监测与固态纳米孔蛋白质吸附
2011年12月2日
一个方法是使用固态纳米孔监测到无机表面蛋白质的非特异性吸附描述。该方法采用电阻脉冲的原则，允许实时和单分子水平探讨吸附。因为单一的蛋白质吸附过程是远离平衡，我们建议平行合成纳米孔阵列的就业，使表观一级反应速率常数蛋白质吸附定量测定以及和Langmuir吸附常数。
该程序的总体目标是在人工膜中创建纳米孔，用于蛋白质吸收研究。这是通过使用茎在氮化物膜上钻纳米孔来实现的。然后将纳米孔加载到腔室中，并用离子溶液润湿。
因此，流体会形成从纳米孔的一侧到另一侧的桥梁，使纳米孔为实验做好准备。在其两端施加电压，可以观察到离子电流通过它。最后一步是将蛋白质添加到 Nanopore 腔室中。
最终，观察穿过纳米孔的离子电流中的长寿命阻塞，揭示了蛋白质对纳米孔侧面的吸收。大家好，我是 Dave Wicki。我是雪城大学物理系的研究生。
虽然这种方法可以深入了解蛋白质在无机表面上的吸收。它还可以应用于其他系统，例如蛋白质、核酸相互作用、用于光谱学的单分子以及有限空间中的分子研究。首先将阀杆调高到加速电压。
接下来，将 SPI 氮化硅窗口网格加载到 TEM 样品架中。用氧气等离子体清洁网格 30 秒以清除碎屑。在加载样品之前，将样品架加载到 TEM 中，并让真空抽空。
使用明场 TEM 模式，找到氮化物窗口，即原始 rogram 上的一个明亮方块。确保 TEM 正确对齐。然后对齐并聚焦样本。
现在将系统置于 STEM 模式，并使用热断探测器对样品进行成像并检查其对齐情况。将光栅（如果存在）设置为较低的值，以允许更高的电子电流可用于钻孔。根据电子探针的直径选择合适的光斑尺寸以钻 Nanopore。
将杆对齐。使用 BROGRAM 以所需的放大倍率完美地聚焦在氮化物膜上。如果样品有任何移动，请空白、电子束并等待样品稳定。
这可能需要长达一个小时。稳定后，将电子探针放在样品上并开始钻纳米孔。使用 TM 钻纳米孔需要患者不忠。
这是一个氮化物在电子束探针下逐渐消散的过程。将电子探针直接放在钻孔部位上方并确认纳米孔已完全钻孔，这一点很重要。从 TEM 中取出样品之前，使用热关闭检测器扫描定期检查样品。
如果样品略微漂移，请调整电子探针的位置以位于纳米孔上方。聚焦 ROI 图后，闪闪发光的氮化物薄膜将消失。当纳米孔形成时，roky gram 失焦时，磨损的指甲边缘是可见的。
用热关闭对纳米孔进行成像，并制作图像的强度分布。纳米孔的直径可以通过轮廓最暗的区域来估计。如果需要，可以使用电子探针来扩大纳米孔。
当它具有所需的直径时。使用标准设置的光栅切换到 TEM 模式。使用明场 TEM 确认孔径。
首先准备 degas di saline。将溶液在真空下放入浴中超声处理 20 分钟小心地将含有氮化硅芯片的脆弱纳米孔放入 10 毫升 Pyrex 喙中。然后在通风橱中，将烧杯放在热板上。
用食人鱼溶液非常小心地清洁 Nanopore 芯片。首先，使用玻璃移液管向容器中加入 3 毫升硫酸。其次，小心地向硫酸中加入 1 毫升高浓度的过氧化氢。
请采取一切预防措施。让纳米孔芯片浸泡 10 分钟。然后使用玻璃移液管从烧杯中取出食人鱼溶液并妥善处理。
接下来，用脱气去离子水填充烧杯。使用干净的玻璃移液器，清空烧杯中的水并重复至少五次洗涤。用干净的镊子去除纳米孔芯片，轻吸干燥。
干燥后，立即将纳米孔芯片密封到腔室中。芯片可以通过 O 形圈或硅酮密封剂固定在腔室中。用氯化钾溶液填充腔室。
将银、氯化银电极连接到腔室。电极可以通过将银丝浸泡在漂白剂中过夜来制成。在电极上施加跨膜电位，并使用膜片钳放大器监测电流响应。
在电压钳模式下，根据测量值构建电流电压曲线。曲线应该是高度线性的。当使用一摩尔氯化钾时，纳米孔的电导应与其直径相对应。
如果纳米孔没有显示线性 IV 曲线，则电导太低或纳米孔的开路电流不稳定。这表明纳米孔没有正确结合，应该重复 piha 洗涤。确保液体位于纳米孔内至关重要。
如果此步骤作不当，通过纳米孔的离子电流将表现出非常大的噪声，并且蛋白质在纳米孔中的分配将急剧减少。首先将纯化的目标蛋白质样品加入腔室的研磨槽中。等待样品完全扩散。
施加极性与所研究蛋白质的总电荷相反的跨膜电位偏压。施加的 200 毫伏电位应足够大，以便观察。大多数蛋白质分析物事件将显示为偏离基线的瞬态电流偏转。
如果未观察到信号，则增加腔室中蛋白质的浓度。更高的电压会提高信噪比和氮化物。纳米孔可以承受几伏特。
蛋白质吸收将表现为 Nanopore 基线电流的长期变化。固态纳米孔的典型结果如下。开孔电流应高度稳定。
纳米孔的 IV 特性应该是高度线性的。在 1 摩尔氯化钾、10 摩尔磷酸钾 pH 7.4 中，与 IV 曲线线性拟合的斜率将提供纳米孔的单一电导。电导与纳米孔径有直接关系，应与方程匹配。
该值应匹配在 30% 以内如果该值太小，则孔隙可能未添加蛋白质。快速事件应该随之而来的蛋白质吸收是一种长期存在的电流下降。一些蛋白质非常不稳定，并在孔内发生结构转变。
在这种情况下，长寿命的电压降将伴随着快速波动。看完这个视频后，你应该对如何使用扫描透射电子显微镜制造固态纳米孔，以及使用那些稳定的 SA 蛋白吸收有了很好的了解。不要忘记，使用食人鱼溶液可能非常危险，执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套在通风橱中工作、穿实验服和防化学围裙。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概览
本文描述了一种使用固态纳米孔监测蛋白质在无机表面上吸附的方法。该技术利用电阻脉冲原理，允许在单分子水平上进行实时观察。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米技术
- 生物物理学
- 蛋白质化学
背景
- 纳米孔是可用于研究分子相互作用的微小孔洞。
- 理解蛋白质吸附对于各种生物学应用至关重要。
- 电阻脉冲原理能够检测单个分子。
- 实时监测提供了对动态过程的洞察。
研究目的
- 开发一种使用固态纳米孔研究蛋白质吸附的方法。
- 在单分子水平上量化吸附过程。
- 确定与蛋白质吸附相关的反应速率常数。
使用的方法
- 在人工膜中创建纳米孔。
- 在氮化物膜中钻纳米孔。
- 将纳米孔加载到含有离子溶液的腔室中。
- 施加电压以观察离子电流，并添加蛋白质进行实验。
主要结果
- 成功实现实时监测蛋白质吸附。
- 定量确定吸附常数。
- 洞察蛋白质与表面相互作用的动力学。
- 展示了纳米孔并联阵列的有效性。
结论
- 该方法为研究蛋白质吸附提供了强大的工具。
- 在单分子水平上的实时监测增强了对吸附动力学的理解。
- 未来的应用可能包括生物物理学和纳米技术的各个领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Solid-state nanopore assays enable direct, label-free monitoring of protein adsorption at the single-molecule level, addressing critical challenges in understanding protein-surface interactions for biopharma R&D. This capability is increasingly vital as device miniaturization amplifies the impact of protein adsorption on microfluidic and analytical platforms. Integrating nanopore-based analytics supports predictive confidence and mechanistic de-risking in early discovery and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein-surface interactions relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports mechanistic de-risking by revealing adsorption dynamics under diverse solution conditions.
- Facilitates functional validation of protein behavior on inorganic and functionalized surfaces.
Screening & Assay Development
- Provides a rapid, quantitative assay for protein binding to nitride and other thin films.
- Delivers reproducible, label-free readouts suitable for standardization across platforms.
- Prepares validated systems for downstream compound screening and analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables exploration of protein stability and adsorption in confined environments relevant to device development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by characterizing protein-material interactions.
- Offers predictive insights into protein behavior in microfluidic and diagnostic systems.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based assay fits within the early discovery to assay development continuum, providing foundational data for lead identification and preclinical device design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of protein-surface interactions.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of protein adsorption for assay readiness.
- Analytics: Provides single-molecule current measurements and adsorption event signatures for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical device development by modeling protein behavior in confined, device-relevant environments.
- Enterprise Reuse: Adaptable to a range of proteins, surfaces, and experimental conditions for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein-material studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible single-molecule assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage risk in device and assay development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein candidates and device platforms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanopore fabrication and single-molecule current analysis.
- Needs access to electron microscopy and patch clamp instrumentation.
- Demands rigorous cleaning and standardization protocols for reproducibility.
- Adaptable to various thin films and functionalized surfaces as supported by nanopore drilling.
- Safety precautions are critical when handling hazardous cleaning reagents.
