利用光声流式技术检测与分离循环黑色素瘤细胞

以下实验的目的是在继发性肿瘤形成之前检测癌症的存在。首先获取并分离四期黑色素瘤患者的血液样本，以实现这一目标。第二步，将血液引入光声流式检测室，从而实现对黑色素瘤细胞的检测与分离。

接下来，对捕获的细胞进行成像，以确认检测到的黑色素瘤的存在。结果显示，该系统能够基于光声波形和细胞成像技术，准确且快速地检测并分离黑色素瘤细胞。与现有的循环黑色素瘤细胞检测方法（如逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）、生物磁性细胞分选及其他方法）相比，本技术的主要优势在于无需标记，且可在不改变细胞表面特性或将其固定于基质的情况下实现循环黑色素瘤细胞的捕获。

为进行转移性癌症检测而准备样本时，首先从四期癌症患者体内抽取约10毫升全血，分装至两个5毫升真空采血管中，以3000转/分钟离心10分钟。离心后，血液样本将分为三层，底层为红细胞。

中间层，也称为血沉棕黄层，含有白细胞和黑色素瘤细胞，上层含有血浆和血小板。尽可能多地移除血浆，但不要扰动血沉棕黄层。向2毫升离心管中加入250微升的Hisopaque 1077溶液。

使用一支9英寸的巴斯德吸管，吸取剩余的血浆、全部的白细胞层以及上层的红细胞，注意收集量应少于500微升。将溶液转移至先前准备好的离心管中。

血液会再次分层，但此次红细胞将被hisp分离，从而便于提取血沉棕黄层。使用9英寸Pesa移液管分离全部血沉棕黄层，并将其置于2毫升尖底离心管中。然后将其悬浮于1.5毫升含2%体积比的PBS中，置于20℃。

构建流室时，首先取一个长度为8毫米、外径为20毫米、内径为17毫米的亚克力圆筒。接着，在圆筒侧壁相互成90度角的位置上，钻三个直径为5毫米的孔。然后，截取三段聚合物管，插入已钻好的孔中。

将封口膜拉伸覆盖在亚克力环的底部，以形成防水密封。封口膜与亚克力环将构成一个浅碗状结构，用于容纳形成流动室的丙烯酰胺溶液。将一根直径为1.6毫米的金属丝穿过相对放置的两段管子，悬挂在环内，确保仅金属丝本身从环中央穿过并延伸至第三段管子中可见。

插入一根直径为1.6毫米的金属丝，并将导管置于距离悬垂金属丝1毫米的位置。这些金属丝可防止丙烯酰胺进入导管。准备5毫升丙烯酰胺溶液。

然后迅速将混合物倒入丙烯酸环中，直至装满。数秒钟后，溶液将形成凝胶。制作流动室模具时，小心地抽出导线，注意不要扰动丙烯酰胺凝胶，从而留下一个圆柱形的流动通道，以及用于放置聚焦于流动通道的光纤的位置。

现在可使用超声耦合凝胶对流室进行声学操作。将聚偏氟乙烯压电声学换能器耦合至流道正上方的流室位置。使用BNC电缆或bayonet neo cons电缆，将换能器连接至宽带接收器的输入端。

将滤波器的输出端连接到示波器以触发示波器。在换能器附近放置一个光电二极管，并使用BNC电缆将其接入示波器。抽出流动室的细管，直至形成一个小气泡袋，然后将其与换能器耦合。

然后插入光纤，并用水填充口袋以减少界面信号并增加照射到流路的激光光量。由于光纤的数值孔径以及其与流路之间的距离较短，激光在任意时刻仅会照射一个样本液段，从而确保位于激光前方的样本即为产生光声信号的同一份样本。

接下来，将一个T型连接器连接到流室的一端，再将两个注射泵连接到该连接器的另外两个分支。其中一个注射器内含有空气，另一个则装有先前制备好的细胞悬液。随后启动两个注射泵。

当两种可接受的流体到达T型接头时，它们将被分割成均一的液段，并流经传感器。使用纳秒脉冲激光照射流动的样品，以在黑色素瘤细胞中产生光声波。由于黑色素是一种宽谱光学吸收体，因此可使用任何可见光波长的激光。

当液滴位于传感器上方时，示波器上出现的信号表明该液滴含有黑色素瘤细胞。在将液滴放入收集管之前，需通过系统对其进行追踪。为进行免疫细胞化学样品制备，将玻片放入细胞沉降漏斗中，并将其装入细胞离心机进行离心，以帮助捕获的细胞黏附于玻片表面。

向每个流式管中加入100微升含1% BSA的PBS溶液，然后以600 RPM离心3分钟。离心后，向CyTOF流式管中加入细胞样本，再以600 RPM离心3分钟。

使用基于乙醇的固定剂喷洒载玻片。然后将载玻片在 PBS 中洗涤两次，每次 10 分钟，以阻断非特异性结合。将每张载玻片与 10 微升山羊血清和 90 微升 PBS 的混合液在室温下孵育 1 小时。

孵育后，倾去切片上的液体，加入一抗溶液。每张切片应含有1%兔血清、1%小鼠CD45和10%山羊血清的PBS溶液，在室温下的湿盒中孵育一小时。随后，将切片在PBS中洗涤，每次10分钟，共洗涤三次。

然后将切片置于适当的荧光标记二抗中，室温避光孵育一小时，倾去抗体溶液。随后用 PBS 洗涤切片，每次五分钟，共洗涤三次；为染色细胞核，将细胞与浓度为 0.1 微克/毫升的 DPI 孵育一分钟。然后倾去溶液，并用 PBS 洗涤切片。

最后，使用基于树脂的封片介质，在细胞样品上覆盖盖玻片，再用透明指甲油密封盖玻片边缘，并用荧光显微镜进行成像。此处左侧显示了白细胞和黑色素瘤细胞产生的光声波形。由于白细胞本身无色素，不产生光声波信号，因此在右侧表现为一条平坦的电子噪声基线。

然而，有色素的黑色素瘤细胞会产生强烈的光声波。经过免疫细胞化学染色后，培养的黑色素瘤细胞在DPI图像中呈现蓝色斑点状信号，其中一个标记细胞以绿色叠加显示，同时使用CD45作为白细胞标志物进行染色。该图像显示了在发育完成后，多个白细胞中的黑色素瘤细胞。

我们的技术将为癌症检测领域的研究人员探索转移现象铺平道路，从而改善癌症检测，并最终治愈其致命扩散。