Name: 生殖细胞的移植和睾丸组织在小鼠异种移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习精原干细胞移植和睾丸组织异种移植技术，用于研究生精过程和小鼠雄性生殖生物学。该方法通过供体细胞在受体睾丸中定植，实现跨物种的精子发生重建，为干细胞微环境研究提供功能验证平台。

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作者实验室的工作得到了美国农业部/合作州研究、教育与推广服务局/国家研究计划（USDA/CSREES/NRICGP，项目号2007-35203-18213）；美国国立卫生研究院/国家研究中心资源部（NIH/NCRR，项目号2 R01 RR17359-06）；美国国立环境卫生科学研究所（NIH/NIEHS，项目号1 R21 ES014856-01A2）以及阿尔伯塔创新—健康解决方案的支持。

A 部分. 小鼠生殖细胞移植
1. 受体小鼠的准备
<ol>
 <li>受体应对供体睾丸细胞具有免疫耐受性（即与供体基因型匹配或为免疫缺陷型）。</li>
 <li>受体应天然缺乏生精能力（例如 W/ Wv 小鼠），或已清除内源性生殖细胞。可通过照射或使用白消安等化疗药物清除内源性生殖细胞。本方案中，我们描述了使用白消安制备受体小鼠的方法。</li>
 <li>对4至6周龄的受体小鼠通过腹腔注射给予白消安处理。白消安的最佳剂量因小鼠品系而异。在常用的受体品系中，40–50 mg/kg的剂量足以清除内源性生殖细胞（例如裸鼠为44 mg/kg，B6/129 F1受体为50 mg/kg）。</li>
 <li>将白消安粉末溶于DMSO中，然后加入等体积无菌蒸馏水，配制成终浓度为4 mg/ml的溶液。使用前于35–40°C保温，以防止白消安析出。若观察到沉淀，则弃用该溶液。</li>
 <li>白消安处理后，需至少等待一个月方可使用受体小鼠。受体小鼠可在白消安处理后1至3个月内使用。</li>
</ol>
2. 显微注射移液管的制备
<ol>
 <li>选择外径为 1.0 mm、内径为 0.75 mm、长度为 3 英寸的硼硅酸盐玻璃移液管（毛细管）。</li>
 <li>使用 Sigmacote 对玻璃移液管进行硅化处理，用甲醇冲洗移液管并吹干。</li>
 <li>使用拉针仪拉制移液管。不同拉针仪的设置参数各不相同，因此需测试若干组参数。通常，可尝试使用与制备去核移液管相似的设置。</li>
 <li>使用前，在解剖显微镜下折断移液管尖端，使尖端直径约为 50 μm。</li>
</ol>
3. 移植供体细胞的制备
<ol>
 <li>供体小鼠品系的选择取决于所研究的实验问题。若以精子发生过程的定量分析为终点指标，建议使用带有易于识别的遗传标记的供体，例如 Lac-Z（如 Jackson Laboratory 提供的 B6.129S7-Gt(ROSA)26Sor/J）或 GFP（如 Jackson Laboratory 提供的 C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J）。</li>
 <li>准备 7 ml 浓度为 1 mg/ml 的胶原酶 DMEM 溶液、4 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液（含 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA），以及 2 ml 浓度为 7 mg/ml 的脱氧核糖核酸酶（DNase）DMEM 溶液。上述试剂用量适用于消化 2 只供体小鼠的睾丸组织。</li>
 <li>无菌条件下采集睾丸，去除白膜。用精细镊子轻轻铺开曲细精管，以利于后续酶消化处理。</li>
 <li>将曲细精管转移至胶原酶溶液中，在 37 °C 下孵育 5–10 分钟，并频繁振荡。</li>
 <li>用 PBS（不含 Ca2+）洗涤曲细精管两次，每次以 200–300 g 离心 3 分钟，弃上清后重悬沉淀。</li>
 <li>将组织重悬于胰蛋白酶-EDTA 溶液中，持续振荡直至溶液变得黏稠且浑浊。在 37 °C 下密切观察消化过程，通常应在 1–2 分钟内完成。</li>
 <li>加入 DNase 并充分混匀，继续孵育 1–2 分钟。</li>
 <li>加入 3 ml 胎牛血清（FBS）以终止酶反应。</li>
 <li>使用孔径为 40–70 μm 的尼龙滤网过滤细胞悬液，去除细胞团块或组织碎片。</li>
 <li>以 600 g 离心 5 分钟收集细胞，并用少量 DMEM（<100 μl）重悬细胞。</li>
 <li>计数细胞并调整至所需终浓度（通常为 100 × 106 个/ml）。使用前将细胞悬液置于冰上保存。</li>
 <li>每只经白消安处理的小鼠睾丸仅需注入 10–15 μl 细胞悬液。考虑到可能存在的损耗和泄漏，建议每只睾丸准备 30–50 μl 细胞悬液。</li>
</ol>
4. 移植步骤（图1）
<ol>
 <li>按照批准的方案对受体动物进行麻醉。</li>
 <li>将动物置于仰卧位，并对外腹部区域进行外科准备。沿腹中线做约1 cm的切口以暴露腹壁。使用小镊子在白线位置轻轻提起腹壁，避免意外损伤腹腔内器官，随后在腹壁中线处做约0.5 cm的切口，以暴露腹膜腔。</li>
 <li>用一把虹膜镊固定腹壁，用另一把虹膜镊在腹膜腔内寻找附着于附睾和睾丸的脂肪垫。轻柔地牵拉脂肪垫，直至睾丸被完全翻出，且睾丸动脉和附睾清晰可见。每次仅操作一侧睾丸。</li>
 <li>在脂肪垫/睾丸下方放置由经高压灭菌的索引卡制成的薄层无菌铺巾，以提高视觉辨识度（可选）。该铺巾还可用于吸收液体。</li>
 <li>向细胞悬液中加入一滴台盼蓝染料，小心地将细胞悬液装入连接1 ml注射器的聚乙烯导管中。将拉制好的移液管插入导管，并通过轻压注射器活塞，将细胞悬液缓慢推入移液管中。</li>
 <li>识别输出小管（连接睾丸与附睾的管道），并轻柔地清除其周围的脂肪组织。操作时需格外小心，因这些管道及其周围膜组织呈半透明状。</li>
 <li>小心地将移液管插入输出小管束中的一根管道，并向睾丸方向轻柔推进数毫米。</li>
 <li>在保持注射移液管不动的同时，操作注射器，轻柔下压活塞，确保悬液流入睾丸网并开始填充曲细精管。</li>
 <li>细胞悬液的注射速度和流动通过拇指施加的压力进行调节。避免压力突然增加，并密切观察悬液在管道内的流动情况。</li>
 <li>当几乎所有表面管道均已填充，且睾丸尚未出现缺血迹象时，停止注射。</li>
 <li>将睾丸放回腹膜腔内。对对侧睾丸重复上述操作。使用6-0丝线缝合腹壁，并用金属伤口夹闭合皮肤。将小鼠置于加热垫上监测，直至完全恢复。</li>
</ol>
5. 受体睾丸的分析
<ol>
 <li>移植后需等待 2-4 个月再进行分析。</li>
 <li>根据动物护理与使用指南处死受体小鼠，并将睾丸和附睾收集至 PBS 中。若使用了 Lac-Z 转基因供体品系，附睾可作为阳性染色对照，因其具有内源性 β-半乳糖苷酶活性。</li>
 <li>为通过 Lac-Z 染色检测供体细胞，将睾丸在 4 °C 下用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 固定 1-2 小时，在 lacZ 漂洗缓冲液中室温漂洗 3 次，每次 30 分钟。</li>
 <li>在 lacZ 染色液中 37 °C 过夜孵育。睾丸可整体染色，也可在分散曲细精管后进行染色。</li>
 <li>用 10% 中性缓冲福尔马林固定并保存。如需切片，使用中性红快红作为复染剂。</li>
</ol>
第二部分 B. 小鼠异位异种移植
（引自 Dobrinski 和 Rathi 200815，以及 Rodriguez-Sosa 等. 201116）。
1. 供体组织的采集
<ol>
 <li>从供体雄性动物通过阉割或活检获取睾丸组织。</li>
 <li>将睾丸组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，或将活检组织置于培养基中，保持无菌条件。</li>
 <li>将采集的组织置于冰上，并运送至实验室。</li>
</ol>
2. 供体组织的制备
<ol>
 <li>在组织培养罩内操作，以保持无菌环境。</li>
 <li>将每个睾丸用含抗生素的冰冻 PBS 清洗两到三次，然后转移至含有 PBS 的培养皿中。对于活检组织，用含抗生素的冰冻培养基清洗睾丸组织碎片两到三次，每次以 150g 离心 2 分钟，并重悬于新鲜的冰冻培养基中。</li>
 <li>对于完整的睾丸，沿表面做切口以去除鞘膜（tunica vaginalis），挤出睾丸组织。去除睾丸上所有附属结构（精索、附睾、结缔组织）。用冷 PBS 清洗睾丸一次，然后转移至含有 PBS 的培养皿中。</li>
 <li>使用解剖刀片和剪刀小心去除睾丸的白膜（tunica albuginea）。若睾丸非常小，可用小型镊子夹住白膜一端，另一端做一小切口，通过挤压将睾丸组织从白膜中挤出，从而去除白膜。</li>
 <li>根据睾丸大小，可直接用弯头镊和解剖刀片在冰冻培养基中将整个睾丸组织切成约 1–2 mm3 的小块；或先从睾丸上取下较大组织块，再进一步切割为较小碎片。所有操作均应在无菌条件下，在小型培养皿（60 × 15 mm）中进行。</li>
 <li>将制备好的组织碎片转移至置于冰上的小培养皿中的冰冻培养基内，直至进行移植。</li>
</ol>
3. 受体小鼠去势手术
<ol>
 <li>按上述方法麻醉小鼠，并通过剪毛（裸鼠无需剪毛）、用70%乙醇和碘伏溶液擦拭，准备无菌手术区域。</li>
 <li>在腹侧正中做一道0.5–1 cm的皮肤切口，暴露腹壁。</li>
 <li>仔细暴露睾丸、睾丸动脉和附睾，操作方法见A部分4.2–4.3节所述。</li>
 <li>用钝性分离法将附睾尾部从提睾肌中分离。</li>
 <li>用丝线结扎睾丸动脉、输精管及其伴随血管，然后在睾丸与结扎线之间切断已结扎的结构。</li>
 <li>对另一侧睾丸重复上述操作。</li>
 <li>用一到两针外科缝线缝合腹壁。</li>
 <li>用一到两个米歇尔夹（Michel clips）闭合皮肤切口。</li>
</ol>
4. 异位移植
<ol>
 <li>将小鼠置于仰卧位，并按上述方法在其背部制备无菌手术区域。</li>
 <li>根据需要植入的移植物数量（通常为每只小鼠4-8个），在小鼠背部中线两侧分别做长约0.5 cm的皮肤切口。</li>
 <li>用镊子夹住皮肤切口边缘，使用剪刀分离结缔组织，以创建皮下腔隙。</li>
 <li>用虹膜镊将一块睾丸组织深入放置至皮下腔隙内，同时用另一把虹膜镊固定皮肤切口边缘。</li>
 <li>用一个Michel夹闭合皮肤切口，并将小鼠置于加热垫上，直至其开始从麻醉状态恢复。</li>
 <li>将小鼠转移至带有额外保温垫和覆盖物的笼中，持续监测直至小鼠完全恢复。</li>
</ol>
5. 用于分析和精子采集的睾丸异种移植组织的收集
<ol>
 <li>根据动物护理与使用指南实施宿主小鼠的安乐死，沿背部从尾部至颈部做正中皮肤切口并翻开皮肤。此操作可暴露移植物，移植物可能位于皮下组织或附着于皮肤上。</li>
 <li>使用一对镊子和一把剪刀小心取出移植物。</li>
 <li>记录回收移植物的数量、单个移植物的大小和重量。</li>
 <li>从小鼠腹腔内取出精囊，并记录其重量，作为移植物组织产生睾酮的指标。</li>
 <li>用于组织学分析
 <ol class="lalpha">
 <li>将异种移植物悬浮于含有Bouin's溶液（或其他固定液）的样品管中，固定液体积约为移植物体积的10倍，并正确标记管子。</li>
 <li>在冰箱中孵育过夜，随后在70%乙醇中至少清洗3次，建议每次间隔24小时。</li>
 <li>继续进行后续处理，并包埋于石蜡中。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>用于精子采集
 <ol class="lalpha">
 <li>通过在300×g离心1分钟将异种移植物沉淀，弃上清，再用含抗生素的培养基重悬。</li>
 <li>将移植物切成小块，在含有3–5 mL培养基的组织培养皿中用镊子小心剪碎。</li>
 <li>将剪碎的组织通过40 μm细胞滤网过滤。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
C 部分. 代表性结果
1. 生殖细胞移植
如果移植的供体细胞悬液中含有携带遗传标记（如LacZ转基因）的精原干细胞，则移植后2-3个月，可通过X-gal染色在受体睾丸中观察到生精小管内明显的蓝色区段，从而可视化供体精原干细胞的定植情况3（图2A）。一个发育良好的克隆应表现为长条状深蓝色区段，完全充满且具有两层或更多层靠近中央的蓝色细胞，而在两端则呈现较弱的染色区域，可见单个、成对或小簇状的蓝色细胞网络3（图2B）。深蓝色生精小管区域的横切面应显示出结构良好、排列有序的精子发生过程，其中包含处于不同分化阶段的蓝色生殖细胞（图2C）。
2. 睾丸组织异种移植
移植后睾丸组织的存活率与供体的发育阶段呈负相关；使用新生雄性个体的组织可获得最佳效果，而成年个体的组织则极易发生退化和死亡17-21。通常情况下，随着供体组织经历第一次精子发生过程中的减数分裂，异种移植的成功率会逐渐降低。不成熟供体组织发育至完全精子发生所需的时间具有物种特异性，且通常比体内睾丸发育时间略短。完成完整精子发生的生精小管数量因物种而异。在绵羊、山羊和猪中，该比例超过50%；而在牛和猫中则低于15%14（图3）。
<img alt="啮齿类动物生殖解剖结构；解剖图像；输出小管结构；睾丸、附睾的识别。" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 生殖细胞移植操作流程。 麻醉后将受体动物置于仰卧位，沿腹中线做长约 0.4 英寸的切口（A）。牵拉附着于附睾和睾丸的脂肪垫以暴露睾丸，并在脂肪垫/睾丸下方放置一层薄的无菌敷料以利于清晰识别（B）。调整睾丸与附睾的位置，使埋藏在脂肪垫内的输出小管清晰可见（C, D, E）。辨认输出小管，并轻柔地去除导管周围的脂肪组织。可在导管下方放置一张彩色纸片或塑料片以增强视觉对比（G）。根据导管大小折断或研磨移液枪头尖端，并将细胞悬液吸入移液枪头中（H）。将移液枪头小心插入输出小管束中的一根小管，轻柔地向睾丸方向推进数毫米（H 图中的箭头指示移液枪注射与插入的方向）。图中显示了成功将细胞注入曲细精管的睾丸（I）。Ts：睾丸；Ep：附睾。
<img alt="真菌生长、植物根部共生、细胞相互作用的显微镜图像；实验结果。" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 生殖细胞移植的代表性结果 A) 经 X-gal 染色的注射睾丸。曲细精管中的蓝色片段代表转基因供体精原干细胞（SSC）（LacZ 转基因）形成的定植克隆。B) 移植后 3 个月的 SSC 克隆高倍放大图像。中心深蓝色区域代表完整的精子发生过程，两端浅蓝色区域代表克隆正在向外延伸生长。C) 深蓝色曲细精管的组织切片（移植后 3 个月）显示精子发生结构排列良好。B 和 C 中的比例尺分别为 200 μm 和 30 μm。（图改编自 Annu Rev Cell Dev Biol. 2008;24:263-86 和 Biol Reprod. 1999 Jun;60(6):1429-36）。
<img alt="小鼠生殖过程示意图；组织学、精子细胞、胚胎发育阶段。" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3. 大型动物未成熟睾丸组织异位异种移植至免疫缺陷小鼠体内。 将未成熟供体睾丸组织碎片（约 1 mm3）移植至免疫缺陷小鼠背部皮肤下（A），组织可存活并对小鼠促性腺激素产生反应。结果，睾丸组织完成全部发育过程，包括形成具有受精能力的精子（B）。一旦获取睾丸异种移植物（C），即可用于分析，或获取精子（D）用于胞质内单精子注射（ICSI）（E）及胚胎生产（F）。标尺：(B, E 和 F) 50 μm 或 (D) 10 μm。（改编自 Rodriguez-Sosa 和 Dobrinksi 200914）。

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<li>Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+survival+of+adult+human+testicular+tissue+as+ectopic+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft.</a> Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).</li>
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<li>Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD9+is+a+surface+marker+on+mouse+and+rat+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).</li>
<li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+niche+microenvironment+on+spermatogonial+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).</li>
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<li>Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV5+is+required+for+continuous+spermatogenesis+in+adult+mice+and+may+mediate+blood+testes+barrier+function+and+testicular+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).</li>
<li>Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+transplantation+of+porcine+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Preservation and transplantation of porcine testis tissue.</a> Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).</li>
<li>Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cold+storage+and+cryopreservation+of+immature+non-human+primate+testicular+tissue+on+spermatogonial+stem+cell+potential+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts.</a> Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).</li>
<li>Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+testicular+tissue+from+infant+monkeys+after+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice.</a> Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).</li>
<li>Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+maturation+of+primate+testis+by+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice.</a> Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

1. 生殖细胞移植
生殖细胞移植是明确证实细胞群体中存在精原干细胞（SSCs）的唯一功能性检测方法。只有精原干细胞能够归巢至基膜上的精原干细胞微环境，并定植其中，启动来源于供体的精子发生过程。生殖细胞移植使得以前所未有的方式研究和操控精原干细胞成为可能。该技术已被用于通过遗传修饰精原干细胞产生转基因动物4；阐明精原干细胞定植的模式、效率及动力学特征3,8；研究调控精原干细胞自我更新与分化过程的信号通路9,10；鉴定精原干细胞表面标志物以实现其识别22,23；以及研究精原干细胞所处的微环境6,7,24。此外，通过相互移植实验，可用于探究不育表型究竟是源于支持细胞缺陷还是生殖细胞自身缺陷25,26。
为了使移植高效进行，受体动物的选择和处理至关重要。受体应与供体基因型匹配，或经过免疫抑制处理。受体还应缺乏内源性生精能力：这可能是由于基因突变所致，例如 W/ Wv 小...

<table><tbody><tr><td>胶原酶（IV型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网细胞滤器</td><td>BD Biosciences</td><td>352340 (40&amp;#181;m) 352350 (70&amp;#181;m)</td><td></td></tr><tr><td>白消安</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2635</td><td></td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic 聚乙烯导管（PE100）</td><td>BD Biosciences</td><td>CA-63018-725</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon 6-0 丝线缝合线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>伤口夹</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3667</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18896</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠生殖细胞移植与睾丸组织异种移植

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

生殖细胞移植技术由宾夕法尼亚大学的Ralph Brinster博士及其同事于1994年开发1,2。这些开创性研究表明，将来自可育供体小鼠的生殖细胞显微注射到不育受体小鼠的曲细精管中，可在受体动物体内实现供体来源的精子发生和精子生成2。利用携带细菌β-半乳糖苷酶基因的雄性供体，可识别出供体来源的精子发生过程，并证实受体动物能将供体单倍型传递给后代1。令人惊讶的是，移植到曲细精管管腔内的生殖细胞能够从管腔迁移至基底膜，而精原细胞通常位于该位置3。目前普遍认为，只有精原干细胞（SSCs）能够定植于干细胞微环境，并在受体睾丸中重新建立精子发生过程。因此，生殖细胞移植为研究睾丸中干细胞微环境以及鉴定潜在的精原干细胞提供了一种功能性方法。迄今为止，生殖细胞移植已被用于阐明干细胞生物学的基本机制，通过移植前对生殖细胞进行遗传操作来制备转基因动物4,5，研究支持细胞（Sertoli细胞）与生殖细胞之间的相互作用6,7、精原干细胞的归巢与定植过程3,8，以及精原干细胞的自我更新与分化机制9,10。
生殖细胞移植在大型物种中也是可行的11。在这些物种中，该技术的主要应用包括生育力保存、优良遗传性状在动物群体中的传播，以及转基因动物的制备，因为利用该技术研究精子发生和精原干细胞（SSC）生物学相比啮齿类动物在操作上更为复杂且成本更高。将大型物种的生殖细胞移植到小鼠的曲细精管中，可实现供体细胞的定植和精原细胞的扩增，但无法完成完全分化，这可能是由于系统发育上相距较远的物种间，受体体细胞环境与供体生殖细胞之间存在不相容性12。另一种替代方法是将大型物种的生殖细胞与其周围的体细胞微环境一同移植。我们于2002年首次报道，将未成熟雄性个体的微小睾丸组织片段移植至免疫缺陷小鼠的背部皮肤下，这些组织能够存活并完成整个发育过程，产生成熟且具备受精能力的精子13。自此以后，睾丸组织异种移植已在多种物种中取得成功，并成为在小鼠体内研究大型动物睾丸发育和精子发生过程的一种重要替代手段14。

本文描述了生殖细胞移植和睾丸组织异种移植的实验方案。生殖细胞移植可在受体睾丸中产生来源于供体的精子发生，是鉴定精原干细胞（SSCs）的一种功能性重建实验方法。睾丸组织异种移植可在受体小鼠体内重现多种供体物种的睾丸发育及精子发生过程。

生殖细胞移植技术由宾夕法尼亚大学的Ralph Brinster博士及其同事于1994年建立1,2。这些开创性研究……

本视频展示了两种相关技术：第一种是精原干细胞移植（SSC移植），第二种是这些组织的异种移植（xenograft）。SSC移植用于在受体的睾丸中利用供体的精原干细胞（SSCs）诱导产生精子发生过程。通过制备含有可识别转基因标记（如GFP或LAC Z）的供体睾丸或培养细胞中的精原干细胞（SSCs）悬液来实现。接着，将受体雄性动物的睾丸暴露于体外。该受体动物事先经过处理，使其睾丸中缺乏生殖细胞。然后分离受体雄性动物的输精管末端膨大部分（EENT ducks），并注入与taan混合的供体细胞。蓝色染料。最终可见供体来源的生殖细胞定植于受体的生精上皮。在此示例中，通过Xal染色显示受体睾丸中表达lacZ的供体细胞定植情况，于移植后两到三个月可明显观察到生精小管中的定植现象。本视频中将演示的第二种技术涉及睾丸组织异种移植。睾丸组织移植技术通过将未成熟供体的睾丸片段移植到功能缺陷的小鼠宿主体内，从而实现供体物种的睾丸发育和精子发生过程。该过程首先从大型供体物种（例如本示例中所示的猪）的睾丸中制备适合移植的组织片段。下一步是将免疫缺陷型成年受体小鼠去势，然后将供体睾丸组织片段移植到受体小鼠的背部皮肤下。受体小鼠作为体内培养环境，可支持睾丸异种移植物在六至七个月内完全发育，具体时间取决于供体物种。精原干细胞移植技术最初由宾夕法尼亚大学的 Ralph Brinster 及其同事开发，并于 1994 年首次报道。此后，该技术已得到广泛应用，目前已成为生殖系干细胞生物学领域的金标准生物测定方法，有助于回答该领域的关键科学问题，例如阐明调控干细胞自我更新的信号通路。我们最初提出异种移植的设想，是源于观察到将非啮齿类供体（例如猪、灵长类动物或人类）分离的精原干细胞移植至小鼠睾丸时，无法实现完全由供体细胞介导的精子发生过程。我们发现，通过移植微小的睾丸组织片段而非分离的生殖细胞，以保留睾丸微环境，可克服这一限制，从而在系统发育关系较远的物种中，于小鼠宿主体内实现完整的供体来源精子发生。这是我们于2002年首次报道的。生殖细胞移植实验方案需要制备待注射的细胞悬液。有关制备细节，请参阅书面稿件。开始移植手术时，先对受体小鼠进行麻醉，并通过确认其无疼痛反射来确保麻醉深度足够。然后将动物置于仰卧位，并对外腹部区域进行外科准备。作一个约一厘米长的正中切口，以暴露腹壁。用镊子夹住白线位置提起腹壁，以避免意外损伤腹腔器官。随后在精细镊子的辅助下做约半厘米的切口，以暴露腹膜腔。通过牵拉附着于睾丸和附睾的脂肪垫将睾丸引出体外，并将这些结构置于无菌索引卡上。现在将台盼蓝染料加入细胞悬液中。然后将细胞悬液装入连接于1毫升注射器的聚乙烯管路中，并将拉制好的移液管接入管路。通过向注射器施加轻微压力，将细胞悬液缓慢推入移液管中。现在我们将进行 SCC 移植中最关键的步骤，即 ENT 导管的识别与插管。使用解剖显微镜

germ-cell-transplantation-and-testis-tissue-xenografting-in-mice

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生殖细胞的移植和睾丸组织在小鼠异种移植

本文描述了一种将荧光素酶标记的人恶性外周神经鞘瘤细胞稳定移植到免疫缺陷小鼠坐骨神经中的方法。同时讨论了利用生物发光成像技术验证肿瘤移植物成功建立的标准，以及将动物随机分入研究组别的依据。...

人源荧光素酶标记的恶性周围神经鞘瘤细胞原位异种移植 体内 候选治疗药物的测试

本文介绍了一种从成年小鼠中分离并维持精原干细胞及其前体细胞系的简单方法。该方法利用来源于成年小鼠睾丸体细胞区室的饲养层细胞。此技术适用于常见的小鼠品系，包括转基因、基因敲除和基因敲入小鼠。...

长期成年小鼠精原干细胞系建立的培养中精原干细胞与前体细胞（SSCs）的连续富集

由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的成肌祖细胞是治疗肌肉营养不良症的细胞治疗策略中颇具前景的候选细胞。本方案描述了在急性与慢性肌肉再生小鼠模型中，评估iPSC来源的血管壁干细胞（一类肌肉祖细胞）移植后植入与分化能力所需的移植操作及功能检测方法。...

诱导多能干细胞来源的类血管壁细胞样肌源性前体细胞在小鼠肌肉再生模型中的移植

免疫缺陷小鼠中的人类肿瘤异种移植模型是研究癌症生物学的有力工具。本文描述了从人肝细胞癌细胞或肿瘤组织片段建立皮下和肝内异种移植模型的具体实验方案。通过部分肝切除术诱导受体小鼠肝脏再生，可作为促进肝内移植瘤定植的有效策略。...

在免疫缺陷小鼠中建立人肝细胞癌皮下及肝内异种移植模型

建立原发性侵袭性原位膀胱癌异种移植模型的传统技术需要开腹手术并游离膀胱。该操作对小鼠造成显著的病痛，技术难度高且耗时。因此，我们开发了一种利用超声引导的高精度经皮穿刺方法。...

微创建立小鼠原位膀胱异种移植模型

本论文详细描述了一种利用循环肿瘤细胞（CTCs）建立前列腺癌患者来源的异种移植模型（PDXs）的方法。通过循环肿瘤细胞建立PDX模型，为研究前列腺癌提供了一种替代性实验模型；前列腺癌是男性中最常被诊断出的肿瘤，也是男性因癌症死亡的常见原因。...

从循环肿瘤细胞建立前列腺癌患者来源的异种移植模型

本文介绍了一种在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中诱导并评估疾病发生的方法。xenoGVHD...

异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字PCR定量小鼠组织中的人源T细胞

复杂的人类疾病在传统的实验室模型系统中可能难以模拟。本文介绍了一种外科手术方法，通过将人类骨骼肌活检组织移植到免疫缺陷小鼠体内来模拟人类肌肉疾病。...

在免疫缺陷小鼠中进行人骨骼肌异种移植

本文描述了四种利用新生小鼠睾丸原代细胞生成睾丸类器官的方法，即细胞外基质（ECM）依赖性和非依赖性的二维（2D）及三维（3D）培养环境。这些技术具有多种研究应用价值，尤其适用于体外研究睾丸的发育过程和生理功能。...

基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

本方案描述了如何将人皮肤移植到非肥胖型糖尿病（NOD）-scid...

异种移植皮肤模型用于调控人类免疫反应 体内

本文介绍了一种在小鼠中进行圆头精子细胞注射（ROSI）的方法，该技术具有潜在的临床应用价值，并可用于研究胚胎发育背后的机制。...

小鼠圆头精子细胞注射

学习精原干细胞移植和睾丸组织异种移植技术，用于研究生精过程和小鼠雄性生殖生物学。该方法通过供体细胞在受体睾丸中定植，实现跨物种的精子发生重建，为干细胞微环境研究提供功能验证平台。

小鼠生殖细胞移植与睾丸组织异种移植

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