaperone involvement in cancer chemoresistance and neurodegeneration, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges target validation to functional assessment of chaperone activity in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on compound effects on proteostasis mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modulators of protein folding networks.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about chaperone function in intracellular refolding after heat shock-induced protein unfolding.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence readouts suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides time-dependent and chaperone-dependent refolding metrics for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical models where chaperones influence disease progression in cancer and neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing chaperone modulators across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures target engagement through functional refolding output, reducing mechanistic ambiguity in chaperone modulation.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using defined transfection and recovery protocols for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by identifying compounds with desired effects on proteostasis pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of chaperone-targeted candidates in oncology and CNS therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection and luciferase reporter assays.
- Dependent on luminometer compatibility for dual-wavelength luciferase detection.
- Necessitates standardized heat shock and recovery conditions across experimental batches.
- Adaptation to other chaperone-client pairs may require validation of refolding dependence.
- Limited to soluble, refoldable protein reporters like luciferase; not suitable for aggregation-prone clients without modification.
